高中二年級(jí)生物抗原或抗體的檢測

一、檢測的原理性、定量、定位的檢測。變區(qū)互補(bǔ)構(gòu)型，造成兩分子間有較強(qiáng)的親和力?？臻g構(gòu)型互補(bǔ)程度不同，抗原和抗體分子之間結(jié)合力強(qiáng)弱也不同?；パa(bǔ)程度高，則親和力強(qiáng)。此外，反應(yīng)溫度、酸堿度和離子簇之間的結(jié)合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結(jié)合力強(qiáng)，即使抗原濃度很低時(shí)也有較多的抗體結(jié)合抗原形成免疫復(fù)合物。．抗原或抗體外檢測原理根據(jù)抗原抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物的性狀與活性特點(diǎn)，對標(biāo)本中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經(jīng)過一段時(shí)間，若有免疫復(fù)合物形成的現(xiàn)象發(fā)生，就說明同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應(yīng)抗體。濃度呈函數(shù)關(guān)系。（）根據(jù)免疫復(fù)合物產(chǎn)生的多少來推算樣品中抗原（或抗體）的含量：在一定的反應(yīng)條件下，加入的已知抗體（或抗原）的濃度一定，反應(yīng)產(chǎn)生的免疫復(fù)合物多少與待檢樣品中含有相應(yīng)抗原（或抗體）量成正比。也就是抗體濃度一定時(shí)，免疫復(fù)合物越多則樣品中的抗原量也越多?？捎脤?shí)驗(yàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出樣品中抗原（或抗體）的含量。如免疫單向擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫比濁試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫檢測等都屬于這類方法。（）抗原或抗體效價(jià)滴定的原理：當(dāng)抗原抗體復(fù)合物形成多少不能反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)弱時(shí)，就不能以檢測反應(yīng)強(qiáng)度來對抗原或抗體進(jìn)行定量。在實(shí)際工作中，把濃度低的反應(yīng)成分（抗原或抗體）的濃度固定，把濃度高的另一種反應(yīng)成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫

只兔血清顯沉淀淺的抗原稀釋度（如甲兔的抗體效價(jià)為

，而丙免的是

則可比較出分越多。因人血清（抗原）和抗體（免疫兔血清）相比，濃度高，故應(yīng)稀釋抗原。二、抗原或抗體檢測的實(shí)用意義．抗體檢測的意義檢測抗體可用于評價(jià)人和動(dòng)物免疫功能的指標(biāo)?？贵w用于臨床治療或?qū)嶒?yàn)研究時(shí)也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗

HLA

抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對有關(guān)疾病的診斷有重要意義。．抗原檢測的意義可做為抗原進(jìn)行檢測的物質(zhì)可分為以下四類：（）各種微生物及其大分子產(chǎn)物：用于傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。（）生物體內(nèi)各種大分子物質(zhì)：包括各種血清蛋白（如各類免疫球蛋白、補(bǔ)體的檢測。在對這些成分的生物學(xué)作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。（）人和動(dòng)物細(xì)胞的表面分子：包括細(xì)胞表面各種分化抗原（如

異型抗原（血型抗原或

機(jī)制的研究，均有重要意義。（）各種半抗原物質(zhì)：某些藥物、激素和炎癥介質(zhì)等屬于小分子的半抗原，可以分別將它們偶聯(lián)到大分子的載體上，組成人工結(jié)合的完全抗原。用其免疫動(dòng)物，制備出三、抗原或抗體檢測的方法法有下述幾種：（一）沉淀反應(yīng)反應(yīng)體系中出現(xiàn)不透明的沉淀物，這種抗原抗體反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)（ ）。．環(huán)狀沉淀試驗(yàn)先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小于

的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊于上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復(fù)合物沉淀環(huán)，故名為環(huán)狀沉淀試驗(yàn)（

）,此法簡便易行，需用材料較多是其缺點(diǎn)。

的沉淀反應(yīng)。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗體的瓊脂板，以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關(guān)。本方法簡便，，易于觀察結(jié)果，可測定抗原的靈敏度（最低濃度）約為

～20μg/ml

常用于定量測定，人或動(dòng)物血清

、、

和

等，其缺點(diǎn)是需

～

天才能看結(jié)果（圖

）圖

單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖．免疫比濁法 當(dāng)抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復(fù)合物，它可使通過液體的光束發(fā)生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復(fù)合物也增多，光散射現(xiàn)象也相應(yīng)加強(qiáng)。免疫比濁法（）就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經(jīng)過一段時(shí)間，用光散射濁度計(jì)（）測量反應(yīng)液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴(kuò)散法定量測定免疫球蛋白的濃度。，雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 雙免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（

）是在瓊脂板上周凝膠中擴(kuò)散，在兩孔間可出現(xiàn)

～

條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析（圖）。圖

雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖．對流免疫電泳

對流電泳（）是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴(kuò)散。將瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，于負(fù)極側(cè)的孔內(nèi)加入抗原，于正極側(cè)的孔內(nèi)加入抗體，通電后，抗原帶負(fù)電荷向正極泳動(dòng)，抗體分子雖也帶負(fù)電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂的沉淀線。只需

小時(shí)左右即可觀察結(jié)果。 免疫電泳泳，再進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然后在適當(dāng)?shù)奈恢蒙涎仉娪痉较蛲谝恢本€形槽，于槽內(nèi)加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應(yīng)抗體進(jìn)行雙向免疫擴(kuò)散，可形成多答卷沉淀線。常用此法意義（圖

）。圖

免疫電泳法基本步示決圖．免疫印跡法免疫印跡法（）又稱為

印跡法，用于

AIDS的血清抗體檢測。第一步，為電泳分離

HIV

抗原，在電場中根據(jù)分子量大小不同病毒形成的免疫復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)，最后加入顯色底物（如果抗人

是用酶標(biāo)記的）或做放射自顯影（抗人

用

Ⅰ標(biāo)記）以顯示結(jié)果（圖）。圖

用免疫印跡法檢查患者血清中的HIV

病毒抗體第一步：經(jīng)電泳將

HIV

混合抗合抗原按分子量大小分離；第二步：將已分離的抗原經(jīng)電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上；第三步：將待檢病人血清加入覆蓋于硝酸纖維膜上；第四步：加入標(biāo)記的第二抗體使之覆蓋膜上；第五步：加入顯色底物（或放射自顯影）顯現(xiàn)第二抗體（二）凝集反應(yīng)結(jié)合，抗原與抗體結(jié)合形成凝集團(tuán)塊，即稱為凝集反應(yīng)（）。．直接凝集 直接凝集（

）是將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象?？捎糜趥魅静≡\斷如肥達(dá)氏反應(yīng)（

）診斷傷寒病?；蚶醚?xì)胞凝集現(xiàn)象檢查血型。．間接凝集 間接凝集（

）是用可溶性抗原包被在乳膠顆?；蚣t細(xì)胞表面，與相應(yīng)抗體混合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風(fēng)濕抗體包被的乳顆粒，一旦與含有相應(yīng)抗原的腦脊液混合，便可發(fā)生凝集，可進(jìn)行快速診斷。故凝集反應(yīng)即可測定抗原，也可測抗體，方法簡便、敏感。．抗球蛋白試驗(yàn)

抗球蛋白試驗(yàn)（

）的原理為間接凝集試驗(yàn)。例如應(yīng)用于診斷自身免疫溶血性貧血癥時(shí)，紅細(xì)胞與抗

血清間的反應(yīng)。因抗

抗體是

只有兩個(gè)結(jié)合價(jià)，分子較?。ú蝗?/p>

結(jié)合價(jià)多，分子大）很難直接引起

紅細(xì)胞凝集。如果加入抗

的抗體，就可幫助抗

的

的抗體凝集紅細(xì)胞。也就是經(jīng)抗

的作用提高凝集反應(yīng)的靈敏度。（三）補(bǔ)體參與抗原抗體反應(yīng)這一類反

應(yīng)主

要包括溶

血反應(yīng)

（

）、補(bǔ)體介

導(dǎo)的

細(xì)胞毒

試驗(yàn)（

）及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（

）。．溶血反應(yīng) 抗體與紅細(xì)胞表面抗原相遇，形成紅細(xì)胞抗體復(fù)合物即可使加入測，此法比凝集反應(yīng)敏感。溶血反應(yīng)也是用于抗體分泌細(xì)胞即空斑形成細(xì)胞（）檢測的原理。．補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)各種有核細(xì)胞與針對其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復(fù)合物能活化反應(yīng)中的補(bǔ)體，引起細(xì)胞膜穿孔，在一定時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞仍能維持一定的形態(tài)不破碎，加入水溶性染如伊紅Y（

Y

）或臺(tái)盼藍(lán)（

）后，染料即可用于帶各種抗原的細(xì)胞的檢測，如進(jìn)行細(xì)胞

抗原的鑒定，和進(jìn)行淋巴細(xì)胞中

T帶某種抗原的細(xì)胞。．補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)當(dāng)抗原（可溶性或顆粒性）與相應(yīng)抗體結(jié)合，由于濃度低不出現(xiàn)度高。本法包括兩個(gè)抗原抗體系統(tǒng)。一為檢測系統(tǒng)由待檢樣品與已知抗原（或抗體）組成；另一為指示系統(tǒng)，由綿羊紅細(xì)胞（SRBC）和抗

SRBC

組成。另加入作為補(bǔ)體的新鮮豚鼠血清。試驗(yàn)時(shí)試管中先加入檢測系統(tǒng)和補(bǔ)體，混合經(jīng)℃

分鐘使抗原、抗體、補(bǔ)體形成復(fù)合物，再加入指示系統(tǒng)，如出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，說明檢測系統(tǒng)中沒有相對應(yīng)的抗原抗體，補(bǔ)體是游離的指示系統(tǒng)的SRBC

和抗體結(jié)合而出現(xiàn)溶血，即為反應(yīng)陰性。如不出現(xiàn)溶血，表明檢測系統(tǒng)中有抗原抗體復(fù)合物并結(jié)合補(bǔ)體，則指示系統(tǒng)無多余的補(bǔ)體作用而沒有溶血現(xiàn)象，即為陽性。測各種細(xì)菌、病毒或螺旋體（如梅毒）的抗原或抗體，由于本試驗(yàn)影響因素多，結(jié)果不穩(wěn)定現(xiàn)已被新檢測方法所代替。四、用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原、抗體反應(yīng)特性。本方法可用于定性、定量或定位檢測。．免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)（

）是用化學(xué)方法使熒光素標(biāo)記的抗體（或抗原）與組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合，進(jìn)行定性定位檢查抗原或抗體的方法。（）直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細(xì)胞懸液，細(xì)胞涂片或組織切片上進(jìn)行染色，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的熒光抗體，將待檢標(biāo)本在熒光顯微鏡下觀察，T

細(xì)胞和

B

細(xì)胞）或病原菌的檢查，也可用于組織中沉著的免疫復(fù)合物的檢查。本法的缺點(diǎn)是檢查多種抗原，就需分別制備相應(yīng)的多種標(biāo)記抗體。（）間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復(fù)雜操作。將組織或細(xì)胞上的抗原直接與相應(yīng)抗體（不標(biāo)記熒光）結(jié)合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用于檢查抗原的第一抗體是人或動(dòng)物的只需制備一種抗人或動(dòng)物的免疫球蛋白熒光抗體（圖）。圖

免疫熒光直接法及間接法原理示意圖

可診斷近期感染。除微生物學(xué)方面的應(yīng)用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細(xì)胞的

熒光強(qiáng)度。針對細(xì)胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素（FITC）發(fā)黃綠熒光，用羅丹明（TMRITC）發(fā)紅色熒光。由于熒光顏色不同標(biāo)記兩種不同的抗體，對同一細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記染色。對淋巴細(xì)胞亞類鑒定起著巨大推動(dòng)作用。應(yīng)用間接熒光法也用于自身免疫病的抗核抗體檢查。．放射免疫分析法

放射免疫分析法（

RIA）應(yīng)用競爭性結(jié)合的原理，應(yīng)作放射性同素標(biāo)記抗原（或抗體）與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，通過測定抗原抗體結(jié)合物的放射活性判斷結(jié)果，本方法可進(jìn)行超微量分析，敏感性高，可用于測定抗原、抗體、抗原抗體復(fù)合物。本法常用的同位素有Ⅰ和

Ⅰ。放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：（原）和定時(shí)的抗胰島素抗體混合，經(jīng)一定作用時(shí)間后，分離收集抗原抗體復(fù)合物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計(jì)算結(jié)合率。在反應(yīng)系統(tǒng)中，待檢標(biāo)本的胰島素抗原與同位素標(biāo)記的胰島素競爭奪戰(zhàn) 性與胰島素抗體結(jié)合。非標(biāo)記的抗原越多，標(biāo)記抗）。圖

液相放射免疫分析法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線（）固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然后加待檢標(biāo)本，最后加標(biāo)記抗體。測定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰（）海豹化的紙片或聚苯乙烯小管（圖

）。圖

固相放射免疫分析法原理放射免疫分析法應(yīng)用范圍廣泛，包括多種激素（胰島素、生長激素、甲狀腺素等）維生素、藥物、等。．酶聯(lián)免疫分析法

酶聯(lián)免疫分析法（

）是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物高效催化作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷試驗(yàn)結(jié)果，可經(jīng)酶標(biāo)測定儀作定量分析，敏感度可達(dá)

ng

水平。常用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶

、堿性磷酶（

）等。它們與抗體結(jié)合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標(biāo)抗體可保存較長時(shí)間。目前常用的方法有酶標(biāo)免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附法。前者測定細(xì)胞表面抗原或組織內(nèi)的抗原；后者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。圖

生物素－酶標(biāo)親合素系統(tǒng)反應(yīng)示意圖（）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（

）:是與上述固相

RIA面進(jìn)行政區(qū)。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。（）夾心法（

）:將已知的特異抗體包裝在固相載體（塑料板凹孔或后加入該抗原的酶標(biāo)記抗體，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。間接法（

ELISA）常用于檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，

物顯色后，根據(jù)顏色的光密度計(jì)算出標(biāo)本中抗體的含量。（）BAS-ELISA：近年來對酶免設(shè)分析法的改進(jìn)是使用生物素親合素過氧化物多種抗原抗體系統(tǒng)如細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞表面抗原等。一個(gè)親合素（）分子可以結(jié)合

個(gè)生物素分子（光素