第12章 分子發(fā)光分析

第12章分子發(fā)光分析法MolecularLuminescenceAnalysis12-1分子發(fā)光分析概述

在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，分子吸收反應(yīng)釋放出的化學(xué)能而產(chǎn)生激發(fā)態(tài)物質(zhì)，當(dāng)回到基態(tài)時(shí)發(fā)出光輻射，這種分子受化學(xué)能激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象稱(chēng)為化學(xué)發(fā)光。利用化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象建立的分析方法稱(chēng)為化學(xué)發(fā)光分析。2/1/20231InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院1.熒光和磷光的產(chǎn)生1）分子能級(jí)與躍遷

分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜；在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)；

基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位。12-2熒光和磷光分析基本原理2/1/20232InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見(jiàn)能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…；2/1/20233InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2）電子激發(fā)態(tài)的多重度

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；2/1/20234InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院

S0→T1禁阻躍遷；通過(guò)其他途徑進(jìn)入(見(jiàn)能級(jí)圖)；進(jìn)入的幾率小；

2/1/20235InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2）.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛預(yù)無(wú)輻射躍遷2/1/20236InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院

激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大；熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；2/1/20237InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫2/1/20238InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院非輻射能量傳遞過(guò)程

振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-14-10-12s。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級(jí)中,等能級(jí)間的無(wú)輻射能級(jí)交換，時(shí)間10-13-10-11s。

。

2/1/20239InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷,時(shí)間10-6-10-2s。

。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過(guò)自旋—軌道耦合進(jìn)行。2/1/202310InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長(zhǎng)為‘2的熒光；10-7～10-9s。

由圖可見(jiàn)，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)；‘2>2>1；磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（T1→S0躍遷）；電子由S0進(jìn)入T1的可能過(guò)程：（S0→T1禁阻躍遷）2/1/202311InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動(dòng)弛豫→T1發(fā)光速度很慢：10-4～10s。光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。2/1/202312InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2.激發(fā)光譜和發(fā)射光譜1）熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線(xiàn)

固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線(xiàn)（圖中曲線(xiàn)I）。2/1/202313InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院

激發(fā)光譜曲線(xiàn)的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大。2/1/202314InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2）熒光光譜(或磷光光譜)

固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(xiàn)(圖中曲線(xiàn)II或III)。2/1/202315InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2/1/202316InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院3）激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)圖2,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光(如‘2)。2/1/202317InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院c.鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。2/1/202318InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)似；

基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

2/1/202319InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2/1/202320InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜2/1/202321InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院3.熒光效率羅丹明B乙醇溶液的Φ＝0.97,熒光素水溶液Φ＝0.65,菲乙醇溶液Φ＝0.10。一般都在0.10-1之間。2/1/202322InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院4.熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

1）分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。2/1/202323InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2）化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類(lèi)型：*→的熒光效率高，系間跨越過(guò)程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有。2/1/202324InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。2/1/202325InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2/1/202326InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院5.熒光定量分析原理(1)定量依據(jù)熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：

If=2.3I0lc

=Kc2/1/202327InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院（2）環(huán)境對(duì)熒光強(qiáng)度的影響①溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。②溫度的影響

熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。③溶液pH

對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制。2/1/202328InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院④各種散射光的影響

主要有瑞利散射光和拉曼散射光干擾。通過(guò)選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)來(lái)消除。⑤激發(fā)光照射的影響

有的熒光物質(zhì)在激發(fā)光的照射下容易分解，引起熒光強(qiáng)度急劇下降。⑥熒光的猝滅

碰撞猝滅；氧的熄滅作用等。2/1/202329InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院6.熒光定性分析

根據(jù)熒（磷）的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜進(jìn)行化合物的鑒定。2/1/202330InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院1.儀器結(jié)構(gòu)流程

測(cè)量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。

特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。12-3熒光和磷光分析儀器2/1/202331InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院

基本流程如圖：(1)光源：燈和高壓汞燈，染料激光器(可見(jiàn)與紫外區(qū))(2)試樣池：石英材料制成，四面透光。(3)單色器：選擇激發(fā)光波長(zhǎng)的第一單色器和選擇發(fā)射光(測(cè)量)波長(zhǎng)的第二單色器；(4)檢測(cè)器：光電倍增管。2/1/202332InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院磷光檢測(cè)器

熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光。

測(cè)量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開(kāi)。（2）采用脈沖光源和可控檢測(cè)及時(shí)間分辨技術(shù)。室溫測(cè)量時(shí)，不需要杜瓦瓶。2/1/202333InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2/1/202334InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院儀

器

光

路

圖2/1/202335InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院12-4熒光分析法磷光分析法的特點(diǎn)和應(yīng)用1.特點(diǎn)（1）靈敏度高：比紫外-可見(jiàn)分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)。檢測(cè)下限：0.1～0.1g/cm-3；相對(duì)靈敏度：0.05mol/L奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。（2）選擇性強(qiáng)：既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。2/1/202336InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2.熒光分析法和磷光分析法的應(yīng)用（1）痕量分析（2）聯(lián)用技術(shù)的檢測(cè)器（3）分子結(jié)構(gòu)性能的測(cè)定2/1/202337InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院(1)無(wú)機(jī)化合物的分析與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定(2)生物與有機(jī)化合物的分析見(jiàn)表1）熒光分析法的應(yīng)用2/1/202338InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2/1/202339InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2/1/202340InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2）磷光分析法的應(yīng)用1.稠環(huán)芳烴分析

采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測(cè)定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）；見(jiàn)表2.農(nóng)藥、生物堿、植物生長(zhǎng)激素的分析

煙堿、降煙堿、新煙堿，2，4-D等分析檢測(cè)限0.01g/cm-3

3.藥物分析和臨床分析

見(jiàn)表2/1/202341InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2/1/202342InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院2/1/202343InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院12-5化學(xué)發(fā)光分析法

ChemiluminescenceAnalysis化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)，必須滿(mǎn)足兩個(gè)條件：（1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的能量，又能被反應(yīng)產(chǎn)物分子吸收，使之處于激發(fā)態(tài)。（2）處于激發(fā)態(tài)的分子，必須能釋放出光子或能夠?qū)⒛芰哭D(zhuǎn)移給另一個(gè)分子，使該分子激發(fā)并以輻射光子的形式回到基態(tài)。2/1/202344InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院

在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的光。A+B=C+D*D*→D+h（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物；（2）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)E=150～400kJ/mol；位于可見(jiàn)光區(qū)；（3）發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)存在于生物體(螢火蟲(chóng)、海洋發(fā)光生物)中，稱(chēng)生物發(fā)光(bioluminescence)。2/1/202345InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù)

在化學(xué)發(fā)光分析中，被分析物相對(duì)于發(fā)光試劑小得多，對(duì)于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)：

dc/dt=Kc；K為反應(yīng)速率常數(shù)。定性依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強(qiáng)度與被測(cè)物濃度成線(xiàn)性；2/1/202346InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院（2）在一定條件下，曲線(xiàn)下面積為發(fā)光總強(qiáng)度(S)，其與被測(cè)物濃度成線(xiàn)性：液相中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理研究較多，在分析中應(yīng)用最多；可測(cè)痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。2/1/202347InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院

應(yīng)用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率：0.15～0.05；魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過(guò)程：2/1/202348InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院

該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可測(cè)定這些金屬離子。（1）該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可間接測(cè)定這些金屬離子?？蓽y(cè)痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等化學(xué)與生物發(fā)光分析的應(yīng)用2/1/202349InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2通過(guò)測(cè)定生成的H2O2，確定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶（2）可檢測(cè)低至10-9mol/L的H2O2；（3）間接測(cè)定某些生物試樣2/1/202350InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院生物發(fā)光分析應(yīng)用1

在pH7～8；熒光素酶(E)和Mg2+的存在下，熒光素(LH2)與磷酸三腺甙(ATP)的反應(yīng)，生成磷酸腺甙(AMP)熒光素和熒光素酸的復(fù)合物和鎂的焦磷酸鹽(ppi)：ATP+LH2+E+Mg2+

AMP·LH2·E+Mgppi+2H+pH7-8復(fù)合物與氧反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光：2/1/202351InstrumentAnalysis化學(xué)化工學(xué)院

AMP·LH2·E+O2[氧化熒光素]*+AMP+CO2+

H2O[氧化熒光素]*氧化熒光素+h最大發(fā)射波長(zhǎng)562nm。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在細(xì)菌中的黃素酶作用下，在氧化型黃素單核苷酸(FMA)存在下，發(fā)生發(fā)光反應(yīng)：