蛋白質(zhì)的分離

課題3血紅蛋白的提取和分離主要內(nèi)容：一、基礎(chǔ)知識二、實(shí)驗(yàn)操作

蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。二、實(shí)驗(yàn)操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定一、基礎(chǔ)知識---蛋白質(zhì)分離和提取的原理㈠凝膠色譜法（分配色譜法）1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖）2、概念：根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法3、原理：根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。1、概念：2、原理：又稱分配色譜法，是根據(jù)相對分予質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。3、凝膠①性質(zhì)：一些微小的多孔球體，球內(nèi)含許多貫穿的通道；②化學(xué)本質(zhì)：多糖類化合物；③實(shí)例：葡聚糖、瓊脂糖等。一、基礎(chǔ)知識---蛋白質(zhì)分離和提取的原理㈠凝膠色譜法（分配色譜法）4、具體過程當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對（）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（），移動速度（），而（）的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（）移動，路程（），移動速度（），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。相對分子質(zhì)量較小較長較慢相對分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢4、具體過程一、基礎(chǔ)知識---蛋白質(zhì)分離和提取的原理分子量大小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆?，被阻擋在顆粒的外面小于凝膠顆?？障吨睆?，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動方式垂直向下移動垂直向下移動，無規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動速度較快較慢運(yùn)動路徑較短較長洗脫次序先從凝膠柱洗脫出來后從凝膠柱洗脫出來一、基礎(chǔ)知識---蛋白質(zhì)分離和提取的原理1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：2、作用：能夠抵制（）對溶液（）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿pH值3、緩沖溶液的配制通常由（）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（）就可以制得（）使用的緩沖液。1－2使用比例在不同PH范圍內(nèi)思考：說出人體血液中緩沖液。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3磷酸緩沖液，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究其(活性)4、在本課題中使用的緩沖液？（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理：

①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動瓊脂糖凝膠電泳示意圖十二烷基磺酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。測定蛋白質(zhì)分子量。①應(yīng)用:②聚丙烯酰胺凝膠:蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。③原理:4、實(shí)例⑤SDS作用機(jī)理④SDS作用為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入SDS。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。

蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。二、實(shí)驗(yàn)操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定血液血漿水分其他物質(zhì)：血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)1.血液有哪些成分？2.你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？二、實(shí)驗(yàn)操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定知識回顧用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌：血液＋檸檬酸鈉→低速短時(shí)離心→吸出上層血漿→紅細(xì)胞＋5倍體積生理鹽水→緩慢攪拌10min→低速短時(shí)離心→吸出上清液→反復(fù)洗滌直至上清液無黃色二、實(shí)驗(yàn)操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定①紅細(xì)胞的洗滌速度越高和時(shí)間越長會使其它血細(xì)胞等同沉淀達(dá)不到分離的效果。1、洗滌操作過程中，為什么要低速短時(shí)間離心？重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。2、為了使紅細(xì)胞洗滌干凈，需如何處理？3、用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌，能否用蒸餾水或濃度高的氯化鈉溶液？為什么？2、血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯（？）作用下，紅細(xì)胞破裂釋放蒸餾水和甲苯的作用是什么？3、分離血紅蛋白溶液：紅細(xì)胞破碎混合液→中速長時(shí)離心（2000c/min×10min）→濾紙過濾除去脂質(zhì)→分液漏斗分離出血紅蛋白，得到紅色透明液體。第1層（最上層）：（）甲苯層第2層（中上層）：（）的沉淀層，（）色薄層固體第3層（中下層）：

（）的水溶液層（）的液體

第4層（最下層）：其它雜質(zhì)（）的沉淀層無色透明脂溶性物質(zhì)白血紅蛋白紅色透明暗紅色透析過程動畫演示4、透析:裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。透析過程及透析目的？(2)凝膠色譜操作①凝膠色譜柱的制作打孔-挖穴-安管-覆網(wǎng)-插管②凝膠色譜柱的裝填選擇交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍,75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。固定色譜柱－－配凝膠懸液－－裝填色譜柱－－洗滌平衡3、注意點(diǎn)1、凝膠的選擇材料?G代表意義?2、簡單步驟?凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙；裝填凝膠柱時(shí)不得氣泡存在。因?yàn)闅馀輹噥y洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。

裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300mL的20mmol/L的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12h。4、洗滌平衡的溶液是什么？要注意什么？1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果；2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。③樣品的加入和洗脫1)調(diào)節(jié)緩沖液面2)滴加透析樣品吸管吸1mL樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。3)樣品滲入凝膠床加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)。等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。5)收集待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）。正確的加樣操作要注意的問題a、不要觸及破壞凝膠面b、貼壁加樣c、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動4)洗脫小心加入物質(zhì)的量濃度為20mmol／L的磷酸緩沖液(pH為7.0)到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。七、課后思考題凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，相對分子質(zhì)量大的分子通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的空隙時(shí)阻力大，而相對分子質(zhì)量小的分子通過時(shí)阻力小，因此不同分子量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分離。1、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理是怎樣的?讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。3、在血紅蛋白的提取和分離過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？在一定范圍內(nèi)，能對抗外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物（緩沖劑）溶解于水中制得，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液。緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的pH不變。2、什么是緩沖液？它的作用是什么?4、電泳的作用及其原理是什么？許多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下,這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電。在電場的作用下,這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小,形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。5．與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特電?這特點(diǎn)對你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?

血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。6．你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎?（二）凝膠色譜操作---純化1、凝膠色譜柱的制作：二、實(shí)驗(yàn)操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定色譜柱的制作過程：準(zhǔn)備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱2、凝膠色譜柱的裝填步驟操作要求①操作要求色譜柱垂直固定在支架上②計(jì)算稱量凝膠根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量③配制懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹凝膠顆粒＋洗脫液→沸水?、苎b填懸浮液一次性緩慢倒入；輕輕敲打⑤緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h裝配好的凝膠柱3、樣品加入與洗脫---調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)（1）調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。（2）滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。（3）樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。（4）洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。（5）收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）（6）注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。收集得到的純化后的蛋白三、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度。目的：血紅蛋白的取和分離凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定血紅蛋白的提取和離蛋白質(zhì)分子的差異性蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評價(jià)

1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分