細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-步驟集

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

——步驟集PEG促細(xì)胞融合法的步驟（1）取雞血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混勻后制懸液。（可在4℃保存）（2）取(1)1ml+4ml0.85%的NaCl溶液，進(jìn)行以下三次離心處理：①.1200r/min離心5分鐘。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液）②.1000~1200r/min離心5分鐘。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液）③.1000~1200r/min離心7分鐘。（3）將上步最后一次的沉降血球（去上清液后，約0.1~0.2ml），加入GKN液至1~2ml，使之成10%的細(xì)胞懸液。（4）取上述10%的血球懸液1ml，加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000個(gè)，即。（5）?。?）1ml+0.5ml50%的PEG液，或?。?）0.5ml+0.5ml50%的PEG液，或?。?）0.5ml+1.0ml50%的PEG液，混勻滴片，在常溫下2~3分鐘后，鏡下觀察。【細(xì)胞凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)步驟】1.取土豆去皮塊莖2克，加10mlPBS緩沖液，浸泡24小時(shí)，浸出的粗體液中即含有可溶性土豆凝集素。2.抽取兔子靜脈血（加抗凝劑）1ml，加生理鹽水3ml，在1000r/min條件下，離心5分鐘。重復(fù)三次離心，最后按壓積紅細(xì)胞體積用生理鹽水配成1%的紅細(xì)胞懸液。3．分別用滴管吸取土豆凝集素和1%的紅細(xì)胞懸液各一滴，置雙凹片的左孔內(nèi)，充分混勻。4．同時(shí)分別用滴管吸取PBS緩沖液和1%的紅細(xì)胞懸液各一滴，置雙凹片右孔內(nèi)，充分混勻，作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。5.搖晃5-10分鐘后，觀察有無(wú)發(fā)生細(xì)胞凝集并置顯微鏡下觀察。

實(shí)驗(yàn)步驟—蘇丹Ⅲ染色法斷頭法處死小鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，用鑷提起小腸將蓋玻片緊貼于腸系膜，并在其下部置一載玻片，用剪連同蓋玻片和其上粘的腸系膜取下，滴加甲醛鈣于有標(biāo)本的載玻片處，使標(biāo)本潤(rùn)濕，固定20分鐘。吸蒸餾水滴入載玻片與蓋玻片之間沖洗，用滴管不斷吸去液體以去除固定液。用70%乙醇溶液代替蒸餾水重復(fù)步驟2的操作，再進(jìn)行一次沖洗。用蘇丹Ⅲ染色30分鐘。吸去溢出染液，擦凈蓋玻片表面及周邊，顯微鏡觀察。

原代細(xì)胞(脾細(xì)胞）培養(yǎng)步驟1.取材：取小白鼠一只，采用斷頭法處死；清水洗小鼠并浸于75%酒精中滅菌3分鐘。取出轉(zhuǎn)入超凈潔凈臺(tái)內(nèi)的解剖盤內(nèi)，無(wú)菌操作打開腹腔。取出脾臟，去除其周圍的脂肪組織，鑷起脾臟用PBS液自上而下沖洗1—2次。轉(zhuǎn)入無(wú)菌玻璃培養(yǎng)皿中，待用。2．分離脾細(xì)胞：用滴管先向上述無(wú)菌玻璃培養(yǎng)皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型針頭注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后將其沿脾長(zhǎng)軸方向注射入脾內(nèi)（使脾臟膨脹以利于細(xì)胞散開）。用針尖在脾臟上扎眼，并用“L”針頭輕刮脾臟表面擠出脾細(xì)胞，用滴管吸皿中的PBS液沖脾臟并吹散刮出的脾細(xì)胞，稍傾斜并靜置1～2分鐘。吸取上述靜置后的脾細(xì)胞懸液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000轉(zhuǎn)/分離心1～2分鐘。3．培養(yǎng)脾細(xì)胞：超凈潔凈臺(tái)中取塑料培養(yǎng)皿一個(gè)，用“槍（1ml）”加入細(xì)胞培養(yǎng)液2ml，并在皿蓋上畫上標(biāo)記，待用。取上述離心后的Eppendorf管，在超凈潔凈臺(tái)內(nèi)開蓋棄去上清液，用“槍（200μl）”吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ml加入棄去上清液的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細(xì)胞，然后吸取200ml脾細(xì)胞懸液接種于上述塑料培養(yǎng)皿中，混勻，然后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生死狀態(tài)的鑒別——臺(tái)盼藍(lán)（TrypanBlue）法（1）試劑配制：用生理鹽水配制0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，備用。（2）細(xì)胞懸液制備：將生長(zhǎng)有貼壁型細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（皿）中的培養(yǎng)液倒入干凈試管中，向培養(yǎng)瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液l～2ml,靜置3～5min，待見到細(xì)胞變圓，彼此不連接為止，棄去混合消化液并將上述試管中的培養(yǎng)液倒回培養(yǎng)瓶中，用滴管輕輕吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。（3）染色制片：取0.5ml細(xì)胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合，2min后制成臨時(shí)裝片，鏡檢。（4）染色結(jié)果：死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色?；蛘撸?（3）染色計(jì)數(shù)：取0.5ml細(xì)胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合2～5min，滴加少許染色后的細(xì)胞懸液于放有蓋片的血球計(jì)數(shù)板的斜面上，使懸液自然充滿計(jì)數(shù)板小室。注意不要使小室內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，否則要重新滴加。在普通光鏡10X物鏡下計(jì)數(shù)四個(gè)大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線者數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。（4）根據(jù)染色結(jié)果計(jì)算活細(xì)胞率：依據(jù)死細(xì)胞染成藍(lán)色、活細(xì)胞不著色的原則計(jì)數(shù)死細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，以如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

II.伊紅Y（EosinY）法（1）試劑配制：用生理鹽水配制0.15%伊紅染液，備用。（2）細(xì)胞懸液制備：將生長(zhǎng)有懸浮型細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（皿）稍微傾斜，用滴管輕輕吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。（3）染色制片：取上述細(xì)胞懸液少許，然后加入其等體積量的0.15%伊紅染液，混合，2min后制成臨時(shí)裝片，鏡檢或計(jì)數(shù)。（4）染色結(jié)果：死細(xì)胞染成桃紅色，活細(xì)胞不著色。III.美藍(lán)（MethvleneBlue）染色法（1）試劑配制：用蒸餾水配制0.1%美藍(lán)染液，備用。（2）染色制片：在干凈的載玻片中央加一小滴0.1%美藍(lán)染色液，然后再加一小滴酵母菌懸液，混合均勻，染色3～5分鐘后從液滴側(cè)面蓋上蓋玻片并吸去溢出的液體，制成水浸標(biāo)本片，鏡檢或計(jì)數(shù)。（3）染色結(jié)果：死酵母菌細(xì)胞染成藍(lán)色或淡藍(lán)色，活酵母菌細(xì)胞不著色。細(xì)胞生死狀態(tài)的鑒別

a.平面圖(中間平臺(tái)分為兩半，各刻有一個(gè)方格網(wǎng))b.側(cè)面圖(中間平臺(tái)與蓋玻片之間有高度為0.1毫米的間隙)

使用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)時(shí)，先要測(cè)定每個(gè)小方格(或中方格)中的細(xì)胞數(shù)量，再換算成每毫升液體中細(xì)胞的數(shù)量。每毫升液體中細(xì)胞的數(shù)===每個(gè)大方格中的細(xì)胞數(shù)量╳10000╳稀釋倍數(shù)葉綠體分離的步驟1.選取新鮮嫩濾菠菜葉,去葉梗及粗脈,洗凈擦干，稱30克放于150ml0.35M.Nacl溶液中；2.將葉、液同裝入組織搗碎機(jī)中，勻漿3–5分鐘，轉(zhuǎn)速5000r/min；3.將勻漿用紗布(6層)過(guò)濾于500ml燒杯中；4.取濾液4ml在1000r/min下離心2min；5.取上層清液在3000r/min下離心5(沉淀為葉綠體和細(xì)胞核混合物)；6.將沉淀用2-3ml0.35Mnacl液懸浮；7.取一滴懸液滴片，加蓋片后顯微鏡下觀察；8.另取一滴懸液滴片，再滴加一滴0.01%的吖啶橙染料，混勻，蓋上蓋片，在熒光顯微鏡下觀察。

小白鼠肝細(xì)胞線粒體超活染色的步驟

1、用斷頭法處死小白鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，取小白鼠肝組織，選取邊緣較薄的肝組織0.5cm3，放入小燒杯中，用Ringer液沖洗去血污。

2、在干凈的凹面載玻片的凹穴中,滴加1/5000詹納斯綠B溶液，再將肝組織塊移入染液中，注意不可將組織塊完全淹沒(méi)，要使組織塊上面部分半露在染液外，這樣細(xì)胞內(nèi)的線粒體酶系可充分得到氧化，易被染色。當(dāng)組織塊邊緣被染成藍(lán)綠色即成(—般需染20～30min)。

3、吸去染液，用眼科剪將組織塊著色部分剪下重置小燒杯中，滴加

Ringer溶液0.5ml，用剪刀充分剪碎制懸液。

4、取上述細(xì)胞懸液滴片，加蓋玻片，高倍鏡下觀察。結(jié)果：肝細(xì)胞質(zhì)中的線粒體被染成藍(lán)綠色（黃綠色）。小白鼠染色體標(biāo)本制作步驟

取雄性小鼠以每克體重4μｇ注射秋水仙素，經(jīng)14～16小時(shí)后，斷頭法殺死小鼠，取出睪丸用生理鹽水（0.9%的NaCl）洗去血污。放入裝有1ml0.3%KCl液的小燒杯中剪碎至呈乳白色。用銅網(wǎng)過(guò)濾到刻度離心管中，再加0.3%KCl液至4ml。37℃靜置30分鐘，進(jìn)行低滲處理。以800～1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘。棄上清液，加入2ml甲醇·冰醋酸固定液（3：1），并用吸管至管底吹氣，輕輕打散細(xì)胞，固定8分鐘。再以800～1000轉(zhuǎn)/分離心8分鐘。棄上清液，加1ml固定液，再制成細(xì)胞懸液，固定5分鐘。取潔凈的低溫預(yù)冷載片，距載片10～15cm高度滴下2～3滴細(xì)胞懸液，從載片一邊向另一邊輕輕吹氣，并同時(shí)輕輕敲打載片，以使細(xì)胞均勻分布和促使染色體展開。用濾紙擦去載片上多余液體，空氣干燥或成文火干燥。染色體標(biāo)本染色與觀察用Giemsa染色20～30分鐘，細(xì)水沖洗玻片背面，去多余染液，氣干。鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，高倍鏡或油鏡下觀察染色體形態(tài)并計(jì)數(shù)。人外周血染色體標(biāo)本制備

(一)細(xì)胞培養(yǎng)

1．培養(yǎng)基的配制：

在超凈工作臺(tái)中，100ml培養(yǎng)基含以下成分和比例：

RPMI-1640

84ml

小牛血清

15ml

PHA

3支

肝素鈉

1ml

卡那霉素

終濃度為100單位/ml

以5%NaHCO3(無(wú)菌)或1NHCl調(diào)pH至7.2-7.4。

用刻度吸管將培養(yǎng)液分裝入培養(yǎng)瓶(10ml/瓶)，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2．采血：酒精消毒皮膚，肘靜脈采血0.3-0.5ml，立刻將注射針直接穿過(guò)培養(yǎng)瓶的橡膠塞，向10ml培養(yǎng)基中注入30-40滴全血，輕搖勻后置37℃恒溫箱培養(yǎng)。

3．培養(yǎng)：時(shí)間為68小時(shí)。培養(yǎng)期間，定期輕搖勻，使細(xì)胞充分接觸培養(yǎng)基。

4．秋水仙素處理：終止培養(yǎng)前2-4小時(shí)，在培養(yǎng)液中加入秋水仙堿(用1ml注射器5號(hào)針尖滴加2滴，使終濃度為0.07μg/ml)。

以上步驟均需無(wú)菌操作。

(二)染色體制備

1．收集細(xì)胞：將培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入潔凈離心管中，以1000rpm離心8-10分鐘，棄上清液。

2．低滲處理：向刻度離心管中加入預(yù)溫37℃的低滲液8ml，用滴管混勻，置37℃恒溫水浴中低滲15-25分鐘。

3．預(yù)固定：低滲后加入0.5mlCarnoy’s固定液，輕輕混勻后1000rpm離心8-10分鐘。

4．一固定：棄上清液，加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20分鐘。1000rpm離心，棄上清液。

5．二固定、三固定：同一固定。

6．制懸液：棄上清液后，視細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細(xì)胞懸液。

7．滴片：吸取細(xì)胞懸液自10-20cm高滴在一張干燥潔凈的載玻片上，輕吹散，氣干。

8．染色：1:10Giemsa染色5-10分鐘，細(xì)水洗去多余染液，氣干。

9．鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，油鏡下觀察染色體形態(tài)并計(jì)數(shù)。

染色體組型實(shí)驗(yàn)的步驟1.選擇染色體清晰的照相底片，用放大機(jī)制作出放大10倍的清晰照片。2.將染色體逐一剪下，并對(duì)每個(gè)中期染色體逐一進(jìn)行測(cè)量，包括每條染色體的長(zhǎng)度和每個(gè)臂的長(zhǎng)度。3.根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)，計(jì)算出每對(duì)染色體平均的相對(duì)長(zhǎng)度、臂指數(shù)與著絲粒指數(shù)。4.把相對(duì)長(zhǎng)度與臂指數(shù)相近者配成一對(duì)。5.參照相對(duì)長(zhǎng)度、臂指數(shù)與著絲粒指數(shù)的數(shù)值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)順序，編排出染色體組型圖。6.用膠水或漿糊將每條染色體依照標(biāo)準(zhǔn)順序粘貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙上。人類體細(xì)胞染色體的分類標(biāo)準(zhǔn)及其主要特征

小鼠的轉(zhuǎn)基因技術(shù)錄像Procedure1.Dissectionofoviducts.Recoveryoffertilizedeggs.Removalofcumuluscells.Procedure2.Recoveryof8-cellembryos.Removalofthezonapellucida.Constructionofaggregationchimeras.Procedure3.Dissectionofuteri.Recoveryofblastocycsts.Procedure4.DNAinjectionintopronucleitoproducetransgenicembryos.Procedure5.Nucleartransfer.Procedure6.Blastocystinjectionofembryonicstemcells.Procedure7.Vasectomizingmalemice.Procedure8.Oviducttransferofmanipulatedembryos.Procedure9.Vterinetransferofmanipulatedembryos.Procerdure10.Recoveryof6.5and7.5dayembryos.P