土壤中分解尿素、纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、課題背景1.尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH32.常見(jiàn)的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。[該去哪里取樣?][該配置怎樣的培養(yǎng)基?]2、方法：⑴造成有利于目的菌株生長(zhǎng)的環(huán)境⑵同時(shí)抑制大多數(shù)其他類型微生物閱讀P21

篩選菌株1、土壤中取樣。怎樣分離能分解尿素的細(xì)菌？15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4①?gòu)奈锢硇再|(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素③此配方培養(yǎng)基為什么能夠篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌?氮源是尿素，只允許能以尿素作為氮源的微生物生長(zhǎng)。1.利用尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基分離出的微生物①只是一種細(xì)菌嗎？②都是能分解尿素的微生物嗎？2.請(qǐng)你提供一種方法，判斷分解尿素的細(xì)菌確實(shí)能將尿素分解成氨。4.怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑（P26）以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是分離尿素細(xì)菌判斷該培養(yǎng)基有無(wú)選擇性實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組培養(yǎng)基類型是否接種

目的

結(jié)果只生長(zhǎng)尿素細(xì)菌生長(zhǎng)多種微生物（菌落數(shù)明顯多于實(shí)驗(yàn)組）是如何統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌？計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法稀釋涂布平板法比濁法膜過(guò)濾法1.顯微鏡直接計(jì)數(shù)法：這種方法是利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點(diǎn)是不能區(qū)分死菌和活菌。每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106

的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B稀釋涂布平板注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的培養(yǎng)皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。關(guān)鍵：恰當(dāng)?shù)南♂尪热绻?06稀釋度下的三個(gè)重復(fù)組菌落數(shù)分別為1個(gè)、50個(gè)、170個(gè)。應(yīng)如何處理這個(gè)稀釋組的數(shù)據(jù)？◆如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。106第一天結(jié)束時(shí)1號(hào)培養(yǎng)皿372號(hào)培養(yǎng)皿403號(hào)培養(yǎng)皿32在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。此記錄是否完整？P22統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。分析其原因。原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))如何證明A同學(xué)制作的培養(yǎng)基確實(shí)被污染了？如何證明A同學(xué)操作有問(wèn)題？方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[一]土壤取樣◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封滅菌。①準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。還需要8個(gè)滅菌試管和1個(gè)滅菌移液管。

②稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對(duì)照，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。[二]制備培養(yǎng)基

◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。◆在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度（三）樣品的稀釋（四）取樣涂布（五）微生物的培養(yǎng)與觀察培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。某細(xì)菌固體培養(yǎng)基的組成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、瓊脂和蒸餾水，其中凝固劑是＿＿＿＿＿＿＿，碳源是＿＿＿＿＿＿＿，氮源是＿＿＿＿＿＿＿。已知只有能合成脲酶的細(xì)菌才能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，故該培養(yǎng)基屬于＿＿＿＿培養(yǎng)基。從同化作用類型上看，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌屬于＿＿＿＿。瓊脂

葡萄糖尿素選擇異養(yǎng)型在微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定中，種內(nèi)斗爭(zhēng)最顯著最激烈的時(shí)期是

A．調(diào)整期B．對(duì)數(shù)期

C．穩(wěn)定期D．衰亡期答案：C1.對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（）A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行B.至少接種一種細(xì)菌C.接種一個(gè)細(xì)菌D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）A.培養(yǎng)細(xì)菌B.培養(yǎng)真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素A

CD4.下列說(shuō)法不正確的是（）A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。B5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物D.高濃度食鹽C常見(jiàn)選擇培養(yǎng)的方法1、在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)（1）青霉素分離酵母菌和霉菌(2)高濃度食鹽金黃色葡萄球菌2、改變培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分（1）缺乏氮源固氮微生物（2）含無(wú)機(jī)碳源自養(yǎng)微生物(3)石油作為唯一碳源能消除石油污染的微生物3、改變微生物的培養(yǎng)條件（1）高溫耐高溫微生物（2）無(wú)氧厭氧型、兼性厭氧型課題3分解纖維素的微生物的分離

是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。1.纖維素與纖維素酶纖維素是地球上含量最豐富的

。多糖類物質(zhì)棉花一基礎(chǔ)知識(shí)纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素纖維二糖葡萄糖C1酶Cx酶葡萄糖苷酶2.纖維素分解菌的篩選①篩選纖維素分解菌的方法是_____________。該方法可以通過(guò)_______反應(yīng)直接篩選。剛果紅染色法顏色②其原理是：剛果紅可以與纖維素形成____________，當(dāng)纖維素被__________分解后，紅色復(fù)合物無(wú)法形成，出現(xiàn)以____________為中心的_________，我們可以通過(guò)______________來(lái)篩選纖維素分解菌。紅色復(fù)合物纖維素酶纖維素分解菌

透明圈是否產(chǎn)生透明圈剛果紅能與哪項(xiàng)物質(zhì)形成紅色復(fù)合物A．纖維二糖B．纖維素

C．葡萄糖D．麥芽糖1.下列關(guān)于纖維素酶的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是A.纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種B.纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖C.纖維素酶可用于去掉植物的細(xì)胞壁D.葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是A.剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物B.剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物C.剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D.若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說(shuō)明已篩選出了纖維素分解菌土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落本實(shí)驗(yàn)流程與尿素分解菌的分離實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？選擇培養(yǎng)1.選擇培養(yǎng)的目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物2.制備選擇培養(yǎng)基參照課本29頁(yè)旁欄a.旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？b.這個(gè)培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的？c.你能否設(shè)計(jì)一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基的作用用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對(duì)照選擇培養(yǎng)時(shí)應(yīng)將錐形瓶固定在A．桌子上B．溫箱里

C．窗臺(tái)上D．搖床二、實(shí)驗(yàn)操作土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋，稀釋最大倍數(shù)到106參照課本剛果紅染色法，挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落使用剛果紅染色法時(shí)，加入剛果紅的時(shí)機(jī)是：①制備培養(yǎng)基時(shí)

②梯度稀釋時(shí)

③倒平板時(shí)

④涂布時(shí)

⑤培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落時(shí)

A．①③B．②⑤

C．③⑤D．④⑤C練一練1.在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌，符合下列哪一生物學(xué)觀點(diǎn)？A.生物結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的觀點(diǎn)B.生物結(jié)構(gòu)與功能整體性觀點(diǎn)C.生物與環(huán)境相適應(yīng)的觀點(diǎn)D.生物發(fā)展進(jìn)化的觀點(diǎn)C2.從土壤中分離獲得某種微生物的步驟是①土壤取樣②梯度稀釋③選擇培養(yǎng)④菌懸液涂布平板⑤挑選出單個(gè)菌落A.①②③④⑤B.①③②④⑤C.①②④③⑤D.①④②③⑤B3.有關(guān)選擇培養(yǎng)正確的敘述是A.可以增加纖維素分解菌的濃度B.可以減少纖維素分解菌的濃度C.所用培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基D.所用培養(yǎng)基是平板培養(yǎng)基A【練一練】

有些微生物能合成纖維素酶，通過(guò)對(duì)這些微生物的研究和作用，使人們能夠利用秸稈等廢棄物生產(chǎn)酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。研究人員用化合物A、硝酸鹽、磷酸鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功的篩選到能產(chǎn)生纖維素酶的微生物。分析回答問(wèn)題。

(1)培養(yǎng)基中加入的化合物A是________，為微生物的生長(zhǎng)提供________，這種培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基。

(2)為了篩選出能產(chǎn)生纖維素酶的微生物，向培養(yǎng)基中加入________。纖維素碳源選擇