第5章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能

第五章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能

第一節(jié)活性蛋白質(zhì)與前體第二節(jié)血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

第三節(jié)分子病第四節(jié)蛋白質(zhì)分子進(jìn)化第五節(jié)蛋白質(zhì)變性第六節(jié)蛋白質(zhì)與活性多肽的界限第一節(jié)活性蛋白質(zhì)與前體

三、兩類前體的不同功能二、酶與酶原一、激素與激素原一、激素與激素原一、激素與激素原（二）腦啡肽與前體（一）胰島素與前體（一）胰島素與前體

胰島素原分子包含一條由81個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈。鏈內(nèi)有3對(duì)二硫鍵。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖5－l所示。

B鏈（l～30）在前、A鏈（61～81）在后，連接肽（C肽鏈）插在中間。即：H2N·B·C·A·COOH

在類胰蛋白酶及類羧肽酶B的催化下，從胰島素原分子上切下Arg31、Arg32、Lys59以及Arg60四個(gè)殘基，從而釋放出C肽，產(chǎn)生了有生物活性的胰島素（圖5－2）。

C肽在胰島素原分子中起何作用？有不同的意見。其中，一個(gè)比較合理的意見是：胰島素一條鏈的結(jié)構(gòu)是生物合成的需要，有利于使胰島素的3對(duì)二硫鍵正確的配對(duì)。胰島素原還有的前體，即前胰島素原（preproinsulin）。通過一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定查明，前胰島素原與胰島素原相比，在N端多出了一個(gè)肽段。此肽段稱為信號(hào)肽（signalpeptide）。人前胰島素原的信號(hào)肽其序列為：（二）腦啡肽與前體甲硫腦啡肽，其一級(jí)結(jié)構(gòu)為Tyr·Gly·Gly·Phe·Met；亮腦啡肽，其一級(jí)結(jié)構(gòu)為Tyr·Gly·Gly·Phe·Leu。腦啡肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的一些規(guī)律1.Tyr1；以甲氧基取代酚羥基，則腦啡肽喪失鎮(zhèn)痛活性，其N末端延長一個(gè)Arg，則活性下降。2.Gly2：改為D－Ala，則鎮(zhèn)痛藥效大大提高。這可能有助于β－轉(zhuǎn)角的形成，與受體的結(jié)合，延長了半衰期。3.Gly3：為活性所必需，不能被取代。4.Phe4：可以被Trp、N－CH3·Phe取代，但不能被Tyr、Leu取代。5.Met5：去除，則活性下降，延長一個(gè)Thr，則活性不變。

二、酶與酶原表5－2酶原轉(zhuǎn)變成活性酶

二、酶與酶原（二）胰蛋白酶原的激活（一）胰凝乳蛋白酶原激活（一）胰凝乳蛋白酶原激活

由245個(gè)氨基酸殘基組成的，具有5對(duì)二硫鍵的一條多肽鏈，沒有酶活性。當(dāng)胰凝乳蛋白酶原的Arg15與Ile16之間的肽鍵被胰蛋白酶切開之后，才具有酶活性。這種酶稱為π－胰凝乳蛋白酶。π－胰凝乳蛋白酶活性最高，但不穩(wěn)定。

π－胰凝乳蛋白酶被其它π－胰凝乳蛋白分子作用（自身激活），切開Leul3－Ser14、Tyrl46－Thrl47以及Asnl48－Alal49間的肽鍵，釋放2個(gè)2肽（Ser14－Arg15；Thrl47－Asnl48），產(chǎn)生穩(wěn)定的但活性較低的α－胰凝乳蛋白酶

胰凝乳蛋白酶原α－胰凝乳蛋白酶催化部位Aspl02、His57、Ser195具有相同的取向。

Arg15－Ile16之間的肽鍵被切開之后，形成了新的Ile16N末端。這個(gè)新末端的氨基與分子內(nèi)部的Asp194的羧基能形成鹽鍵，從而使Ilel6的氨基質(zhì)子化。這是使酶具有活性的重要條件之一。上述鹽鍵的形成，引起一系列的構(gòu)象變化：構(gòu)象變化從而形成了一個(gè)能與底物的非極性側(cè)鏈（芳香族氨基酸和Met的側(cè)鍵）相結(jié)合的疏水的“口袋”。“口袋”的一面由189～192殘基組成。這個(gè)結(jié)合部位（口袋）在酶原中是不存在的。它是結(jié)合底物的部位。酶分子中的Ser195和Glyl93的亞氨基能夠與底物中敏感肽鍵的羧基氧同時(shí)形成氫鍵Met192從酶分子的內(nèi)部轉(zhuǎn)移到酶分子的表面；Gly187和Gly193更加伸展，構(gòu)象變化（二）胰蛋白酶原的激活消化道中蛋白酶原激活的連鎖反應(yīng)三、兩類前體的不同功能

現(xiàn)在看來，有兩類前體。一類是前胰島素原、前腦啡肽原、前甲狀旁腺素原等那樣的前體。其多肽鏈的N端區(qū)都有一個(gè)信號(hào)肽。表5－3列舉了各種蛋白質(zhì)前體的信號(hào)肽。信號(hào)肽與蛋白質(zhì)的分泌直接相關(guān)另一類前體，如胰島素原、腦啡肽原、各種蛋白酶的酶原以及血纖蛋白原、原膠原等，是調(diào)節(jié)生理功能，或者是形成特定構(gòu)象所需要的。第二節(jié)血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

六、影響血紅蛋白氧親和力的因素五、S形氧合曲線的生理意義四、血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)三、血紅蛋白對(duì)氧分子的結(jié)合二、血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)一、概述

一、概述

血紅蛋白（hemoglobin，簡寫Hb）存在于人和脊椎動(dòng)物的紅細(xì)胞中，是O2和CO2的運(yùn)載工具。血紅蛋白是最早得到結(jié)晶的蛋白質(zhì)之一，是第一個(gè)與生理功能相聯(lián)系的蛋白質(zhì)，是第一個(gè)得到X射線衍射結(jié)構(gòu)分析初步結(jié)果的蛋白質(zhì)。從血紅蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究中提出了分子病的概念；從血紅蛋白與O2結(jié)合的研究中發(fā)現(xiàn)了協(xié)同效應(yīng)。3種血紅蛋白的亞基組成如下：HbA：α2β2HbA2：α2δ2HbF：α2γ2

成人的血紅蛋白95％以上2％左右胎兒的血紅蛋白70～80％二、血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)

血紅蛋白是一種球狀的色素蛋白，分子量66，700，由珠蛋白和血紅素結(jié)合而成。（三）血紅素與珠蛋白結(jié)合（二）血紅素結(jié)構(gòu)（一）血紅蛋白一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)（一）血紅蛋白一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)血紅蛋白（HbA）分子的α－亞基包含一條多肽鏈（稱α－鏈），由141個(gè)氨基酸殘基組成。β－亞基也包含一條多肽鏈（稱β－鏈），由146個(gè)氨基酸殘基組成。二者的一級(jí)結(jié)構(gòu)如圖5－9所示。為了比較，抹香鯨肌紅蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)也列在圖5－9中。各肽鏈之間氨基酸的排列有許多相似之處。例如：在α－鏈和β－鍵一級(jí)結(jié)構(gòu)上，有

60個(gè)位置的氨基酸殘基是相同的，占多肽鏈氨基酸殘基總數(shù)的42%左右，α－鏈、β－鏈與肌紅蛋白肽鏈(153AA)3者有23個(gè)位置的殘基是相同的血紅蛋白β－亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)血紅蛋白β－鏈肌紅蛋白構(gòu)象比較血紅蛋白分子是四聚體，包含2個(gè)α－亞基和2個(gè)β－亞基。相同的亞基分別配對(duì)。4個(gè)亞基按四面體方式排布。亞基之間凹凸互補(bǔ)，形成1個(gè)長、寬、高分別為6.4、5.5nm、5nm的四面體圓柱形片段是α－螺旋區(qū)。血紅素以平盤表示。平盤中心的小球代表鐵原子血紅蛋白亞基之間的接觸8個(gè)鹽橋使脫氧血紅蛋白分子構(gòu)象受到了約束，使其對(duì)氧分子的親和力低于單獨(dú)的α－或β－亞基對(duì)氧分子的親和力，低于氧合血紅蛋白的氧親和力此外，血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)中，在4個(gè)亞基之間有一個(gè)中央空穴。2，3－二磷酸甘油酸（DPG）位于這一空穴中。DPG分子中幾個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)與每個(gè)β－亞基的幾個(gè)帶正電荷的基團(tuán)相互吸引，產(chǎn)生幾個(gè)鹽橋,使脫氧血紅蛋白分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，進(jìn)一步降低了脫氧血紅蛋白分子對(duì)氧分子的親和力。

（二）血紅素結(jié)構(gòu)

在血紅蛋白分子中每個(gè)亞基都包含1個(gè)血紅素（heme）。血紅素由1個(gè)鐵原子和1個(gè)原卟啉組成。原卟啉的結(jié)構(gòu)4個(gè)吡咯環(huán)次甲基橋連接鐵原子的配位結(jié)合6個(gè)配位數(shù)（三）血紅素與珠蛋白結(jié)合血紅蛋白分子的每個(gè)亞基必須為血紅素提供一個(gè)疏水性的空穴，以利于O2

能與血紅素鐵原子結(jié)合。與血紅素結(jié)合的氨基酸殘基三、血紅蛋白對(duì)氧分子的結(jié)合

結(jié)合與解離，主要取決于氧分壓在血液中，血紅蛋白實(shí)際結(jié)合的氧分子數(shù)（或者已結(jié)合O2的氧結(jié)合部位數(shù)）對(duì)于血紅蛋白應(yīng)該能結(jié)合的氧分子數(shù)（或者氧結(jié)合部位數(shù)）的百分比，稱為血紅蛋白氧飽和度，用Y表示。

血紅蛋白和肌紅蛋白的氧結(jié)合曲線四、血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)

K1，K2，K3，K4分別為從上述各平衡公式可以得出：根據(jù)氧結(jié)合飽和度的定義，Y應(yīng)該是：

當(dāng)上述4個(gè)結(jié)合常數(shù)不相等時(shí)，也就是血紅蛋白分子中4個(gè)亞基的氧結(jié)合部位之間存在相互作用時(shí)，則Y對(duì)[X]（用氧分壓PO2表示）的關(guān)系表現(xiàn)為S形曲線但是，如果上述4個(gè)結(jié)合常數(shù)相等（k1=k2=k3=k4）時(shí)，也就是，血紅蛋白分子中4個(gè)氧結(jié)合部位之間不存在相互作用時(shí)，則Y對(duì)[X]的關(guān)系如（2）式所示：這是雙曲線。

因此，一般認(rèn)為，在血紅蛋白分子中，α－亞基首先與O2結(jié)合：O2引起α－亞基構(gòu)象變化。此構(gòu)象變化使相鄰的β－亞基的構(gòu)象亦發(fā)生變化，排除了β－亞基氧結(jié)合部位的空間位阻，從而提高了β－亞基對(duì)O2的親和力。這種作用，就是變構(gòu)效應(yīng)，或稱別構(gòu)效應(yīng)（allostericeffect）。許多蛋白質(zhì)和酶都有變構(gòu)效應(yīng)。Adair模型、齊變（M.W.C.）模型和序變（K.N.F）模型

五、S形氧合曲線的生理意義肺氧分壓10.664～13.33kPa80～100mmHg肌肉氧分壓

2.666～5.332kPa20～40mmHg肌紅蛋白的雙曲線，可以設(shè)想：從肺[氧分壓在10.664～13.33kPa（80～100mmHg）]到肌肉[氧分壓在2.666～5.332kPa（20～40＝mmHg）]，氧分壓雖然有較大的變化，但是，Y值變化不大。即到達(dá)肌肉后，氧合血紅蛋白釋放的O2不多。這就遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了肌肉中生物氧化對(duì)于O2的大量需要。血紅蛋白是有變構(gòu)效應(yīng)的。S形曲線的上部較平坦。當(dāng)氧分壓從13.33kPa（100mmHg）降到10.664kPa（80mmHg時(shí)（下降20mmHg），則氧結(jié)合飽和度（Y值）從0.95降到0.93（僅下降0.02）。這說明，在肺部，氧分壓雖有較大的變化，但血液的氧飽和度沒有多大改變。換句話說，存在較多的氧合血紅蛋白。在肺部，要求血液中所有的脫氧血紅蛋白盡量地結(jié)合更多的O2S形曲線的中段2.666～5.332kPa（20～40mmHg），坡度較大。當(dāng)氧分壓從5.332kPa（40mmHg）降到2.666kPa（20mmHg）時(shí)，下降［2.666kPa（20mmHg）］，則Y值從0.6降到0.3（下降0.3）。變化較大。這說明，在肌肉中，氧分壓即使有很小的下降，血液中的氧飽和度亦有較大的下降。換句話說，在肌肉中，氧合血紅蛋白能釋放較多的O2。能滿足肌肉等組織的生理需要。六、影響血紅蛋白氧親和力的因素

氧親和力是指：血紅蛋白對(duì)于氧結(jié)合的牢固程度，表示為PO250。即血紅蛋白中的氧達(dá)到半飽和程度所需要的氧分壓（PO2）。（一）H+和CO2的影響

（二）DPG的影響

（一）H+和CO2的影響

波爾效應(yīng)：H+濃度和CO2分壓的提高，能夠降低血紅蛋白分子對(duì)O2的親和力促使氧合血紅蛋白的氧解離曲線右移（右圖）

在肌肉中，高濃度的H+和CO2促使氧合血紅蛋白分子釋放O2。在肺中，高濃度的O2促使脫氧血紅蛋白分子釋放H+和CO2。問題一：提高H+濃度為什么能夠降低血紅蛋

白對(duì)O2的親和力？

實(shí)驗(yàn)表明，在脫氧血紅蛋白分子中，H+的結(jié)合部位有：

α鏈N末端Val的－NH2基；β鏈His146的咪唑基；α鏈H122的咪唑基。

α鏈NA1Val的－NH2基與H+結(jié)合成帶正電荷的基團(tuán)（－NH3+）。后者與另一個(gè)α鏈的C末端－COO－基形成鹽橋。

此外，H+還與β鏈His146的咪唑基結(jié)合成帶正電荷的基團(tuán)。后者再與同一鏈上βAsp94的側(cè)鏈－COO－基生成鹽橋。這些鹽橋都有助于血紅蛋白脫氧構(gòu)象的穩(wěn)定。因而，增加H+濃度會(huì)降低血紅蛋白的氧親和力。問題二：提高CO2分壓為什么能夠降低血紅

蛋白對(duì)O2的親和力？

在脫氧血紅蛋白中，CO2的結(jié)合部位是4個(gè)亞基的N末端α－NH2基。CO2與N末端α－NH2基可發(fā)生下列可逆的反應(yīng)：與氨基甲酸構(gòu)成鹽橋的基團(tuán)可能是：β82（EF6）Lys的ε－NH3+基；α141（H24）Arg的胍基。

波爾效應(yīng)具有下列重要的生理意義：

當(dāng)血液流經(jīng)組織時(shí)，與血液相比，組織的pH值較低，CO2分壓較高，因而有利于氧合血紅蛋白分子釋放O2，使組織能比單純的氧分壓下降時(shí)獲得更多的O2。當(dāng)血液流經(jīng)肺部時(shí)，由于肺氣泡的O2分壓較高，促進(jìn)脫氧血紅蛋白分子釋放ＣO2和H+。CO2的呼出，有利于氧合血紅蛋白的生成。（二）DPG的影響

DPG是紅細(xì)胞中大量存在的糖代謝的中間產(chǎn)物。它能夠降低血紅蛋白對(duì)O2的親和力，使血紅蛋白的氧合曲線右移（圖5－23）。

實(shí)驗(yàn)表明，DPG與脫氧血紅蛋白的結(jié)合能力比氧合血紅蛋白高100倍以上。因此，DPG是與脫氧血紅蛋白結(jié)合的。

l個(gè)脫氧血紅蛋白分子能夠與一分子的DPG結(jié)合。

DPG分子與4個(gè)氧分子在脫氧血紅蛋白分子上的結(jié)合，是互相排斥的。

DPG降低血紅蛋白氧親和力具有下列重要的生理意義：

▼當(dāng)血液流經(jīng)O2分壓較低的組織時(shí)，紅細(xì)胞中的DPG能促進(jìn)氧合血紅蛋白釋放更多的O2，以滿足組織對(duì)O2的需要。DPG的濃度越大，則O2的釋放量越多。紅細(xì)胞中DPG濃度的變化是調(diào)節(jié)血紅蛋白分子對(duì)O2親和力的重要因素。在空氣稀薄的高山上的人，或者換氣困難的肺氣腫病人，其紅細(xì)胞中的DPG代償性增加，使為數(shù)不多的氧合血紅蛋白分子盡量地釋放O2，以滿足組織對(duì)O2的需要。

第三節(jié)分子病一、概述二、鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥三、活性部位突變的血紅蛋白四、三級(jí)結(jié)構(gòu)突變的血紅蛋白五、四級(jí)結(jié)構(gòu)突變的血紅蛋白一、概述

分子病是一種遺傳性疾病。是指：由于DNA分子上的基因突變，而合成了失去正常生物活性的異常蛋白質(zhì)，或者是缺失某種蛋白質(zhì)，從而，影響了機(jī)體正常的生理功能而產(chǎn)生的疾病?；蛲蛔儼ㄏ铝袔追N類型目前，發(fā)現(xiàn)的異常血紅蛋白，絕大多數(shù)屬于單個(gè)氨基酸取代，即單個(gè)堿基取代、例如：異常血紅蛋白S（HbS）和異常血紅蛋白C（HbC）都是由于血紅蛋白（HbA）β鏈上第6位的Glu發(fā)生了取代。在HbS中，變成Val；在HbC中，則變?yōu)長ys。單個(gè)堿基取代；一個(gè)或多個(gè)密碼子的嵌入或缺失；基因連接；終止密碼變異等。

按照分子遺傳學(xué)的三聯(lián)體密碼理論，單個(gè)氨基酸取代是由于遺傳密碼上的單個(gè)堿基取代而產(chǎn)生的。如下圖所示。

異常血紅蛋白，除了個(gè)別氨基酸殘基取代而外，還有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失，肽段的相互融合，肽鏈延長，甚至于整個(gè)肽鏈的缺失等。▼改換分子表面。在血紅蛋白分子表面上的取代，絕大多數(shù)是無害的，但HbS等例外。▼改換活性部位。血紅素附近的結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，影響了血紅素對(duì)氧的結(jié)合。▼改換三級(jí)結(jié)構(gòu)。氨基酸變異使多肽鏈不能折疊成正常的構(gòu)象。這些異常血紅蛋白通常是不穩(wěn)定的。▲改換四級(jí)結(jié)構(gòu)。在亞基之間界面上的突變，引起變構(gòu)效應(yīng)的喪失。這些異常血紅蛋白通常具有異常的氧親和力。

異常血紅蛋白有下列幾種類型二、鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥遺傳性疾病，鐮刀形紅細(xì)胞血紅蛋白（HbS）比正常的紅細(xì)胞脆弱，易破碎，壽命較短

問題一：HbS與正常的血紅蛋白（HbA)在結(jié)構(gòu)與性質(zhì)上有哪些區(qū)別？

HbS比HbA多2～4個(gè)正電荷。HbS的等電點(diǎn)（6.91）比HbA的等電點(diǎn)（6.68）大0.23。在pH8.0緩沖系統(tǒng)中電泳，HbS的電泳速度較慢。脫氧HbS的溶解度很低，約為脫氧HbA的1／25。HbS的濃溶液，脫氧后會(huì)形成纖維狀沉淀。這個(gè)沉淀使紅細(xì)胞由扁圓形變成鐮刀形。

暴露于血紅蛋白（HbA）分子表面的是極性氨基酸殘基。在人類以及各種動(dòng)物的血紅蛋白之間，分子表面的氨基酸殘基有明顯的差異。說明這部分的氨基酸容易變異，它們對(duì)于血紅蛋白的功能不是關(guān)鍵性的。已發(fā)現(xiàn)一百多種在分子表面發(fā)生氨基酸取代的異常血紅蛋白。這些取代，絕大多數(shù)不影響血紅變白分子的穩(wěn)定性及功能。因此，在臨床上，它們是無害的。只有一小部分異常血紅蛋白可以引起臨床癥狀，例如：HbS、HbC、HbE、HbI以及HbKIbadan等。

問題二：HbS為什么能引起臨床癥狀？

在β鏈第6位，用Val取代Glu，就是把一個(gè)非極性殘基放在HbS分子的表面。這種改換明顯地減小了脫氧HbS的溶解度，但對(duì)氧合HbS的溶解度很少影響。這個(gè)事實(shí)對(duì)理解鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥的臨床癥狀是很關(guān)鍵的。

鐮刀形化的分子基礎(chǔ)可以設(shè)想如下：

1．用Val取代Glu，使HbS每個(gè)β亞基的外側(cè)產(chǎn)生了一個(gè)粘斑（圖5－26）。這個(gè)粘斑在脫氧和氧合HbS分子中都有，但HbA上沒有。

2．在脫氧HbS上有一個(gè)與粘斑互補(bǔ)的部位，脫氧HbS形成細(xì)長的聚合體，即一股螺旋纖維。3.幾股螺旋纖維纏繞在一起，就形成了在電鏡下可見的直徑為17nm和21.5nm的兩種纖維三、活性部位突變的血紅蛋白HbM發(fā)現(xiàn)于世界各地區(qū)和各種族。通過血紅蛋白的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸取代有下列5種類型（表5－6）血紅蛋白M類型先天性青紫癥狀以及繼發(fā)性的紅細(xì)胞增多，稱為HbM病與血紅素結(jié)合的氨基酸殘基四、三級(jí)結(jié)構(gòu)突變的血紅蛋白Pro是α－螺旋的破壞者。如果Pro取代螺旋段中的氨基酸殘基，則血紅蛋白分子構(gòu)象便發(fā)生嚴(yán)重的擾亂，從而產(chǎn)生不穩(wěn)定的血紅蛋白和CHBHA。有許多不穩(wěn)定的血紅蛋白，就是由于Pro取代了螺旋段中的氨基酸殘基而產(chǎn)生的。例如：HbDuarte是β－鏈的螺旋段E6的Val62被Pro取代而產(chǎn)生的；HbGenoa是β－鏈的螺旋段B10的Leu28被Pro取代而產(chǎn)生的。β－鏈α－螺旋段B5缺失一個(gè)Val23β鏈非螺旋拐角區(qū)F7～FG2缺失了一個(gè)肽段[Leu（91）－His－Cys－Asp－Lys（95）]五、四級(jí)結(jié)構(gòu)突變的血紅蛋白

在氧合血紅蛋白與脫氧血紅蛋白互相轉(zhuǎn)變時(shí)，血紅蛋白分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，在α1β2（或α2β1）的接觸處兩條肽鏈發(fā)生明顯的前后位移（圖5－20）。屬于這類血紅蛋白的有：HbYakima：β99（G1）Asp→His；HbKempsey：β99（G1）Asp→Asn；HbRadcliffe：β99（G1）Asp→Ala等。β102（G4）Asn如果發(fā)生取代，則破壞氧合狀態(tài)構(gòu)象的穩(wěn)定性，使血紅蛋白的氧親和力降低。例如HbKansas：βl02（G4）Asn→Thr。在亞基之間界面上的突變，引起血紅蛋白變構(gòu)效應(yīng)的喪失，出現(xiàn)異常的氧親和力。第四節(jié)蛋白質(zhì)分子進(jìn)化

一、概述二、細(xì)胞色素C分子的進(jìn)化

（一）細(xì)胞色素c一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異（二）細(xì)胞色素C三級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性

一、概述關(guān)于不同種屬生物的功能相同的蛋白質(zhì)分子，其一級(jí)結(jié)構(gòu)有種屬差異。蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)，特別是關(guān)鍵部分，不能因?yàn)樽儺惗艿絿?yán)重影響。同源蛋白：指由共同的祖先分子經(jīng)過變異和自然選擇而產(chǎn)生的功能上相同、相關(guān)或不同，但結(jié)構(gòu)上有相似的不同蛋白質(zhì)。3.在同源蛋白的進(jìn)化過程中，氨基酸殘基之間的置換有下列規(guī)律：殘基側(cè)鏈的大小、形狀、柔性、電荷以及氫鍵形成能力等愈近似，則置換愈易發(fā)生，例如：Lys置換為Arg，Ile置換為Leu等。4.同源蛋白在進(jìn)化過程中，其三維結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部位是守恒的，尤其是活性部位（包括與金屬輔基或輔酶相結(jié)合的位置）的氨基酸殘基及其三維排布，均不會(huì)發(fā)生改變。5.蛋白質(zhì)分子的疏水核，其疏水作用對(duì)維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象有重要的作用。6.蛋白質(zhì)分子在進(jìn)化過程中，某些功能能夠得到完善，或者新的功能能夠產(chǎn)生。7.同源蛋白的進(jìn)化有兩個(gè)趨勢(shì)：一個(gè)是保全與完善其生物功能；另一個(gè)是產(chǎn)生新的生物功能，即功能異化。（一）細(xì)胞色素c一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異

現(xiàn)在，已測(cè)出近百種生物的細(xì)胞色素C的一級(jí)結(jié)構(gòu)。表5－7列舉了38種生物的細(xì)胞色素C一級(jí)結(jié)構(gòu)。

脊椎動(dòng)物的細(xì)胞色素C都是由104個(gè)（個(gè)別的103個(gè)）殘基組成的，但昆蟲的有108個(gè)殘基，植物的有111－114個(gè)殘基（一般為112個(gè)）。表5-8細(xì)胞色素C的種屬差異量

（以人為標(biāo)準(zhǔn)）細(xì)胞色素C的種屬差異量（A）及進(jìn)化樹（B）（二）細(xì)胞色素C三級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性

圖5-32兩種不同種屬的細(xì)胞色素C三維結(jié)構(gòu)的比較細(xì)胞色素C三級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性1.對(duì)于生物功能最重要的結(jié)構(gòu)部位是最保守的。血紅素是細(xì)胞色素C分子的電子傳遞中心，在生物進(jìn)化過程中保持不變。馬心細(xì)胞色素C分子構(gòu)象Cys14、Cysl7

、His18

、Met80

、Tyr48、Trp59、6個(gè)殘基保持不變。乙烯基共價(jià)相連

Fe原子配位鍵相連丙酸基氫鍵相連2.不同物種的細(xì)胞色素C的狹縫區(qū)域，其疏水性殘基一般是守恒殘基，或者是可以保守性取代的殘基環(huán)繞狹縫周圍的是16個(gè)疏水性氨基酸殘基。l～47位氨基酸殘基分布于血紅素的一側(cè)48～91位氨基酸殘基分布于血紅素的另一側(cè)16個(gè)疏水性氨基酸殘基：6個(gè)Leu（32，35，64，68，94，98），3個(gè)Ile（81，85，95）；2個(gè)Pro（30，71），2個(gè)Phe（10，46），2個(gè)Tyr（48，67），l個(gè)Trp（59）。狹縫的結(jié)構(gòu)嚴(yán)格地決定著整個(gè)細(xì)胞色素C分子的三維結(jié)構(gòu)保守性取代所謂保守性取代是指：化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸殘基之間有相互置換的現(xiàn)象。例如：Leu與lle，Val與Ile，Phe與Tyr，Asp與Glu之間都能互相替換。70～80肽段中的11個(gè)殘基都是守恒殘基。它們參與構(gòu)成血紅素的疏水環(huán)境，對(duì)于細(xì)胞色素C的功能可能十分重要。3.多肽鏈方向發(fā)生改變的拐彎處，對(duì)于保持分子構(gòu)象的形狀十分重要。

位于拐彎處的Pro（30，71，76）以及Gly（29，34，45，77，84）必然是守恒殘基。

血紅素與環(huán)境之間有兩個(gè)通道。血紅素與環(huán)境之間的兩個(gè)通道左通道是由52～74肽段盤繞而成的。通道中有3個(gè)疏水性的守恒殘基：Trp59、Tyr67、Tyr74?？赡苁请娮觽鬟f通道右通道使血紅素的右側(cè)能與環(huán)境相通。是一個(gè)帶正電荷的區(qū)域4.在分子背部的上方，有一個(gè)帶負(fù)電的區(qū)域。在分子的右上方及左通道的口部，是一個(gè)帶正電荷的區(qū)域分子背部的上方的帶負(fù)電的區(qū)域包括2，4，61，62，66，69，90，93號(hào)殘基。它們都是可變的殘基。大多數(shù)都是帶負(fù)電的在進(jìn)化過程中，該區(qū)域保持帶負(fù)電不變分子的右上方的帶正電荷區(qū)域由5，7，8，13，25，27，99，100等殘基圍成右通道，使血紅素的右側(cè)能與環(huán)境相通。允許種屬差異左通道的口部帶正電荷的區(qū)域

39，53，55，73，79，86，87。它們圍繞左通道的口部，成一環(huán)形，允許有種屬差異第五節(jié)蛋白質(zhì)變性一、概述二、各種變性因素對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響三、變性蛋白質(zhì)的構(gòu)象四、變性和復(fù)性五、變性的預(yù)防和利用

一、概述（一）變性概念（三）變性現(xiàn)象（二）變性因素（四）蛋白質(zhì)變性的鑒定方法（五）研究蛋白質(zhì)變性的重要意義（一）變性概念由于外界因素的作用，使天然蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生了異常變化，從而導(dǎo)致生物活性的喪失以及物理、化學(xué)性質(zhì)的異常變化。變性可以涉及次級(jí)鍵、二硫鍵的斷裂，但不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)上肽健的斷裂。（二）變性因素一類是化學(xué)因素酸、堿，有機(jī)溶劑（如：乙醇、甲醇、丙酮、乙醇等），尿素、鹽酸胍，表面活性劑（如：十二烷基硫酸鈉等），以及三氯乙酸、磷鎢酸、水楊酸等另一類是物理因素?zé)幔?0～70℃），紫外線、X射線、超聲波、高壓、表面張力以及劇烈的振蕩，研磨、攪拌等

（三）變性現(xiàn)象1.物理性質(zhì)的改變

溶解度下降，有的甚至于凝集、沉淀；失去結(jié)晶的能力；出現(xiàn)流動(dòng)雙折射現(xiàn)象；特性粘度增加；旋光值和橢圓度改變，以及紫外吸收光譜和熒光光譜發(fā)生變化等

酶水解增強(qiáng)

化學(xué)反應(yīng)增多抗原性改變；生物功能喪失

3.生物性能的改變2.化學(xué)性質(zhì)的改變（四）蛋白質(zhì)變性的鑒定方法1.測(cè)定蛋白質(zhì)的比活性2.以天然蛋白質(zhì)作對(duì)照，測(cè)定蛋白質(zhì)物理性質(zhì)的變化。3.測(cè)定蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的變化。4.用免疫法測(cè)定蛋白質(zhì)的抗原性是否改變，抗體能否與抗原專一性結(jié)合。5.觀察蛋白質(zhì)的溶解度是否下降，是否凝集、沉淀等。

（五）研究蛋白質(zhì)變性的重要意義

1.大多數(shù)從事蛋白質(zhì)和酶制劑研究的人，希望通過變性研究，認(rèn)識(shí)并掌握變性條件、防止變性，以得到高活性的蛋白質(zhì)和酶制劑。2.有些研究工作，需要利用變性條件。3.利用變性過程，研究維持蛋白質(zhì)二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力，研究各種作用力在決定活性部位上的作用。二、各種變性因素對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響（一）溫度的影響（二）酸、堿的影響（三）尿素和鹽酸胍的影響（四）表面活性劑的影響（五）有機(jī)溶劑的影響（六）鹽的影響（一）溫度的影響熱變性。熱變性有可逆和不可逆之分，一般來說，熱變性僅僅涉及次級(jí)鍵的變化。溫度升高使分子內(nèi)的振動(dòng)增強(qiáng)，從而破壞了維系空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵，使蛋白質(zhì)變性。

冷鈍化RNA酶在低pH范圍（1.13～3.15）內(nèi)的可逆熱變性曲線△ε是相對(duì)天然蛋白的消光系數(shù)變化在低溫下，一些酶被冷鈍化。其中，有些酶的冷鈍化是不可逆的。但是，大多數(shù)酶的冷鈍化是可逆的。固氮酶的鐵蛋白，在0～1℃下放置

15小時(shí)，就喪失了固氮活性，在重新加溫到最適溫度時(shí)，不能恢復(fù)固氮活性。；丙酮酸核化酶在

0℃

放置一小時(shí)之后，幾乎完全喪失活性，然后，保溫

30分鐘，幾乎完全恢復(fù)活性。多亞基的蛋白質(zhì)發(fā)生這類變化并不少見。煙草花葉病毒（TMV）外殼蛋白（鞘蛋白）亞基的聚合，隨溫度下降而降低。冷鈍化可能與酶的活性寡聚體解離成無活性的亞基有關(guān)。

（二）酸、堿的影響在多肽鏈的不同部位，存在著酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基。因而，在多肽鏈的不同部位的側(cè)鏈基團(tuán)之間，存在著靜電的相互作用在許多情況下，酸、堿變性，是與埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的未電離的側(cè)鏈基團(tuán)（主要是Tyr，His）有關(guān)的。當(dāng)pH超過該基團(tuán)的pK值幾個(gè)pH單位時(shí)，這些基團(tuán)就發(fā)生電離，而帶上電荷。由于同性電荷相斥，使多肽鏈伸展，結(jié)果，這些基團(tuán)便轉(zhuǎn)移到分子表面上。酸、堿所引起的蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，有大小之分。有的是很小的變化；有的則幾乎變成無規(guī)則卷曲；有的則是無序和有序兩部分同時(shí)并存的。（三）尿素和鹽酸胍的影響尿素（脲）和鹽酸胍是常用的蛋白質(zhì)變性劑。下圖表示了β－乳球蛋白（β－lactoglobulin）的脲變性曲線。

β－乳球蛋白的脲變性曲線實(shí)驗(yàn)條件：25℃，pH2.77，離子強(qiáng)度0.15，在365nm波長測(cè)定旋光率－[α]；在－[α]=－310℃時(shí)的平線相當(dāng)于蛋白質(zhì)完全伸展的構(gòu)象

脲、胍使蛋白質(zhì)肽鏈伸展而暴露出內(nèi)部的巰基，巰基之間生成二硫橋，進(jìn)而凝集和沉淀；脲、胍處理，使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的鏈間非共價(jià)鍵，從而使蛋白質(zhì)凝集或沉淀脲、胍與蛋白質(zhì)生成氫鍵的能力比水分子強(qiáng)；它們可以通過破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵而使蛋白質(zhì)變性脲、胍能增加非極性分子（包括非極性氨基酸）在水中的溶解度，從而將疏水效應(yīng)減少1／3。這可能是脲，胍影響水結(jié)構(gòu)性質(zhì)的間接結(jié)果。由此推測(cè)，脲、胍很可能通過破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水作用，從而使蛋白質(zhì)分子伸展。此外，脲、胍也可能與蛋白質(zhì)分子的折疊態(tài)和伸展態(tài)直接作用，產(chǎn)生各種效應(yīng)。

（四）表面活性劑的影響長鏈的脂肪酸（如月桂酸）或相應(yīng)的表面活性劑（SDS）很容易與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性。與脲、胍不同，這類變性劑不需要高濃度，在很低的濃度下，就能與蛋白質(zhì)高度的結(jié)合。大多數(shù)蛋白質(zhì)與

SDS結(jié)合的比例很相似，而且，結(jié)合的比例是溶液中自由

SDS平衡濃度的函數(shù)

各種蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的比例是溶液中自由SDS平衡濃度的對(duì)數(shù)的函數(shù)十六烷基三甲基溴化物（cetyltrimethylammoniumbromide）是帶正電荷的；異辛烷基苯氧基多乙氧基－乙醇（isooctoylphenoxypolyethoxyethanol，又稱TritonX－100）是中性的。這兩種表面活性劑也用來解離蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)，或者，用來從生物膜中脫下膜蛋白．中性表面活性劑也經(jīng)常用來對(duì)病毒進(jìn)行溫和的破碎。（五）有機(jī)溶劑的影響對(duì)蛋白質(zhì)來講，一般把非水溶劑分成兩大類：強(qiáng)質(zhì)子性溶劑和弱質(zhì)子性溶劑。強(qiáng)質(zhì)子性溶劑主要是有機(jī)酸和有機(jī)堿。弱質(zhì)子溶劑主要是一些醇和酰胺。一般認(rèn)為，有機(jī)溶劑可以影響靜電力，氫鍵和疏水作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，主要表現(xiàn)為螺旋度的增加。

（六）鹽的影響不同的鹽對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象有不同的影響。例如：對(duì)于RNA酶構(gòu)象的穩(wěn)定性，有些鹽（如：KSCN，CaCl2）有降低作用；有些鹽（如：（NH4）2SO4）有提高作用；有些鹽（如：NaCl、KCl）沒有作用（下圖）。各種鹽對(duì)RNA酶解鏈溫度（Tm）的影響所有的溶液含有：5mg／mlRNA酶，0.15mol／KCl；0.013mol／