第三章 層析技術(shù)

第三章層析技術(shù)Chromatography作者：王英聯(lián)系電話、概述

層析（Chromatography）又稱為色譜,它利用混合物中各組分的物理、化學(xué)性質(zhì)間的差異(溶解度、分子極性、分子大小、分子形狀、吸附力、分子親和力等)，使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域，借此將各組分分離。

1、分配系數(shù)(Partitionchromatography)

混合物在層析過程中不管層析技術(shù)采用的流動(dòng)相和固定相是哪種狀態(tài)都要達(dá)到分配平衡。敘述一種物質(zhì)在兩種特定的相中的分配程度用分配系數(shù)（K）來表示。在特定溫度時(shí)這個(gè)系數(shù)是一個(gè)常數(shù)。 溶質(zhì)在固定相中的濃度 Cs

K=———————————=——

溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度Cm

從一個(gè)混合物中分離、純化樣品的純度如何，取決于混合物中各組分K值的差異程度。

混合物中各組分若K值相差較大,則較易把混合物中的各樣品分離。反之,K值相差較小,則不易分離。2、塔板理論在層析分析過程把層析柱劃分(想象)為若干個(gè)連續(xù)部分,每個(gè)部分稱為一個(gè)塔板。理論板數(shù)(n)：在層析柱上，溶劑連續(xù)不斷加入，化合物在流動(dòng)相和固定相中不斷分配平衡，所發(fā)生的平衡次數(shù)稱為理論板數(shù)。色譜歷史古羅馬人分析混合染料（類似輻射紙色譜）1903年，MichaelTswett提出色譜法1931年，Kuhn采用柱色譜分離了類胡蘿卜素1941年，Martin和Synge提出分配色譜法1944年，Martin等又提出紙色譜法1952年，Martin和James發(fā)明了氣液色譜法1955年，第一臺(tái)商品氣相色譜問世，標(biāo)志著現(xiàn)代色譜分析的建立1956年，Stahl系統(tǒng)研究了薄層色譜法(TLC)1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析儀，確定了核糖核酸的分子結(jié)構(gòu)1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色譜(high-performanceliquidchromatography,HPLC)儀1975年，Small等提出離子色譜

20世紀(jì)80年代，超臨界色譜20世紀(jì)90年代，毛細(xì)管電泳（1809年Re?ss第一次電泳實(shí)驗(yàn)）21世紀(jì)，聯(lián)用技術(shù)、大分子色譜分離、制備色譜可望取得更大的發(fā)展

層析法進(jìn)行時(shí)有兩個(gè)相組成，一個(gè)為固定相(Stationaryphase)，另一個(gè)為流動(dòng)相(Mobilephase)。由于各組分所受的在固定相的阻力和流動(dòng)相的推力影響不同，各組分移動(dòng)速度也各異，從而使各組分得到分離。二、層析的一般原理三、層析技術(shù)的分類

(一)按兩相所處的物態(tài)分類以液體作為流動(dòng)相的稱為液相層析以氣體作為流動(dòng)相的稱為氣相層析其固定相也可有兩種狀態(tài):以固體作為吸附劑的固定相以涂布在固體表面的液體作為固定相（二）按固定相形式分類1、柱層析（columchromatography）將固定相裝在層析柱中2、紙層析（paperchrmatography）紙作為固定相3、薄層層析（thinlayperchromatography）將吸附劑在玻璃板或其他材料薄板上鋪成薄層作為固定相（三）按層析過程的機(jī)制可分類

1、吸附層析(adsorptionchromatography)利用不同組分吸附能力的不同進(jìn)行分離2、分配層析(partitionchromatography)利用不同組分配系數(shù)不同進(jìn)行分離3、離子交換層析（ion-exchangechromatography）

利用離子交換劑與各組分之間的靜電力不同4、凝膠層析（gelchromatography）利用不同組分之間分子大小不同進(jìn)行分離5、親和層析（affinitychromatography）利用生物大分子之間特有親和力的不同進(jìn)行分離

第一節(jié)凝膠層析

GelChromatography

一、概念：凝膠層析：按照被分離物質(zhì)分子大小,經(jīng)過具有一定孔徑的多孔凝膠物質(zhì)進(jìn)行分離的一種方法。又稱為凝膠過濾或分子篩過濾或排阻層析。

主要機(jī)理是分子篩效應(yīng),當(dāng)被分離物質(zhì)流經(jīng)凝膠柱時(shí),因各組份的分子大小不同,在凝膠受到的阻滯作用有差異,從而造成各組分在凝膠柱中的遷移速度不同得到分離。將樣品加入凝膠柱后,分子大的組份不能進(jìn)入凝膠中被排阻在外,而分子的小能通過孔隙進(jìn)入凝膠中。加入洗脫劑后,大分子就隨洗脫劑從凝膠顆粒間隙洗脫下來,其流程短流速快,而小分子物質(zhì)從上一層凝膠孔隙中出來又?jǐn)U散到下一層凝膠孔隙中,這樣多次反復(fù)即流程長,故大分子物質(zhì)先從柱中流出,小分子物質(zhì)后流出而得到分離。二、基本原理

大分子不能進(jìn)入凝膠孔隙中,被排阻在外,受到阻力小,流程短，流速快，先從柱中流出。

小分子進(jìn)入凝膠孔隙中,阻力大，流程長，流速慢，后從中柱流出

。

三、凝膠層析的數(shù)理關(guān)系

1、柱床體積(VT)：即凝膠顆粒的體積以及外部間隙體積的總和。2、洗脫體積（Ve）：即欲分離物質(zhì)被洗脫下來所需的洗脫液的體積。3、外水體積（V0）：即凝膠顆粒間隙水的體積，相應(yīng)于流動(dòng)相的體積。4、內(nèi)水體積（Ｖｉ）：即凝膠顆粒內(nèi)所含水的體積，它可從干凝膠顆粒重量和吸水重量求得。5、凝膠顆粒干體積（Ｖｇ）ＶＴ＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ

洗脫體積（Ｖｅ）與Ｖｏ及Ｖｉ之間的關(guān)系

Ｖｅ＝Ｖｏ＋ＫｄＶｉＫｄ＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／Ｖｉ

Ｋｄ為分子量不同的樣品組分在凝膠內(nèi)部和外部兩相間的分配系數(shù)。它與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆粒孔隙的大小有關(guān)，而與柱的長短粗細(xì)等物理?xiàng)l件無關(guān)。

Kd=0時(shí),Ve=Vo,意味著該分子完全被排阻于凝膠顆粒之外,在固定相分布為0,全部分布于流動(dòng)相里而最先流出。當(dāng)Kd=1時(shí),Ve=Vo+Vi,意味著該分子完全不被排阻,可以自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,它能均等地分布在流動(dòng)相和固定相里,在兩相分配的比值為1,而最后流出.當(dāng)0<Kd<1,Ve=Vo+ViKd為處于兩種極端行為之間的分子。

凝膠層析柱洗脫的三部分示意圖

凝膠層析優(yōu)點(diǎn)：1.凝膠本身不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。2.凝膠層析的操作條件較溫和。3.樣品得率高,重復(fù)性好。缺點(diǎn)：1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限,所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。3.凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)某些溶質(zhì)分子具有吸附作用,如芳香族化合物與脂蛋白等。四、常用凝膠的結(jié)構(gòu)與性能（一）葡聚糖凝膠：（二）瓊脂糖凝膠（三）聚丙烯酰胺凝膠

（一）葡聚糖凝膠：

葡聚糖凝膠是用交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷使線狀的葡聚糖之間通過醚鍵交聯(lián)聚合成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。葡聚糖凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)孔的大小取決于交聯(lián)劑的百分含量。交聯(lián)劑的百分含量高,交聯(lián)度大,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密,吸水后膨脹小,網(wǎng)孔小，分離物質(zhì)的分子量也小。反之,交聯(lián)劑的百分比低,凝膠網(wǎng)孔大，分離物質(zhì)的分子量也大。

瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠,其工作范圍的下限是Sephadex的上限,可分離MW40萬以上的物質(zhì),因此可用來分離核酸及病毒。瓊脂糖凝膠不帶電荷,不受微生物作用而降解,但對(duì)熱不穩(wěn)定,易受pH影響(只在pH4.5-9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定）.

Sephadex為葡聚糖凝膠的商品名，葡聚糖凝的型號(hào)表示每克干凝膠吸水值的10倍,如G-50表示每克干凝膠吸水量為5ml。主要種類：G-10，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，G-200Sephadex的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不溶于水、鹽、弱酸和堿,耐熱耐堿但不耐酸。（二）瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose)（三）聚丙烯酰胺凝膠

使用范圍及效果同葡聚糖凝膠相似,但化學(xué)性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定,可在pH2～11范圍內(nèi)使用。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P（Bio-GelP），由美國Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號(hào)很多，從P-2至P-300共10種，P后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。五、凝膠層析的應(yīng)用

1、分離純化（蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖等）2、脫鹽3、高分子溶液的濃縮4、測分子量（一）凝膠的選擇凝膠顆粒的大小直接影響分離效果。細(xì)粒凝膠柱流速低，分辨率高，多用于精制分離或分析。粗粒凝膠柱流速高，分辨率低，多用于粗制分離，如脫鹽等。凝膠層析經(jīng)常遇到的兩種分離形式。一種是將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如分離蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離。另一種是將分子量相差不大的物質(zhì)分離，如將血清白蛋白與球蛋白分離，這叫做分級(jí)分離。后者對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作要求都比較高。選擇凝膠型號(hào)時(shí)必須使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大一些。六、凝膠層析應(yīng)注意的事項(xiàng)

凝膠層析有稀釋作用，樣品濃度應(yīng)盡量大，但樣品濃度過大往往導(dǎo)致粘度增大，使分辨率下降。對(duì)蛋白質(zhì)樣品濃度以不大于4％為宜。分析層析加樣量為1～2mL/100mL柱床，制備層析加樣量為20～30mL/100mL柱床，這樣可使洗脫體積小于各組分樣品之間的分離體積，可獲得較滿意的分離效果。

選用細(xì)長的柱作凝膠過濾。用來脫鹽時(shí)，柱床高50cm較合適；分級(jí)分離時(shí)采用100cm柱床。柱床高與直徑比值在7～10之間。（三）加樣量（二）柱床高度

樣品黏度對(duì)洗脫曲線的影響（1）濃度為5%，相對(duì)粘度11.8;（2）濃度為2.5%，相對(duì)粘度4.2;（3）濃度為1%.

洗脫的流速對(duì)分離效果有很大影響，下圖顯示了同一凝膠柱在不同流速下的洗脫曲線。較快的流速冼脫峰較平寬。流速低洗脫峰窄而高。也就是說，流速低，分辨率高，樣品稀釋度小。

流速對(duì)洗脫曲線的影響

（四）洗脫的流速

洗脫的流速與洗脫的壓力有關(guān)，與凝膠顆粒的粗細(xì)（型號(hào)）也有關(guān)。在同樣的壓力下，凝膠顆粒粗（型號(hào)?。┑牧魉倏?；顆粒細(xì)（型號(hào)大）的流速慢。對(duì)于同種凝膠來說，在一定范圍內(nèi)，洗脫的壓力加大，流速加快。

欲達(dá)到流速恒定的目的，可自制恒壓加液裝置（下圖），更可靠的是使用微量恒流泵。

凝膠層析恒壓加液裝置

層析系統(tǒng)連接示意圖1．密封橡皮塞；2．恒壓管，3，恒壓瓶；4，層析流出液，5．可調(diào)蜾旋夾；6.自動(dòng)收集器；

7.檢測儀

葡萄糖凝膠和瓊脂糖凝膠都是碳水化合物，能被細(xì)菌和霉菌分解。聚丙烯酰胺凝膠本身不被微生物作用，但微生物能在凝膠床上生長，這樣會(huì)破壞凝膠的特性，影響分離效果。為防止細(xì)菌生長和發(fā)酵，可用0.02％疊氮化鈉、0.05%三氯叔丁醇（僅在弱酸有效，也適用于其他離子交換劑）或0.002％洗必泰、0.01％醋酸苯汞（在弱堿中有效，也適用于其他陰離子交換劑）以及0.1mol／L氫氧化鈉溶液等作防腐劑。層析前再用水或平衡液將防腐劑洗去。

七、凝膠的再生和保養(yǎng)凝膠用過后，有幾種保存方法：

濕態(tài)保存：在水相中加防腐劑，或水洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）；

半收縮保存：水洗后濾干，加70％乙醇使膠收縮，再浸泡于70％乙醇中保存；

干燥保存：水洗后濾干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脫水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或60～80℃烘干）后保存。加乙醇時(shí)，切忌一上來就用濃乙醇處理，以防結(jié)塊。第二節(jié)離子交換層析

ionexchangechromatography一、概念及原理：

利用離子交換劑對(duì)各種離子的親和力不同而進(jìn)行樣品分離的方法。

固定相：帶有大量電荷的離子交換劑。流動(dòng)相：具有一定pH值和一定離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液。洗脫方法：增加離子強(qiáng)度、改變pH值。帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來。

二、離子交換劑的種類

在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即成離子交換劑。（一）按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同陽離子交換劑：帶負(fù)電荷與陽離子交換陰離子交換劑：帶正電荷與陰離子交換（二）按載體種類不同1、離子交換樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂苯乙烯+二乙烯苯

聚苯乙烯（單體）（交聯(lián)劑）交聯(lián)度=————————×100%二乙烯苯苯乙烯+二乙烯苯

交聯(lián)度大，網(wǎng)孔小，大分子量的離子不能進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。在不影響分離的情況下，采用交聯(lián)度較高的樹脂為好，這樣可以提高樹脂對(duì)離子的選擇性。

陽離子交換樹脂：

1、強(qiáng)酸型含磺酸基團(tuán)(R-SO3H)2、中等酸型含磷酸基團(tuán)(-O-PO2H4)3、弱酸型含酚基、羧基陰離子交換樹脂：

1、強(qiáng)堿型含季胺基團(tuán)[-N+(CH3)3]2、弱堿型含叔胺、伯胺基團(tuán)[-N(CH3)2

陰離子交換樹脂對(duì)化學(xué)試劑及熱穩(wěn)定不如陽離子交換樹脂。

2、離子交換纖維素：陰離子交換纖維素:DEAE-纖維素pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì),具有二乙胺乙基。陽離子交換纖維素:CM-纖維素一般pH>4條件下使用,具有羧甲基。3、離子交換凝膠：分離大分子物質(zhì)

葡聚糖（Sephadex）聚丙烯酰胺（PAG）瓊脂糖（Sepharose）三、操作注意點(diǎn)

（一）離子交換劑的選擇原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇對(duì)被分離物質(zhì)各組分之間結(jié)合力差異大的交換劑，以保證通過離子交換層析后能得到比較滿意的結(jié)果?？紤]因素：1.被分離物質(zhì)帶何種電荷。2.被分離物質(zhì)分子的大小，大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素。3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境。4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)。5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量。根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件：強(qiáng)酸強(qiáng)堿：應(yīng)用廣泛弱酸型：只能在堿性pH范圍內(nèi)使用弱堿型：只能在酸性pH范圍內(nèi)使用

(三)洗脫劑原則：所用洗脫液比樣品具有更活潑的離子或基團(tuán)。改變pH或離子強(qiáng)度：降低被分離物與離子交換劑的結(jié)合力。洗脫方式：梯度洗脫（二）緩沖液的選擇

原則：不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所帶電荷應(yīng)與樣品一致，避免使樣品變性四、應(yīng)用

分離蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核酸及其他小分子帶電的物質(zhì)第三節(jié)親和層析AffinityChromatography一、概念：

親和層析是利用生物大分子之間特有的專一親和力而達(dá)到分離純化的層析方法。二、親和層析原理親和層析是利用偶聯(lián)親和配基的介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相層析法

配基（Ligand）:親和層析中能被某一生物大分子識(shí)別和可逆結(jié)合的生物專一性物質(zhì)。

基質(zhì)(Matrix)載體:親和層析中與配基共價(jià)結(jié)合使其固相化的物質(zhì)。配基基質(zhì)（載體）吸附

(Adsorption)

解吸(Elution)

親和作用中的相互作用力1、靜電作用2、氫鍵3、疏水性相互作用4、配位鍵5、弱共價(jià)鍵親和作用體系特異性親和體系高特異性酶--底物、產(chǎn)物、抑制劑抗原--單克隆抗體荷爾蒙--受體蛋白核酸--互補(bǔ)堿基鏈段群特異性免疫球蛋白--A蛋白、G蛋白酶--輔酶酶、蛋白質(zhì)--過渡金屬離子（Cu2+,Zn2+)凝集素--糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體三、載體的選擇

應(yīng)具備的特性：

1.有豐富的可供活化的化學(xué)基團(tuán)，并在溫和條件下能與配基共價(jià)結(jié)合。

2.惰性的，無非專一性吸附或足夠小。

3.多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

4.良好的機(jī)械性能，具有好的液體流動(dòng)性。

5.有較好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。可供選擇的載體

1、瓊脂糖

商品名：Sepharose型號(hào)：2B，4B，6B型號(hào)含義：瓊脂糖濃度為2%，4%，6%特點(diǎn)：親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，網(wǎng)孔大，非專一性吸附小，只能以濕態(tài)保存，經(jīng)不起有機(jī)溶劑處理。2、聚丙烯酰胺凝膠商品名：Bio-Gelp型號(hào)：P-100至-300型號(hào)含義：排阻限度，X1000相當(dāng)于允許進(jìn)入凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)的最大分子量特點(diǎn)：干膠，理化性質(zhì)穩(wěn)定,抗微生物侵襲能力較大,適用于配基和親和物之間親和力比較弱的系統(tǒng),應(yīng)避免在pH2-11以外的溶液中長期使用.3、葡聚糖凝膠商品名:Sephadex型號(hào):G-100,150,200型號(hào)含義:每克干凝膠吸水量X10特點(diǎn):理化性質(zhì)穩(wěn)定,耐熱耐堿不耐酸,網(wǎng)孔小

1、小分子物質(zhì)：輔酶、輔基2、大分子物質(zhì)：酶、抗體3、純化酶的配基:底物、酶活性中心、抑制劑、輔酶等；4、純化抗原抗體的配基：互為配基5、純化核酸的配基：DNA和RNA，蛋白質(zhì)和mRNA常用的配基：四、配基的選擇

應(yīng)具備的特性：

1.對(duì)于欲純化的生物樣品具有專一親和性

2.必須具備能被修飾的功能基團(tuán)五、配基的固相化

固相化技術(shù)：將配基以共價(jià)鍵連接于不溶于水的固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑。過程：活化、接臂

"插入劑"或"手臂"使小分子配基適當(dāng)?shù)碾x開載體骨架,克服載體空間位阻的影響六、親和層析

（一）裝柱和平衡（二）上樣、親和吸附（三）洗脫

1、非特異性洗脫:改變緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)或溫度使物質(zhì)構(gòu)象改變，濃縮、洗脫后立即中和稀釋或透析，使蛋白質(zhì)迅速恢復(fù)到天然結(jié)構(gòu)。

2、特異性洗脫：利用生物學(xué)特異只洗脫和配基專一結(jié)合的樣品，不洗脫由于非專一吸附上去的雜蛋白。（四）再生親和層析柱使用后可用大量洗脫劑連續(xù)洗滌，然后再用平衡緩沖液平衡，經(jīng)處理后的層析柱能再次使用。七、親和層析的應(yīng)用

1.抗原和抗體

2.生物素和親和素

3.維生素、激素

4.激素和受體蛋白

5.凝集素和糖蛋白

6.輔酶7.多核苷酸和核酸

8.氨基酸

9.染料配體

10.分離細(xì)胞、病毒

11.金屬螯合色譜

12.共價(jià)色譜

1、純化過程簡單、迅速。

2、分離效率高。

3、實(shí)驗(yàn)條件溫和。缺點(diǎn)：