光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)知識

光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)知識光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)知識顯微鏡的光學(xué)原理象差顯微鏡的技術(shù)參數(shù)顯微鏡的光學(xué)部件基礎(chǔ)知識第二頁，共90頁。顯微鏡成像FF’物鏡第三頁，共90頁。顯微鏡成像FF’物鏡第四頁，共90頁。顯微鏡成像物鏡250mm＝明視距離FF’目鏡第五頁，共90頁?；A(chǔ)知識光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)知識顯微鏡的光學(xué)原理像差顯微鏡的技術(shù)參數(shù)顯微鏡的光學(xué)部件第六頁，共90頁。理想成像點(diǎn)

標(biāo)本投影圖像點(diǎn)平面平面圖形準(zhǔn)確

相似

圖形像差第七頁，共90頁。實(shí)際圖形點(diǎn)

標(biāo)本投影圖像虛的圓

平面彎曲的面圖形變形的圖形像差第八頁，共90頁。象差的種類球差象散慧差畸變場曲色差基礎(chǔ)知識第九頁，共90頁。象差球差象散慧差場曲負(fù)畸變正畸變基礎(chǔ)知識第十頁，共90頁。場曲基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識ACHPLANACH第十一頁，共90頁。場曲

ＡＣＨＰＬ第十二頁，共90頁。色差基礎(chǔ)知識色差校正對照第十三頁，共90頁。色差校對無校對

校對

第十四頁，共90頁。基礎(chǔ)知識光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)知識顯微鏡的光學(xué)原理像差顯微鏡的技術(shù)參數(shù)顯微鏡的光學(xué)部件第十五頁，共90頁。顯微鏡的技術(shù)參數(shù)數(shù)值孔徑分辨率工作距離焦深放大倍率同焦距同軸度基礎(chǔ)知識第十六頁，共90頁。數(shù)值孔徑()基礎(chǔ)知識第十七頁，共90頁。分辨率基礎(chǔ)知識ΔR=kλ/NAΛ：波長NA：數(shù)值孔徑K常數(shù):K光鏡；KFV第十八頁，共90頁。數(shù)值孔徑大分辨率高基礎(chǔ)知識第十九頁，共90頁。NA與焦深基礎(chǔ)知識第二十頁，共90頁。工作距離()基礎(chǔ)知識第二十一頁，共90頁。工作距離不需要蓋玻片

有蓋玻片第二十二頁，共90頁。同焦距（齊焦距離)基礎(chǔ)知識第二十三頁，共90頁。同軸度基礎(chǔ)知識比如10倍物鏡下的中心轉(zhuǎn)換到40倍是仍然幾乎是中心第二十四頁，共90頁?？吕照彰骱团R界照明基礎(chǔ)知識第二十五頁，共90頁。臨界照明

柯勒照明基礎(chǔ)知識第二十六頁，共90頁。厚標(biāo)本和薄標(biāo)本4-5um2um基礎(chǔ)知識第二十七頁，共90頁?；A(chǔ)知識光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)知識顯微鏡的光學(xué)原理像差顯微鏡的技術(shù)參數(shù)顯微鏡的光學(xué)部件第二十八頁，共90頁。顯微鏡的主要光學(xué)部件物鏡目鏡聚光鏡基礎(chǔ)知識第二十九頁，共90頁。物鏡基礎(chǔ)知識第三十頁，共90頁。物鏡的種類按色差和場曲校正程度分:消色差物鏡（Ach)平場消色差物鏡(PlanAch)平場半復(fù)消色差物鏡(Plan-FL或PLFL）平場復(fù)消色差物鏡（PlanApo)平場超級復(fù)消色差物鏡（PlanSApo)基礎(chǔ)知識第三十一頁，共90頁。VIS－

NIR范圍內(nèi)優(yōu)異的色差校正信噪UPLSAPO物鏡第三十二頁，共90頁。消色差A(yù)ch –藍(lán)

(486nm)和紅

(657nm)半復(fù)消色差Fluorite –蘭和紅

+(綠,紫色(437nm))復(fù)消色差A(yù)po –437-657nm超級復(fù)消色差SuperApo –430-1000nm物鏡的色差校正軸向色差側(cè)向色差A(yù)CH第三十三頁，共90頁。消色差A(yù)ch –藍(lán)

(486nm)和紅

(657nm)半復(fù)消色差Fluorite –蘭和紅

+(綠,紫色(437nm))復(fù)消色差A(yù)po –437-657nm超級復(fù)消色差SuperApo –430-1000nm物鏡的色差校正軸向色差側(cè)向色差A(yù)CHFL第三十四頁，共90頁。IRIR消色差A(yù)ch –藍(lán)

(486nm)和紅

(657nm)半復(fù)消色差Fluorite –蘭和紅

+(綠,紫色(437nm))復(fù)消色差A(yù)po –437-657nm

超級復(fù)消色差SuperApo –430-1000nm物鏡的色差校正軸向色差側(cè)向色差A(yù)CHFLApo第三十五頁，共90頁。消色差A(yù)ch –藍(lán)

(486nm)和紅

(657nm)；綠球差半復(fù)消色差Fluorite –蘭和紅

+(綠,紫色(437nm))；綠、蘭球差復(fù)消色差A(yù)po –437-657nm，綠、蘭、深蘭球差超級復(fù)消色差 –430-1000nmSuperApo物鏡的色差校正軸向色差側(cè)向色差A(yù)CHFLSApoIRIRApo第三十六頁，共90頁。消色差物鏡基礎(chǔ)知識復(fù)消色差物鏡半復(fù)消色差物鏡第三十七頁，共90頁。傳統(tǒng)物鏡的符號基礎(chǔ)知識第三十八頁，共90頁。新物鏡的符號基礎(chǔ)知識第三十九頁，共90頁。其它物鏡基礎(chǔ)知識浮雕相稱物鏡無應(yīng)力偏光物鏡相稱物鏡超低倍物鏡第四十頁，共90頁。帶校正環(huán)物鏡基礎(chǔ)知識第四十一頁，共90頁。對載波片和蓋玻片厚度的要求基礎(chǔ)知識載玻片:0.9-1.4mm蓋玻片:0.17mm第四十二頁，共90頁。無蓋片物鏡基礎(chǔ)知識第四十三頁，共90頁。物鏡光闌的運(yùn)用光闌全開啟光闌適當(dāng)關(guān)小——熒光觀察中應(yīng)用第四十四頁，共90頁。目鏡基礎(chǔ)知識第四十五頁，共90頁。目鏡的視場基礎(chǔ)知識F.N.22第四十六頁，共90頁。標(biāo)本的視場直徑標(biāo)本的視場直徑=目鏡視場數(shù)/物鏡倍率

例:WH10X目鏡視場數(shù)為22物鏡為UPLFL40X視場直徑基礎(chǔ)知識第四十七頁，共90頁。聚光鏡第四十八頁，共90頁。顯微鏡的調(diào)節(jié)瞳距調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)光路轉(zhuǎn)換聚光鏡中心孔徑光欄設(shè)置第四十九頁，共90頁。瞳距調(diào)節(jié)第五十頁，共90頁。屈光度調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)第五十一頁，共90頁。光路轉(zhuǎn)換100%80%20%100%第五十二頁，共90頁。聚光鏡中心調(diào)節(jié)⑤光軸中心調(diào)節(jié)螺釘③視場光闌③孔徑光闌②10X物鏡①標(biāo)本④聚光鏡升降旋鈕第五十三頁，共90頁?？讖焦鈾谡{(diào)節(jié)N.A聚=(0.6-0.8)N.A物第五十四頁，共90頁。孔徑光欄開度與圖象100%70%30%HRLCHCLRMRMC第五十五頁，共90頁?？讖焦鈾诘倪\(yùn)用第五十六頁，共90頁。孔徑光欄的運(yùn)用對比度調(diào)節(jié)第五十七頁，共90頁。奧林巴斯顯微鏡無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)——UIS第五十八頁，共90頁。顯微鏡無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)——UIS

有限遠(yuǎn)無限遠(yuǎn)UIS光學(xué)系統(tǒng)第五十九頁，共90頁。MeritoftheInfinitysystem

物鏡

D/M重影平行光線結(jié)像透鏡第六十頁，共90頁。第六十一頁，共90頁。UIS系統(tǒng)

Universal

Infinity

System————萬能無限遠(yuǎn)系統(tǒng)1.完美結(jié)合分辨率和對比度

-明場高分辨率 -高對比度、高亮度圖像 -清晰的

DIC圖像 -更敏感的偏光觀察 -清晰、色彩明亮的相襯第六十二頁，共90頁。UIS系統(tǒng)Universal

Infinity

System2.系統(tǒng)靈活性 -無限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng) -物鏡和結(jié)像透鏡完全校正3.物鏡萬能性更強(qiáng) -AsingleuniversalobjectivelensperformsverywellinFluorescence,NomarskiDIC,Phasecontrast,Polarizedlightand,ofcourse,Brightfield -HighUVtransmission,Strain-free,PerfectcorrectionofChromaticaberrationandotheropticalaberrations

第六十三頁，共90頁。Competitioncomparison

F:FullyPrimaryCorrectioninobjective&tubelens

Tc:Tube-lensCompensation第六十四頁，共90頁。奧林巴斯顯微鏡無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)——UIS增加附件，光路不變，倍率不變，F(xiàn).N.不變中間附件設(shè)計更簡單，不需增加透鏡物鏡單獨(dú)完成象差校正，象差校正更高，不需目鏡補(bǔ)償更高鏡像亮度，熒光效果更好（結(jié)象透鏡校正）接視頻效果更好，不需增加照相目鏡第六十五頁，共90頁。第六十六頁，共90頁。相差觀察方式1原理利用被檢物體的光程（折射率x厚度）差進(jìn)行鏡檢，即利用干涉現(xiàn)象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹罟曹椕妫何展饩€，直射光通過補(bǔ)償面：相位推遲，衍射光通過物鏡相板聚光鏡環(huán)狀光闌第六十七頁，共90頁。相差觀察方式2特點(diǎn)鑒定活體細(xì)胞最實(shí)用、最經(jīng)濟(jì)的方法3缺點(diǎn)需要光強(qiáng)高切片不能太厚(2~10um)蓋片、載片需符合標(biāo)準(zhǔn)最好配用單色濾光鏡操作較麻煩熒光效果不如明場物鏡第六十八頁，共90頁。相差觀察方式4應(yīng)用：

無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，檢查,鑒定活體細(xì)胞(培養(yǎng)細(xì)胞,分離細(xì)胞)第六十九頁，共90頁。相差觀察方式5調(diào)節(jié)：柯勒照明調(diào)節(jié)將相差物鏡及附件轉(zhuǎn)入光路（物鏡－聚光鏡相襯環(huán)型號匹配）對樣品聚焦取下目鏡，裝上CT望遠(yuǎn)鏡，調(diào)節(jié)CT焦距看到清晰的相差環(huán)調(diào)節(jié)聚光鏡上定位螺絲，使環(huán)狀光闌象與相板共軛面重合第七十頁，共90頁。熒光觀察方法第七十一頁，共90頁。什么是熒光?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光第七十二頁，共90頁。熒光顯微鏡的作用原理寬譜線發(fā)射光（汞燈）濾掉其他光，透過激發(fā)光激發(fā)濾色片吸收濾色片濾掉激發(fā)光，透過熒光標(biāo)本受激發(fā)產(chǎn)生熒光向四周發(fā)散激發(fā)光受反射、折射或衍射向四周發(fā)散第七十三頁，共90頁。熒光的性質(zhì)吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長＞激發(fā)波長（損失熱能）熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率第七十四頁，共90頁。熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途優(yōu)點(diǎn)：檢出能力高（放大作用）對細(xì)胞的刺激小（可以活體染色）能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察——熒光素?zé)晒獾挠袩o、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別——抗體熒光等發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析第七十五頁，共90頁。熒光顯微鏡的主要部件

透射式吸收濾色鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈光源 落射式吸收濾色鏡分光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈光源第七十六頁，共90頁。落射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡第七十七頁，共90頁。落射熒光顯微鏡的構(gòu)造第七十八頁，共90頁。熒光顯微鏡光源

汞燈光源:提供激發(fā)光(U、V、B、G)

氙燈光源：高峰值更寬，更穩(wěn)定第七十九頁，共90頁。熒光顯微鏡激發(fā)透鏡組

激發(fā)濾色鏡:激發(fā)波長選擇

激發(fā)透鏡組（激發(fā)塊）:

T%nmBANDPASS入射光發(fā)射光激發(fā)濾色鏡分光濾色鏡吸收濾色鏡第八十頁，共90頁。落射熒光顯微鏡各部件特性和作用吸收濾色鏡:熒光透過,阻擋雜光分色鏡:反射激發(fā)光,熒光透過＞A透過A＜A反射B＞B透過＜B阻擋nmnmT%T%A第八十一頁，共90頁。濾色鏡的選擇熒光素的特性濾色鏡的特性激發(fā)分色吸收第八十二頁，共90頁。帶寬對圖象的影響SWB:BP420-480WB:BP450-480WIB:BP460-490NB:B