綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 水稻轉(zhuǎn)化

生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)技術(shù)水稻愈傷組織誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)GUS基因的鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙螅和ㄟ^(guò)農(nóng)桿菌法將帶有報(bào)告基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入煙草中，誘導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因植株。了解農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的原理，掌握農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和侵染植物的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理

農(nóng)桿菌重組子中攜帶經(jīng)改造的Ti質(zhì)粒（含有幫助T-DNA跳到植物染色體上的Vir區(qū)）和包含T-DNA的雙元載體pBinGUS，質(zhì)粒pBinGUS上T-DNA上插入了報(bào)告基因（GUS）和卡那霉素篩選標(biāo)記基因NPTII。轉(zhuǎn)化是通過(guò)誘導(dǎo)形成愈傷組織，侵染時(shí)農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课唬軅箅p子葉植物分泌的酚類(lèi)化合物透過(guò)農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜，活化vir區(qū)基因，vir區(qū)基因的活化，促使T-DNA進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)移。T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后整合到核DNA上。共培養(yǎng)可使T-DNA上攜帶的編碼抗生素的抗性基因得到表達(dá)，因此，轉(zhuǎn)化了的水稻外植體可在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無(wú)性系，并能接受外源DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。具備條件：（1）高效穩(wěn)定的再生能力（2）較高的遺傳穩(wěn)定性（3）具有穩(wěn)定的外植體來(lái)源（4）對(duì)選擇性抗生素敏感（5）對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性圖4：農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化A.水稻愈傷與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)B.選擇C.分化D.生根E.煉苗和移栽農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻的遺傳轉(zhuǎn)化gus基因簡(jiǎn)介gus基因是目前常用的一種報(bào)告基因，是β－D－葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表達(dá)產(chǎn)物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸

，它可以將5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解為藍(lán)色的物質(zhì),也可以將4-甲基-傘形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解為藍(lán)色物質(zhì)。其檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、穩(wěn)定，且背景活性低。gus基因的最大優(yōu)點(diǎn)是它能測(cè)定外源基因表達(dá)的具體細(xì)胞和組織部位，這是其它報(bào)告基因所不能及的。三、實(shí)驗(yàn)方案與步驟Ⅰ水稻愈傷組織誘導(dǎo)Ⅱ農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化Ⅲ水稻的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化Ⅳ水稻抗性愈傷組織的篩選與分化ⅤGUS基因的染色Ⅰ水稻愈傷組織誘導(dǎo)1.水稻種子消毒：在超凈工作臺(tái)上，取大概40粒去殼、胚完整的水稻種子放入50mL無(wú)菌三角瓶中，用無(wú)菌水洗一遍之后倒掉無(wú)菌水，再倒入75%酒精之后，搖瓶30-60s，用無(wú)菌水再洗一遍后倒掉無(wú)菌水，倒入2%NaClO，不時(shí)攪拌，30min。然后用無(wú)菌水洗3次，每次搖瓶1min，倒掉無(wú)菌水，將種子放入帶無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，分開(kāi)排布，吸干。2.水稻種子接種與觀察將吸干的種子接入YN培養(yǎng)基，注意使胚朝上。每瓶接10粒，每小組5瓶。寫(xiě)上日期、接種人、放入培養(yǎng)室25℃暗培養(yǎng)。1周后調(diào)查計(jì)算污染率，2周后調(diào)查計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。污染率=污染種子數(shù)/總種子數(shù)×100%愈傷組織誘導(dǎo)率=出愈傷種子數(shù)/總種子數(shù)×100%3.水稻愈傷組織的繼代培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)上打開(kāi)培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織（淡黃色，致密呈球狀），置入YYN培養(yǎng)基中，在28℃光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)1周。（如不馬上用于轉(zhuǎn)化，需轉(zhuǎn)移至暗處，于25℃繼續(xù)培養(yǎng)1周）Ⅱ農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3mL的YEB液體培養(yǎng)基（含Rif50mg·L-1）中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；取過(guò)夜培養(yǎng)菌液1mL接種于50mLYEB（Rif50mg·L-1）液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5；取2mL菌液，13000rpm，離心30s,棄上清；加入1000μL20mMCaCl2，使農(nóng)桿菌細(xì)胞充分懸浮，冰浴30min；13000rpm，離心30s，棄上清，置于冰上，加入500μL預(yù)冷的20mMCaCl2，充分懸浮細(xì)胞，冰浴中保存，24h內(nèi)使用，或液氮中速凍1min，置-70℃保存?zhèn)溆谩Ｔ?00μL感受態(tài)細(xì)胞中加入2-6μLpCAMBIA1301質(zhì)粒DNA，冰浴5min，液氮中速凍5min；迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴中，熱激5min；加入1mLYEB液體培養(yǎng)基，28℃慢速振蕩培養(yǎng)2－4h；3000rpm離心4min，去一部分上清，留取200μL菌液涂布于含有50μg·mL-1Kan和50μg·mL-1Rif的YEB平板；放置約0.5h，待水份干后，28℃培養(yǎng)約24h至長(zhǎng)出菌落。Ⅲ水稻的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化在侵染前三天挑取含有GUS基因的農(nóng)桿菌接種到3mLLB液體培養(yǎng)基中（25mg·L-1鏈霉素和50mg·L-1卡那霉素），28℃、200rpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)晚期(18-24h)。利用分光光度計(jì)測(cè)量菌液OD600值大約在0.6左右將1中獲得的菌液按1：100接種到50mL新鮮的NGN液體培養(yǎng)基中（25mg·L-1鏈霉素和50mg·L-1卡那霉素），28℃、200rpm培養(yǎng)至OD值為0.5左右（大約5-6h）。把50mL菌液轉(zhuǎn)入2個(gè)50mL離心管中，4℃、4000g10min，棄上清，加等體積的NGNM+AS培養(yǎng)基重懸菌體。準(zhǔn)備N(xiāo)GN溶液：向50mL離心管中加入40mLNGN,注意：取800μL溶液滴加在GN培養(yǎng)基濾紙上（培養(yǎng)基上鋪一層干凈濾紙）。將水稻愈傷組織浸入準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌中，侵染20min，期間要緩慢搖動(dòng)。將浸染后的菌液倒出廢液缸，用滅菌過(guò)的針管或槍頭把殘余的菌液吸凈，再用濾紙把愈傷組織吸干，置于準(zhǔn)備好的GN培養(yǎng)基上。22℃黑暗培養(yǎng)2d。Ⅳ水稻抗性愈傷組織的篩選與分化將共培養(yǎng)的水稻愈傷組織用無(wú)菌水洗滌6次，用無(wú)菌水+羧卞（500mg·L-1）洗滌2次（洗滌時(shí)要不停的搖晃50mL離心管，每洗滌一次用針管把無(wú)菌水吸出），用無(wú)菌紙吸干后置于工作臺(tái)吹30min。將水稻愈傷組織置于N6D2S固體篩選培養(yǎng)基上，26℃黑暗培養(yǎng)，每2周繼代一次，篩選4周。經(jīng)2次篩選生長(zhǎng)旺盛的抗性水稻愈傷組織轉(zhuǎn)至XFM再生培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)4周以上，每?jī)芍芾^代一次。將經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)的水稻分化苗轉(zhuǎn)至GM培養(yǎng)基上，于三角瓶中生根壯苗。待水稻幼苗長(zhǎng)至10cm左右，打開(kāi)封口膜，煉苗2-3d，將水稻再生苗轉(zhuǎn)至盆缽中。ⅤGUS基因的染色挑取5塊抗性愈傷組織或5個(gè)抗性苗葉片與非轉(zhuǎn)化的對(duì)照放入7mL離心管，加入2mLGUS染色液，然后37℃水浴8h以上觀察水稻愈傷組織或者葉片的顏色，是否有藍(lán)色的斑點(diǎn)出現(xiàn)。染色后的愈傷組織或葉片在離心管中70%酒精脫色24h。體式顯微鏡下觀察水稻轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因組織的顏色，拍照并比較其異同。實(shí)驗(yàn)操作及實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求（一）實(shí)驗(yàn)操作要求1．實(shí)驗(yàn)課前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，熟悉實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、操作步驟以及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)。2．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)謹(jǐn)操作、仔細(xì)觀察、認(rèn)真實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄。3．準(zhǔn)確認(rèn)真完整清楚記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)。4．必須掌握操作步驟和實(shí)驗(yàn)流程后才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（二）實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1．實(shí)驗(yàn)報(bào)告嚴(yán)格按照如下格式和內(nèi)容書(shū)寫(xiě)。實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)實(shí)驗(yàn)人、學(xué)號(hào)、實(shí)驗(yàn)日期實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料方法和步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果（需照相機(jī)拍照）結(jié)果討論和結(jié)論

實(shí)驗(yàn)思考題2．在寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)，實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮響?yīng)按照該次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)步驟寫(xiě)出，要明確具體、有針對(duì)性。實(shí)驗(yàn)材料包括實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)植物或組織、重要的實(shí)驗(yàn)試劑和儀器設(shè)備。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中應(yīng)包括全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察到的現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的圖表要有圖名和表名，圖名位于圖下方，表名位于表格上方。圖表需大小合適、標(biāo)注清楚。圖表內(nèi)容和所包含