第3章 細胞生物學研究方法

第三章細胞生物學研究方法

細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細胞組分的分析方法

細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)1第一節(jié)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)

(Electromicroscopy)

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)

2一、光學顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy

普通復(fù)式光學顯微鏡技術(shù)

熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）3普通復(fù)式光學顯微鏡技術(shù)分辨率（即分辨極限,D）是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離.習慣說的分辨率高則是指該分辨極限?。蝗搜鄣姆直媛剩?00m，光學顯微鏡的最大分別率：0.2m.放大倍數(shù):光學顯微鏡在用空氣作介質(zhì)時,最大放大倍數(shù)為1000倍,用油鏡時為1400倍.45熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）原理與應(yīng)用

直接熒光標記技術(shù)

間接熒光標記技術(shù)（熒光免疫）

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

6789激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)激光共聚焦掃描顯微鏡用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像。經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。圖1圖210laserconfocalscanningmicroscope,LCSM11LCSMImageofaXenopus

Melanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)http:///12用激光共聚焦顯微鏡看到的各種細胞13暗視野顯微鏡

darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野背景是黑的，物體邊緣是亮的?？捎^察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。1415把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處:環(huán)形光闌：位于光源與聚光器之間。相位板：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）由P．Zernike于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎。圖相差顯微鏡16用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標本17不同顯微鏡下細胞18二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)負染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）1932年德國學者MaxKnolls和ErnstRuska用波長比光短得多的電子作光源,發(fā)明了第一臺電子顯微鏡，大大提高了顯微鏡的分辨率，開拓了超微世界。19電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別

分辨本領(lǐng)

光

源

透

鏡

真

空

成像原理

人眼

100m

可見光

光學顯微鏡

0.2m

可見光

(波長400～700nm)

利用樣本對光的吸收形成明暗反差和顏色變化

0.1m

紫外光

玻璃透鏡

不要求真空

電子顯微鏡

接近0.1nm

電子束

(波長0.01～0.9nm)電磁透鏡

1.33×10-5～1.33×10-3Pa

利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差

20電鏡與光鏡光路圖比較光源聚光鏡樣品物鏡目鏡直接成像電源聚光鏡樣品物鏡目鏡熒光屏上觀察圖象電源透鏡透鏡樣品熒光屏上觀察圖象射線掃描器光學顯微鏡透射電鏡掃描電鏡21電子顯微鏡的基本構(gòu)造22透射電子顯微鏡TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM23主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負染色技術(shù)（Negativestaining）圖

染色背景，襯托出樣品的精細結(jié)構(gòu) 冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）技術(shù)示意圖 冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面 的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 電子顯微術(shù)、電子衍射與計算機圖象處理相結(jié)合 而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技 術(shù)相結(jié)合，是當前結(jié)構(gòu)生物學——主要研究生物大分子空間結(jié) 構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實驗手段。24電鏡樣品的制備25負染色技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果，分辨力可達1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria

2627掃描電鏡（SEM）原理與應(yīng)用：

掃描電子顯微鏡于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結(jié)構(gòu)。工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?，再?jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題。圖1圖2圖3圖42829Scanningelectronmicroscope（SEM）30人類血細胞SEM照片圖片來自http:///31酵母32人類精子33三、掃描隧道顯微鏡原理：量子力學中的隧道效應(yīng)特點：（1）分辨本領(lǐng)高，（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，

縱分辨率可達0.001nm）； （2）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作； （3）非破壞性測量樣品的完整外貌。用途：納米生物學研究領(lǐng)域中的重要工具34STMimageofaDNAmolecule35第二節(jié)細胞組分的分析方法

離心分離技術(shù)

細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細胞化學分析技術(shù)36一、離心分離技術(shù)

用途：

離心是研究如細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體等細胞器，以及各種大分子基本手段。一般認為，轉(zhuǎn)速為10000-25000r/min的離心機稱為高速離心機；轉(zhuǎn)速超過25000r/min，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機。目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達80000r/min，離心力超過500Kg。

差速離心密度梯度離心

37（一）、差速離心在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。38（二）、密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。39速度沉降主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的細胞或細胞器分離。40二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量。411.Schiff反應(yīng)：分子中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)樽霞t色。這種反應(yīng)通常用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）.DNA的福爾根反應(yīng)2.脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。3.茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。4.金屬沉淀法：利用金屬化合物在反應(yīng)過程中生成有色沉淀，借以辨認所檢查的物質(zhì)或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。4243三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術(shù)：根據(jù)免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，并標上標記熒光素，對抗原進行定位測定的技術(shù)?？焖?、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。蛋白電泳(SDS）與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)免疫電鏡技術(shù)：能有效提高樣品的分辨率，在超微結(jié)構(gòu)水平上研究特異蛋白抗原的定位。免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標技術(shù)免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等44四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性光鏡水平的原位雜交技術(shù):同位素標記或熒光素標記的探針電鏡水平的原位雜交技術(shù):生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結(jié)合PCR技術(shù)聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）在體外將目標DNA大量擴增,以便分析.

45人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片46六．定量細胞化學分析技術(shù)

流式細胞儀（FlowCytometry）主要應(yīng)用：用于定量測定細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量； 從細胞群體中分離某些特異染色的細胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

47其主要工作原理是：經(jīng)熒光染色的單細胞懸液被高壓壓入流動室內(nèi)，在PBS或生理鹽水等殼液(SheathFluid)的包裹和推動下形成單細胞狀態(tài)，并以每分鐘5000—10000個細胞的高速度從流動室內(nèi)噴出。在與細胞束呈90°角的方向，受到來自氬離子激光器的激光束照射而激發(fā)熒光。通過各種物鏡及濾光片將從不同角度收集的熒光投射到光電倍管并轉(zhuǎn)換為各種強弱不等的電脈沖信號顯示出來。這些信號輸?shù)诫娮佑嬎銠C中貯存，經(jīng)處理和分析便可得到多種信息參數(shù)。進行細胞分類時，根據(jù)需要對含細胞的水滴選擇性充電，在帶有高電壓的偏轉(zhuǎn)板作用下，帶正電荷的水滴落入左方收集管內(nèi)，帶負電荷的水滴落入右方收集管內(nèi)，不帶電荷的水滴進入中間的收集管。分類主要根據(jù)細胞的熒光強度，即單細胞DNA含量。圖48流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)49細胞顯微分光光度術(shù)

原理：細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。例如，核酸的吸收波長為260nm，而蛋白質(zhì)的則為280nm。有的成分經(jīng)組織化學染色后，對可見光有特定的吸收光譜。

應(yīng)用：根據(jù)細胞成分所具有的這種特性，可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性，甚至定量測定。

50第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)

細胞的培養(yǎng)

細胞工程51一、細胞的培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng)

類型：原代培養(yǎng)細胞

繼代培養(yǎng)細胞

細胞株

細胞系

植物細胞

類型： 原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細胞培養(yǎng)）

單倍體細胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）非細胞體系52原代培養(yǎng)（primaryculture）：也叫初代培養(yǎng)，指直接從體內(nèi)取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進行傳代培養(yǎng)（subculture）的細胞，便不再稱為原代培養(yǎng)，而改稱為細胞系。傳代（passage）：將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞的“一代”，不表示細胞分裂一次，而是指培養(yǎng)細胞從接種到再次轉(zhuǎn)移培養(yǎng)的過程。在一次傳代培養(yǎng)中，細胞能倍增3-6次。53細胞系（cellline）：原代培養(yǎng)物成功傳代后，則稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（finitecellline）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系（infinitecellline）。無限細胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞系。無限細胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性。細胞株（cellstrain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標志物稱為細胞株。細胞株的特殊性質(zhì)或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株（substrain）。54Hela細胞（左）、CHO細胞（右）的培養(yǎng)55

二、細胞工程細胞融合與細胞雜交技術(shù)圖單克隆抗體（monocloneantibody）技術(shù)圖細胞拆合與顯微操作技術(shù)物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)