第6章分子熒光與磷光

第六

講

分子熒光與磷光法CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU1.分子熒光、磷光分析法的基本原理2.熒光分析儀器3.分子熒光定量分析4.熒光的影響因素，分子熒光的分析應(yīng)用CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU基態(tài)激發(fā)態(tài)CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU傳遞途徑輻射躍遷無輻射躍遷熒光延遲熒光磷光振動弛豫內(nèi)部轉(zhuǎn)移系間竄躍外部轉(zhuǎn)移分子中電子受激躍遷到激發(fā)態(tài)后，處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，去激返回到較低激發(fā)態(tài)或基態(tài)時有兩種方式：無輻射去激和輻射去激.CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU1.分子熒光、磷光分析法的基本原理分子吸收光能被激發(fā)，回到基態(tài)所產(chǎn)生的發(fā)光為光致發(fā)光激發(fā)光1.1.光致發(fā)光的機理基態(tài)激發(fā)態(tài)熒光或磷光CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU通常具有不飽和基團(tuán)的基態(tài)分子光照后，一個價電子躍遷，躍遷到激發(fā)態(tài)1.2.分子熒光光譜的產(chǎn)生基態(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)單重態(tài)S1單重態(tài)分子具有抗磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-8sn2S+1LJ光譜項中2S+1=1CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZUS0振動馳豫（VR）—同一電子能級中，從較高振動能級到較低振動能級的過程內(nèi)部轉(zhuǎn)換IC—相同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-S吸光吸光S0S1S2CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZUS0吸光吸光S0S1S2（1）熒光譜圖中包含：激發(fā)（ex）和發(fā)射（em）光譜（2）分子熒光是帶狀光譜CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU（3）.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

a.Stokes位移

一般情況下，熒>激激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如‘2)。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZUT1S0振動馳豫（VR）—同一電子能級中，從較高振動能級到較低振動能級的過程內(nèi)部轉(zhuǎn)換IC—相同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-S吸光吸光S0S1S2系間竄躍（ISC）—不同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換S-T1.3.分子磷光光譜的產(chǎn)生CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU基態(tài)單重態(tài)S0激發(fā)態(tài)單重態(tài)S1S2……激發(fā)態(tài)單重態(tài)T1（1）若分子中電子躍遷過程中伴隨著自旋方向的改變，由單重態(tài)→三重態(tài)，凈自旋0。這種躍遷為禁阻躍遷（2）三重態(tài)分子具有順磁性，激發(fā)態(tài)的平均壽命約為10-4~10S產(chǎn)生磷光的物質(zhì)較少磷光強度弱提高檢測限CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZUT1S0VRICS0S1S2ISC（3）三重態(tài)能量低于單重態(tài).λ激發(fā)<λ熒光<λ磷光CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2.熒光（磷光）分析儀器CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2.1熒光分析儀器

測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。

特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角?；玖鞒倘鐖D：單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器；光源：燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū))檢測器：光電倍增管。2.熒光（磷光）分析儀器CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU儀

器

光

路

圖CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU儀器框圖該型儀器可進(jìn)行熒光、磷光和發(fā)光分析；CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2.1.1.光源激發(fā)光源一般要求比吸收測量中的光源有更大的發(fā)射強度；適用波長范圍寬熒光計中，常使用鹵鎢燈作光源熒光光度計中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強的連續(xù)光源CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU熒光計用濾光片作單色器，熒光計只能用于定量分析，不能獲得光譜。大多數(shù)熒光光度計一般采用兩個光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜。第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長

ex

，用此激發(fā)光

ex激發(fā)液池內(nèi)的熒光物質(zhì)。（VB2ex為471nm）第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來選擇測定用的熒光波長

em。在選定的

em

下測定熒光強度，定量分析。（VB2

em為525nm）2.1.2.單色器471nm525nm如測VB2CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU盛放測定溶液.通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊2.1.3.樣品池把光信號轉(zhuǎn)化成電信號,放大,直接轉(zhuǎn)成熒光強度熒光的強度一般較弱，要求檢測器有較高的靈敏度，熒光光度計采用光電倍增管。2.1.4、檢測器CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2.2.激發(fā)光譜和熒光光譜獲得

Iex激發(fā)光譜固定em

熒光波長獲得方法：先把第二單色器的波長固定，使測定的em不變，改變第一單色器波長，從200~700nm

掃描，讓不同波長的光照在熒光物質(zhì)上，測定它的熒光強度，以I為縱坐標(biāo)，ex為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜從曲線上找出ex，實際上選波長較長的高波長峰激發(fā)光譜是在固定熒光波長下，測量熒光體的熒光強度隨激發(fā)波長變化的光譜。550nmCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU異常現(xiàn)象

Iex激發(fā)光譜固定em

熒光波長550nm550nm275nmCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU熒光光譜固定ex激發(fā)光波長獲得方法：先把第一單色器的波長固定，使激發(fā)的ex不變，改變第二單色器波長，讓不同波長的光掃描，測定它的發(fā)光強度，以I為縱坐標(biāo)，em為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜。從曲線上找出最大的em471nm熒光強度波長（nm)300400500Iλλfl,maxCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU熒光光譜固定ex激發(fā)光波長471nm熒光強度波長（nm)300400500Iλλfl,max471nmCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU激發(fā)光譜和熒光光譜熒光強度波長（nm)300400500硫酸奎寧的兩個光譜Iλλex,maxλfl,maxCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2.3磷光分析儀器熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進(jìn)行測量。在有熒光發(fā)射的同時測量磷光。

測量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。（2）采用脈沖光源和可控檢測及時間分辨技術(shù)。室溫測量時，不需要杜瓦瓶。CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU光源單色器樣品池檢測器光源單色器1樣品池單色器2檢測器定量關(guān)系不同（1）同一種光強度的吸收，（2）另一種光的強度儀器光路不同（1）直線，（2）一定的角度熒光法有更優(yōu)的檢測性能CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU光源單色器1樣品池單色器2檢測器光源單色器1樣品池單色器2檢測器磷光的激發(fā)與發(fā)射的檢測不同時磷光法可避免激發(fā)背京的干擾，有更優(yōu)的檢測性能CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU溶液的熒光強度(If)與溶液吸收的光強度(Ia)及熒光量子產(chǎn)率(Фf）有如下關(guān)系

If=f

Ia

由Lambert-beer定律及吸收光強度的概念，可推導(dǎo)出，當(dāng)bc≤0.05時，有：

If=2.303fI0

bc

與熒光類似，溶液的磷光強度(IP)與低濃度下磷光物質(zhì)濃度之間的關(guān)系可表示如下：

IP=2.303ST

PI0bc

3.分子熒光（磷光）定量分析CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU定量分析依據(jù)If=Kc

Ip=Kc1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法——最常用的定量分析方法將已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試樣在相同條件下處理，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)液，測定它們的相對發(fā)光強度。以相對熒光強度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)濃度c1c2c3c4c5

cx熒光強度If1If2If3If4If5

IfxIf

IfxcxcCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU2)比較法——較簡單如果試樣數(shù)量不多，可用比較法進(jìn)行測量配一標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為cs，cs與未知液濃度cx相近，并在相同條件下測定它們的熒光強度未知液If

x=Kcx

標(biāo)準(zhǔn)液If

s=Kcs比較CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU3)多組分混合物的熒光分析(1)如果兩組分的熒光峰相互不干擾,可直接測定可分別在各自的熒波長處測定,求出它們的含量(2)如果兩組分的熒光峰相互干擾,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)別,在某一激發(fā)光下一個組分產(chǎn)生熒光峰,另一組分不產(chǎn)生熒光;可選用不同的激發(fā)光進(jìn)行測定CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU(3)如果兩組分的熒光光譜和激發(fā)光譜相互干擾利用熒光強度的加和性（If=If1+If2+If3+…），在適宜的熒光波長處測定，用聯(lián)立方程來求解例：硫胺熒CT

ex=385nm

em=435nm

吡啶硫胺熒CP

ex=410nm

em=480nm相互干擾熒光光譜重疊在385nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測熒光強度,或410nm下激發(fā)在435和480nm下分別測熒光強度,CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU在385nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測熒光強度If=Kc——K:純物質(zhì)在選定波長下測If,求K或410nm激發(fā)，在435和480nm下分別測熒光強度If435/385=26339104cT+210104cPIf480/385=9685104cT+1022104cPIf480/410=2816104cT+1709104cPIf435/410=6419104cT+252104cP硫胺熒濃度吡啶硫胺熒濃度CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU4.熒光的影響因素，分子熒光的分析應(yīng)用CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU

大多數(shù)熒光物質(zhì)首先吸收紫外可見光,產(chǎn)生*，n*躍遷激發(fā)，經(jīng)過非輻射躍遷，再發(fā)生*,*n躍遷產(chǎn)生熒光。

*與n*躍遷相比，摩爾吸收系數(shù)大102~103倍，壽命短。

*躍遷常產(chǎn)生較強的熒光，n*躍遷產(chǎn)生的熒光弱，但可產(chǎn)生系間竄躍，產(chǎn)生更強的磷光。4.1.躍遷類型CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生熒光;環(huán)越多，共軛程度越大，產(chǎn)生熒光波長越長，發(fā)射的熒光強度越強

f

ex/nm

em/nm

0.11205278苯

0.29286310萘0.46365400蒽

350菲線狀環(huán)結(jié)構(gòu)比非線狀結(jié)構(gòu)的熒光波長長4.2.共軛效應(yīng)——有較強的熒光CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光。多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測定例：3，4-苯并芘——是強致癌物ex=386nm

em=430nmCollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU4.3.剛性平面結(jié)構(gòu)—較穩(wěn)定的平面結(jié)構(gòu)具有強熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu)熒光素：氧橋把兩個環(huán)固定在一個平面上，具有平面結(jié)構(gòu)，強熒光物質(zhì)酚酞：無氧橋把兩個環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU例1，2-二苯乙烯反式：平面構(gòu)型強熒光體順式：非平面構(gòu)型非熒光體CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU4.4.取代基效應(yīng)——取代基對熒光物質(zhì)的熒光特征和強度也有很大影響。分成三類：（1）增強熒光的取代基

——有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團(tuán)。由于基團(tuán)的n電子（孤對電子）的電子云與苯環(huán)上的軌道平行，共享了共軛電子，擴(kuò)大了共軛體系，使熒光波長長移，熒光強度增強。CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU（2）減弱熒光的取代基

——-COOH、-NO2

、-COOR、-NO、-SH吸電子基團(tuán),使熒光波長短移，熒光強度減弱芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強，磷光增強，熒光減弱。其熒光強度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應(yīng)增強，這種效應(yīng)為重原子效應(yīng)。（3）影響不明顯的取代基

——-NH3+、-R、SO3H等取代基的空間位阻對熒光也有影響，熒光減弱CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU4.5.電子躍遷類型含N、O、S雜原子的不飽和有機物，如喹啉和芳酮類物質(zhì)都含有未鍵合的孤對n電子，電子躍遷多為n*，系間竄躍強烈，熒光很弱或不發(fā)熒光。不含N、O、S雜原子的有機熒光體多發(fā)生*類型的躍遷，摩爾吸收系數(shù)大，約為104，熒光強。CollegeofChemistry&ChemicalEngineering,YZU4.6.金屬螯合物的熒光大多數(shù)無機鹽類金屬離子，不能產(chǎn)生熒光，但某些螯合物都能產(chǎn)生很強的熒光，可用于痕量金屬離子的測定。