酶工程-02-微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

酶工程

EnzymeEngineering第二課微生物發(fā)酵產(chǎn)酶TheProductionofEnzymebyFermentationofMicroorganism微生物發(fā)酵產(chǎn)酶概述酶的發(fā)酵生產(chǎn)經(jīng)預(yù)先設(shè)計，通過人工操作控制，利用細(xì)胞的生命活動，獲得人們所需的酶的過程前提——選育到性能優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物生產(chǎn)方式固體培養(yǎng)——霉菌液體深層發(fā)酵——現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的主要方式固定化培養(yǎng)——固定化細(xì)胞、固定化原生質(zhì)體微生物發(fā)酵產(chǎn)酶本章主要內(nèi)容微生物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)產(chǎn)酶微生物的特點以及酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物發(fā)酵工藝條件及控制酶發(fā)酵動力學(xué)概述固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶固定化原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的基本理論酶是蛋白質(zhì)——如何獲得蛋白？——蛋白生物合成從基因到蛋白質(zhì)：遺傳信息的傳遞——中心法則要生物合成一個酶，首先應(yīng)知道這個酶對應(yīng)的基因生成的多肽鏈必須經(jīng)過正確的加工修飾，并正確折疊，才能生成有活性的酶轉(zhuǎn)錄和翻譯中的生物調(diào)節(jié)作用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的過程RNA的合成——轉(zhuǎn)錄以DNA為模板，以核苷三磷酸（dNTP）為底物，在RNA聚合酶作用下，生成RNA的過程起始延伸終止轉(zhuǎn)錄后修飾：切除非編碼區(qū)，堿基修飾，獲得成熟的mRNA微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的過程肽鏈的合成——翻譯以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA、酶和輔助因子，合成多肽鏈的過程氨基酸活化生成氨酰-tRNA肽鏈合成起始微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的過程肽鏈的合成——翻譯肽鏈延伸肽鏈合成的終止肽鏈翻譯后加工Met/fMet切除—S—S—肽鏈折疊……微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的調(diào)節(jié)組成型酶（constitutiveenzyme）在細(xì)胞中的量比較恒定，環(huán)境因素對這類酶的合成速率影響不大適應(yīng)型酶（adaptiveenzyme）在細(xì)胞中含量變化很大，其合成速率受環(huán)境因素影響顯著在所有的生物中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)控制（基因的調(diào)節(jié)控制）對酶的生物合成至關(guān)重要原核生物中酶生物合成的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的調(diào)節(jié)——轉(zhuǎn)錄水平操縱子學(xué)說（operontheory）與生物合成相關(guān)的四個基因調(diào)節(jié)基因(regulatorgene)啟動基因(promotergene)操縱基因(operatorgene)結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)調(diào)節(jié)的主要原理調(diào)節(jié)基因阻遏蛋白結(jié)合效應(yīng)物結(jié)構(gòu)變化親和力變化阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，產(chǎn)生空間排斥作用，妨礙RNA聚合酶與啟動基因結(jié)合，阻礙RNA的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)物結(jié)合阻遏蛋白之后，阻遏蛋白結(jié)構(gòu)改變，不能結(jié)合操縱基因，RNA聚合酶可以結(jié)合啟動位點，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的調(diào)節(jié)

——轉(zhuǎn)錄水平操縱子學(xué)說——啟動基因的兩個位點(1)RNA聚合酶結(jié)合位點(2)cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合位點

只有cAMP-CAP復(fù)合物到達(dá)啟動基因位點時，RNA聚合酶才能順利結(jié)合到相應(yīng)位點，開始轉(zhuǎn)錄。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的調(diào)節(jié)——轉(zhuǎn)錄水平操縱子學(xué)說（operontheory）操縱子——結(jié)構(gòu)基因+操縱基因+啟動基因誘導(dǎo)型操縱子（inducibleoperon）誘導(dǎo)物激發(fā)基因大量表達(dá)乳糖操縱子（Lacoperon）阻遏型操縱子（repressibleoperon）阻遏物妨礙基因的正常表達(dá)色氨酸操縱子（Trpoperon）微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的調(diào)節(jié)——轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)模式1：分解代謝物阻遏作用某些物質(zhì)（容易利用的碳源）經(jīng)過分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏了某些誘導(dǎo)酶生物合成的現(xiàn)象連鎖效應(yīng)實質(zhì)——cAMP通過啟動基因調(diào)控酶的合成解決——添加cAMP，控制易用碳源的用量微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的調(diào)節(jié)

——轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)模式2：誘導(dǎo)作用加入某些物質(zhì)（誘導(dǎo)物）使酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的現(xiàn)象。誘導(dǎo)物（inducer）酶催化作用的底物或其底物類似物微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的調(diào)節(jié)

——轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)模式3：反饋阻遏作用即產(chǎn)物阻遏，是指酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到阻遏的現(xiàn)象阻遏物（repressor）一般是酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物阻遏物+阻遏蛋白O基因微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的模式（重點）微生物細(xì)胞生長曲線（四階段）延遲期（調(diào)整期）生長期（對數(shù)生長期）平衡期衰退期酶的生物合成模式（四類）

——根據(jù)酶產(chǎn)生與細(xì)胞生長的關(guān)系同步合成型延續(xù)合成型中期合成型滯后合成型微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的模式酶生物合成的四種模式時間細(xì)胞/酶濃度同步合成型時間細(xì)胞/酶濃度延續(xù)合成型時間細(xì)胞/酶濃度中期合成型時間細(xì)胞/酶濃度滯后合成型細(xì)胞濃度酶濃度微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的模式同步合成型酶的生物合成與細(xì)胞生長同步進(jìn)行（生長偶聯(lián)

型）大部分組成酶屬于此類此類酶的合成可由其誘導(dǎo)物誘導(dǎo)生成，不受分解代謝物阻遏和反饋阻遏作用酶對應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定典型例子：米曲霉培養(yǎng)生產(chǎn)單寧酶[EC3.1.1.20]（書p36圖2-8）時間細(xì)胞/酶濃度細(xì)胞濃度酶濃度微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的模式延續(xù)合成型酶的合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始，生長進(jìn)入平衡期后，酶還能延續(xù)合成一段時間此類酶的合成可被誘導(dǎo)物所誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物阻遏此類酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性好舉例：黑曲霉培養(yǎng)生產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶[3.2.1.15]（書p37圖2-9）時間細(xì)胞/酶濃度細(xì)胞濃度酶濃度微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的模式中期合成型酶的合成在細(xì)胞生長一段時間后才開始，當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨之停止酶的合成受到產(chǎn)物的反饋阻遏作用或分解代謝物阻遏作用酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性較差舉例：枯草桿菌堿性磷酸酶[EC3.1.3.1]受其水解產(chǎn)物磷酸的反饋阻遏作用（書p38圖2-10）時間細(xì)胞/酶濃度細(xì)胞濃度酶濃度微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的模式滯后合成型當(dāng)細(xì)胞生長一段時間或進(jìn)入平衡期后，才開始合成并大量積累酶許多水解酶屬于此類阻遏物的存在延緩了酶的合成此類酶的mRNA穩(wěn)定性好滯后合成型?延續(xù)合成型舉例：黑曲霉酸性蛋白酶[EC3.4.23.6]（書p38圖2-11）時間細(xì)胞/酶濃度細(xì)胞濃度酶濃度微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的模式Summary關(guān)鍵因素酶對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性培養(yǎng)基中是否存在阻遏物在酶發(fā)酵生產(chǎn)中，為提高產(chǎn)酶速率和縮短發(fā)酵周期，延續(xù)合成型是最理想的合成模式通過基因工程、代謝工程、細(xì)胞工程等手段，篩選優(yōu)良菌株，使合成模式接近延續(xù)合成型。細(xì)胞濃度酶濃度微生物發(fā)酵產(chǎn)酶第二節(jié)產(chǎn)酶微生物的特點1.酶的產(chǎn)量高通過篩選獲得高產(chǎn)菌株？，妥善保存并定期復(fù)壯？。2.容易培養(yǎng)和管理對培養(yǎng)基成分和工藝條件沒有苛刻的要求，容易生長，適應(yīng)能力強，易于控制，便于管理。3.產(chǎn)酶穩(wěn)定性好能穩(wěn)定生長并表達(dá)所需的酶，菌種不易退化。4.有利于酶的分離純化酶的分離提純要比較容易，能獲得較高純度。5.安全可靠產(chǎn)酶微生物及其代謝產(chǎn)物安全無毒，要求菌種對環(huán)境及對操作人員安全，不產(chǎn)生不良影響。獲得高產(chǎn)菌株的方法：反復(fù)的篩選、誘變、基因工程、細(xì)胞或原生質(zhì)體融合。復(fù)壯的方法：單細(xì)胞分離，純化，擴(kuò)大培養(yǎng)；誘變處理淘汰退化型；對于寄生性的微生物，采用接種至昆蟲或動植物體內(nèi)進(jìn)行恢復(fù)。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶產(chǎn)酶微生物的特點產(chǎn)酶微生物的分離和篩選一般流程：樣品的采集：從富含該酶作用底物的場所采集樣品富集培養(yǎng)：投其所好，取其所抗菌種純化與分離：微生物的純培養(yǎng)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以量為主復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對較高的菌株，以質(zhì)為主微生物發(fā)酵產(chǎn)酶產(chǎn)酶微生物的特點例：-淀粉酶生產(chǎn)菌的篩選

產(chǎn)-淀粉酶的微生物可以淀粉為碳源加以利用，在含KI-I2的淀粉培養(yǎng)基上，菌落周圍因分泌出的-淀粉酶將淀粉水解而導(dǎo)致藍(lán)色消失，生成“水解圈”。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶產(chǎn)酶微生物的特點例：蛋白酶生產(chǎn)菌的篩選

在培養(yǎng)基中添加酪蛋白，經(jīng)蛋白酶的水解，培養(yǎng)基相應(yīng)位置變?yōu)槌吻宓摹八馊Α?。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶產(chǎn)酶微生物的特點酶在微生物細(xì)胞中的存在形式胞外酶微生物為了利用環(huán)境中的大分子而釋放到細(xì)胞外的；即使胞外濃度很高，胞內(nèi)也能維持較低水平，受到的調(diào)節(jié)控制少；大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等）。胞內(nèi)酶指合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶；酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的調(diào)控；微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物細(xì)菌大腸桿菌（Escherichiacoli）枯草桿菌（Bacillussubtilis）——應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶微生物放線菌鏈霉菌（Streptomyces）霉菌——使用種類最多的產(chǎn)酶微生物曲霉屬、青霉、根霉等酵母啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）假絲酵母屬（Candida）微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——細(xì)菌大腸桿菌（E.coli）一般產(chǎn)胞內(nèi)酶主要的酶品種谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、青霉素?；傅然蚬こ滩僮髅福合拗菩詢?nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等枯草桿菌（B.subtilis）能產(chǎn)生多種胞外酶主要的酶品種淀粉酶類：如-淀粉酶（胞外）蛋白酶類：如中性蛋白酶（胞外）磷酸酶類：堿性磷酸酶（細(xì)胞間質(zhì)）、5’-核苷酸酶等大腸桿菌特點：細(xì)胞呈現(xiàn)桿狀，有的近似球形，大小0.5um*（1.0-3.0um），一般無莢膜，無芽孢，革蘭氏陰性，運動或不運動，運動者周生鞭毛。菌落特點：從白色到黃色，光滑閃光，擴(kuò)展?？莶輻U菌特點：細(xì)胞呈桿狀，大小0.7-0.8um*2-3um，單個細(xì)胞，無莢膜，周生鞭毛，運動，革蘭氏陽性菌，有芽孢（橢圓至柱狀）。菌落特點：粗糙，不透明，不閃光，擴(kuò)張，污白色或微帶黃色?？莶菅挎邨U菌微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——細(xì)菌枯草桿菌產(chǎn)果膠酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——放線菌鏈霉菌（Streptomyces）生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的主要微生物主要酶品種青霉素酰化酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、堿性/中性蛋白酶等含有豐富的16-羥化酶，用于甾體藥物轉(zhuǎn)化放線菌特點：具有分支狀菌絲的單細(xì)胞原核微生物，革蘭氏陽性菌，具有氣生菌絲和基內(nèi)菌絲。菌落特點：呈放射狀，具有分支的菌絲體。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——放線菌鏈霉菌產(chǎn)聚乙烯醇降解酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——霉菌（絲狀真菌）黑曲霉（Aspergillusniger）可生產(chǎn)多種酶（胞內(nèi)酶或胞外酶）主要酶品種糖化酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纖維素酶等。米曲霉（Aspergillusoryzae）米曲霉中糖化酶和蛋白酶活力較強，因此廣泛應(yīng)用于釀造行業(yè)和食品行業(yè)。米曲霉為一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。主要酶品種糖化酶、果膠酶、氨基?；?、磷酸二酯酶、核酸酶等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——霉菌黑曲霉（A.niger）米曲霉（A.oryzae）微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——霉菌紅曲霉屬（Monascus）菌落成熟后產(chǎn)紅色色素，顏色較深；腐生真菌，能耐受pH3.5和10%酒精，尤嗜乳酸；紅曲霉中含有豐富的酶系，并且自身能合成生長素，無須外源供給，尤其是葡萄糖淀粉酶和蛋白酶等酶，在食品行業(yè)使用廣泛主要酶品種。-淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、酯酶等微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——霉菌青霉屬（Penicillium）屬半知菌綱，也有的列入子囊菌綱；腐生真菌，存在于空氣中及腐爛的物質(zhì)表面；常用的工業(yè)發(fā)酵微生物，廣泛用于有機酸、干酪和抗生素的生產(chǎn)。主要菌種和酶的種類：產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）葡萄糖氧化酶、纖維素酶、果膠酶、青霉素?；傅乳偾嗝梗≒enicilliumcitrinum）脂肪酶、葡萄糖氧化酶、5’-磷酸二酯酶、核酸酶等微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——霉菌青霉屬（Penicillium）微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——霉菌青霉產(chǎn)聚乙烯醇降解酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——霉菌木霉（Trichoderma）屬于半知菌亞門，叢梗孢目，木霉屬，常見的木霉有綠色木霉、康寧木霉等木霉具有較強分解纖維素能力，綠色木霉（T.viride）通常能夠分泌高活性纖維素酶，對纖維素的分解能力很強，因此在木質(zhì)素、纖維素豐富的基質(zhì)上生長快，傳播蔓延迅速菌落開始時為白色，致密，圓形，向四周擴(kuò)展最后整個菌落全部變成綠色產(chǎn)纖維素酶

的重要菌株；亦用于生產(chǎn)17-羥化酶，可用于甾體藥物轉(zhuǎn)化微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——霉菌木霉（Trichoderma）木霉適應(yīng)性很強，菌落擴(kuò)展很快，特別在高溫高濕度條件下幾天內(nèi)木霉菌落可遍布整個料面綠色木霉(T.viride)的菌落哈茨木霉(T.harzianum)的顯微形態(tài)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——霉菌根霉（Rhizopus）具有11-羥化酶，是用于甾體藥物轉(zhuǎn)化的重要菌株產(chǎn)酶品種糖化酶、蔗糖酶、堿性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等毛霉（Mucor）毛霉能糖化淀粉并能生成少量乙醇，產(chǎn)生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我國多用來做豆腐乳、豆豉許多毛霉能產(chǎn)生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等產(chǎn)酶品種蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——霉菌根霉（Rhizopus）毛霉（Mucor）微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——酵母啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)細(xì)胞呈圓形、卵形、橢圓形，在麥芽汁培養(yǎng)基上菌落白色有光澤產(chǎn)酶品種醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、轉(zhuǎn)化酶等微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物——酵母假絲酵母屬（Candida）細(xì)胞呈圓形、卵形或長形，出芽成假菌絲不產(chǎn)色素，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落乳白色或奶油色產(chǎn)酶品種脂肪酶、尿酸酶、轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶等產(chǎn)17-羥化酶，用于甾體藥物轉(zhuǎn)化具烷類代謝的酶系，可利用石油及其加工廢料為碳源微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵生產(chǎn)常用的微生物菌種的選擇了解產(chǎn)某種酶的菌種有哪些對這些菌種的性質(zhì)進(jìn)行全面的考察產(chǎn)酶機理代謝途徑營養(yǎng)組成生長和繁殖情況……考察菌種產(chǎn)酶的能力及穩(wěn)定性考慮是否對菌種進(jìn)行改良優(yōu)化培養(yǎng)條件微生物發(fā)酵產(chǎn)酶第三節(jié)發(fā)酵工藝條件及其控制發(fā)酵工程（fermentationengineering）采用現(xiàn)代工程技術(shù)手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程的一種新技術(shù)。包括菌種的選育、培養(yǎng)基的配制、滅菌、擴(kuò)大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵過程和產(chǎn)品的分離提純等方面。囊括了微生物學(xué)、化學(xué)工程、基因工程、細(xì)胞工程、機械工程和計算機軟硬件工程的一個多學(xué)科工程。工業(yè)發(fā)酵過程厭氧發(fā)酵生產(chǎn)過程，如酒精，乳酸的生產(chǎn)。通氣（有氧）發(fā)酵生產(chǎn)過程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制發(fā)酵工程的產(chǎn)品微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制發(fā)酵生產(chǎn)：從實驗室到工業(yè)生產(chǎn)菌種篩選平板培養(yǎng)搖瓶試驗發(fā)酵罐中試工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上游下游微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制發(fā)酵基本流程和步驟培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基）的配制。培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及輔助設(shè)備的消毒滅菌。將已培養(yǎng)好的有活性的純菌株以一定量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中。將接種到發(fā)酵罐中的菌株控制在最適條件下生長并形成代謝產(chǎn)物。產(chǎn)物抽提、精制，以得到合格的產(chǎn)品?；厥栈蛱幚戆l(fā)酵過程中產(chǎn)生的廢棄物和廢水。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制發(fā)酵工藝條件控制的主要內(nèi)容細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基的成分及其配制pH值調(diào)節(jié)溫度的調(diào)節(jié)控制溶解氧的調(diào)節(jié)控制提高酶產(chǎn)量的措施微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制一、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)菌種保藏短期保藏長期保藏菌種活化使用前接種于新鮮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞生命活動能力。擴(kuò)大培養(yǎng)為保證發(fā)酵時有足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞，活化細(xì)胞要經(jīng)一級至數(shù)級擴(kuò)大培養(yǎng)。一般培養(yǎng)到細(xì)胞處于對數(shù)生長期為宜。采用孢子接種，則應(yīng)培養(yǎng)至孢子成熟期。各有哪些方法？短期保藏方法：斜面包藏、低溫保藏長期保藏方法：沙土管保藏、真空冷凍干燥保藏、石蠟油保藏法；微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制二、培養(yǎng)基的成分及其配制培養(yǎng)基的組成碳源、氮源、水、無機鹽、生長因子……根據(jù)不同的微生物種類和不同的生長條件確定培養(yǎng)基成分，可通過查閱相關(guān)的手冊獲得培養(yǎng)基的成分書p44注意同一種細(xì)胞用于生產(chǎn)不同的酶時，培養(yǎng)基成分不一樣。細(xì)胞在生長、增殖、發(fā)酵、產(chǎn)酶等各階段所需營養(yǎng)成分有區(qū)別。盡量減少培養(yǎng)基中部分物質(zhì)對產(chǎn)酶的阻遏作用。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制三、pH值的調(diào)節(jié)和控制培養(yǎng)基pH值的顯著影響三方面！H+或OH–

影響酶的解離和電荷分布情況，引起酶構(gòu)象的變化。pH值影響細(xì)胞質(zhì)膜的電荷狀況，改變膜的通透性。pH對底物和產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)也存在影響（解離平衡、溶解度、反應(yīng)活性等）。最適生長pH、最適生產(chǎn)pH細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值通常接近該酶反應(yīng)的最適pH值，但一般不同于細(xì)胞生長的最適pH值。培養(yǎng)基的pH值在細(xì)胞生長和發(fā)酵過程中將發(fā)生變化因素？微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制四、溫度的調(diào)節(jié)和控制生長溫度與產(chǎn)酶溫度往往不同，一般后者低于前者較低溫度下，mRNA穩(wěn)定性較高，延續(xù)酶的合成溫度過低，微生物代謝速度減慢，將延長發(fā)酵周期在不同的發(fā)酵階段存在不同的溫度：發(fā)酵產(chǎn)熱生物熱（主要）——微生物在生長繁殖過程中產(chǎn)生的熱量，來自于代謝過程，但是同時熱量擴(kuò)散散失，又會使溫度降低，因此培養(yǎng)基的溫度是兩者綜合作用的結(jié)果。其他熱源（微弱）——機械熱，蒸發(fā)熱，輻射熱。溫度控制——熱水升溫、冷卻水降溫。溫度的雙重影響微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制五、溶解氧的調(diào)節(jié)控制O2是細(xì)胞呼吸所必需的，但細(xì)胞一般只能利用溶解氧，即溶解在培養(yǎng)基中的氧。培養(yǎng)基供氧——通氣攪拌，維持溶解氧含量。耗氧速率KO2——耗氧速率，指單位時間內(nèi)單位體積培養(yǎng)液中細(xì)胞的耗氧量，(mmolO2)·h-1·L-1QO2——細(xì)胞呼吸強度，指單位細(xì)胞量在單位時間內(nèi)的耗氧量，(mmolO2)·h-1·(gDC)-1Ccell——細(xì)胞濃度，單位體積培養(yǎng)液中細(xì)胞質(zhì)量，(gDC)·L-1微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制溶解氧的調(diào)節(jié)控制溶氧速率（溶氧系數(shù)Kd）單位體積發(fā)酵液在單位時間內(nèi)溶解的氧的量，(mmolO2)·h-1·L-1當(dāng)Kd=KO2

時，溶氧量恒定。溶氧量調(diào)節(jié)方法P49通氣量：增大通氣量提高KdO2

分壓：提高O2

分壓，可增加O2

溶解度，提高Kd氣液接觸時間：延長接觸時間，可增加O2

溶解量。氣液接觸面積：增大接觸面積能提高Kd改變培養(yǎng)液的性質(zhì)：培養(yǎng)液的黏度大，易產(chǎn)生泡沫，影響O2

溶解。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制六、提高酶產(chǎn)量的措施(1)添加誘導(dǎo)物酶的作用底物e.g. 乳糖-半乳糖苷酶，以乳糖代替葡萄糖，可以使-半乳糖苷酶表達(dá)量提高數(shù)千倍。酶的反應(yīng)產(chǎn)物e.g. 半乳糖醛酸（果膠酶水解產(chǎn)物）果膠酶底物類似物e.g. 異丙基-β-硫代半乳糖苷IPTG

-半乳糖苷酶，IPTG的誘導(dǎo)效率比底物乳糖高幾百倍微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制提高酶產(chǎn)量的措施(2)控制阻遏物濃度p51e.g.1：枯草桿菌堿性磷酸酶受其反應(yīng)產(chǎn)物H3PO4

的阻遏。e.g.2：β-半乳糖苷酶受培養(yǎng)基中葡萄糖的阻遏。措施：控制速效性碳源的濃度，改用遲效性碳源，或添加cAMP，減少分解代謝物阻遏作用。及時分離末端產(chǎn)物，控制產(chǎn)物濃度在低水平，減弱或解除產(chǎn)物阻遏作用。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件及其控制提高酶產(chǎn)量的措施(3)添加表面活性劑增加質(zhì)膜的通透性，有利于胞外酶的分泌，提高酶的產(chǎn)量；添加表面活性劑有利于提高某些酶的穩(wěn)定性和催化能量。一般采用毒性較小的非離子型表面活性劑e.g.：在木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基中，添加1%吐溫，可使產(chǎn)酶量最高提高20倍。提高酶產(chǎn)量的措施(4)添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑——作用機制不明e.g.：添加植酸鈣鎂可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1~20倍。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶第四節(jié)酶發(fā)酵動力學(xué)概述發(fā)酵動力學(xué)研究發(fā)酵過程中細(xì)胞生長速率、產(chǎn)物生成速率、基質(zhì)消耗速率及環(huán)境因素（如溶解氧）對這些速率的影響規(guī)律研究意義了解酶生物合成模式發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制提高酶產(chǎn)量研究方法通過發(fā)酵實驗數(shù)據(jù)的分析，建立通用的半經(jīng)驗

動力學(xué)模型，并用于一般的發(fā)酵過程微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵動力學(xué)概述一、細(xì)胞生長動力學(xué)研究細(xì)胞生長速度及其受外界環(huán)境影響的規(guī)律1950年，Monod提出表述微生物生長的動力學(xué)方程，他認(rèn)為，細(xì)胞生長速率（RX）與細(xì)胞濃度（X）成正比

——細(xì)胞的比生長速率，h-1假設(shè)培養(yǎng)基中只有一種限制性基質(zhì)S，而不存在其他生長限制因素時，比生長速率為這種限制性基質(zhì)濃度（S）的函數(shù)，即(2-1)酶發(fā)酵動力學(xué)概述一、細(xì)胞生長動力學(xué)Monod給出的表達(dá)式為S——限制性基質(zhì)的濃度m——最大比生長速率（S

過量時），當(dāng)S>>KS

時，

=mKS——Monod常數(shù)，當(dāng)

=?m時，S=KS式

(2-2)

稱為Monod生長動力學(xué)模型式

(2-2)

中不考慮細(xì)胞的死亡Monod方程是基本的細(xì)胞生長動力學(xué)方程，根據(jù)實際需要可以從不同情況出發(fā)對其進(jìn)行修正微生物發(fā)酵產(chǎn)酶(2-2)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵動力學(xué)概述一、細(xì)胞生長動力學(xué)Monod方程與Michaelis-Menten方程比較雙倒數(shù)形式：(1-7a)(2-2)(2-4)(1-7b)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵動力學(xué)概述一、細(xì)胞生長動力學(xué)Monod方程的修正——在連續(xù)全混流反應(yīng)器發(fā)酵過程中，穩(wěn)態(tài)時游離細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵的生長動力學(xué)方程D——稀釋速率（h-1），指單位時間內(nèi)流加的培養(yǎng)液與發(fā)酵液體積之比D=0：分批發(fā)酵D<：dX/dt>0，表明細(xì)胞濃度增加D=：dX/dt=0，表明細(xì)胞濃度恒定（穩(wěn)態(tài)）D>：dX/dt<0，表明細(xì)胞濃度下降，S相對升高，回升D>m：細(xì)胞濃度X

趨于零，無法達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)(2-3)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵動力學(xué)概述二、產(chǎn)酶動力學(xué)——宏觀動力學(xué)（重點）產(chǎn)酶速率（RE）與細(xì)胞比生長速率（）、細(xì)胞濃度（X）等因素有關(guān)，即式(2-5)

稱為宏觀產(chǎn)酶動力學(xué)方程，式中：E——酶濃度，U·L-1RE——產(chǎn)酶速率，U·L-1·h-1X——細(xì)胞濃度，(gDC)·L-1——生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)，U·(gDC)-1——非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率，U·(gDC)-1·h-1(2-5)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶生物合成的模式酶生物合成的四種模式時間細(xì)胞/酶濃度同步合成型時間細(xì)胞/酶濃度延續(xù)合成型時間細(xì)胞/酶濃度中期合成型時間細(xì)胞/酶濃度滯后合成型細(xì)胞濃度酶濃度微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵動力學(xué)概述二、產(chǎn)酶動力學(xué)——各種產(chǎn)酶模式下的宏觀動力學(xué)方程1.同步合成型：

=0，則2.中期合成型：特殊的生長偶聯(lián)型，

=0有阻遏存在時，

=0，無酶產(chǎn)生阻遏解除后才開始合成酶，此時時間細(xì)胞/酶濃度時間細(xì)胞/酶濃度中期合成型微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶發(fā)酵動力學(xué)概述二、產(chǎn)酶動力學(xué)——各種產(chǎn)酶模式下的宏觀動力學(xué)方程3.滯后合成型：非生長偶聯(lián)型，

=0，則4.延續(xù)合成型：部分生長偶聯(lián)型，0，0時間細(xì)胞/酶濃度滯后合成型時間細(xì)胞/酶濃度延續(xù)合成型微生物發(fā)酵產(chǎn)酶第五節(jié)固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶固定化細(xì)胞的概念又稱固定化活細(xì)胞、固定化增殖細(xì)胞。固定化細(xì)胞是用各種方法固定在載體上，在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行生長、繁殖和新陳代謝的細(xì)胞。20世紀(jì)70年代后期發(fā)展起來的技術(shù)目前在發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等胞外酶方面取得了成功微生物發(fā)酵產(chǎn)酶固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶一、固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點1.提高酶的產(chǎn)率——細(xì)胞固定化之后，單位空間內(nèi)細(xì)胞密度增大，因此加速了生化反應(yīng)不同發(fā)酵方式對-淀粉酶產(chǎn)酶率的影響微生物發(fā)酵產(chǎn)酶固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點2.可以反復(fù)使用，可以在高稀釋率下連續(xù)發(fā)酵，使用時間較長。3.提高基因工程菌質(zhì)粒的穩(wěn)定性，不易丟失。4.固定化細(xì)胞對pH值、溫度等外界條件的適應(yīng)范圍增寬，對抑制劑的耐受能力增強，因此發(fā)酵穩(wěn)定性好5.可先經(jīng)預(yù)培養(yǎng)再轉(zhuǎn)入發(fā)酵生產(chǎn)，縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率6.固定化發(fā)酵是非均相體系，產(chǎn)品容易分離純化7.一般只適用于胞外酶的生產(chǎn)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶二、固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及控制1.固定化細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)目的——讓細(xì)胞適應(yīng)固定化之后的新的環(huán)境一般采用與產(chǎn)酶階段不同的培養(yǎng)基2.溫度控制適應(yīng)范圍較寬，在分批發(fā)酵和半連續(xù)發(fā)酵過程中不難控制；連續(xù)發(fā)酵時，由于稀釋率（D）較高，反應(yīng)器內(nèi)溫度變化較大，因此應(yīng)預(yù)先調(diào)節(jié)流加液溫度3.培養(yǎng)基組分控制培養(yǎng)基中某些物質(zhì)影響固定化載體的結(jié)構(gòu)，應(yīng)控制這些物質(zhì)的含量。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及控制4.溶解氧的供給——限制性因素原因：傳質(zhì)問題解決思路加大通氣量，但避免劇烈攪拌（氣升式反應(yīng)器）。改變固定化載體，如少用瓊脂等對氧擴(kuò)散不利的載體；在制備固定化載體時，采用多孔材料或人工致孔，增強溶解氧在載體內(nèi)的擴(kuò)散。添加能富集氧或有利于氧傳遞的物質(zhì)。降低培養(yǎng)基的濃度和黏度。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶三、固定化細(xì)胞生長和產(chǎn)酶動力學(xué)基本原則在固定化細(xì)胞體系中細(xì)胞分兩部分：一部分是固定在載體上的細(xì)胞，濃度基本穩(wěn)定；另一部分是泄漏到培養(yǎng)液中的細(xì)胞，類似于游離細(xì)胞在描述時分兩部分，按固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞分開描述固定化細(xì)胞

游離細(xì)胞 酶活力時間細(xì)胞濃