GB/T 18641-2002偽狂犬病診斷技術(shù)

ICS.11.220B41中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18641—2002偽狂犬病診斷技術(shù)DiagnostictechniquesforAujeszk'sdisease2002-02-19發(fā)布2002-05-01實(shí)施中華：人民共和國(guó)發(fā)布國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)偽狂犬病診斷技術(shù)GGB/T18641-2002中中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版發(fā)行北京西城區(qū)復(fù)興門外三里河北街16號(hào)郵郵政編碼：100045電話：63787337、637874472002年7月第一版2004年11月電子版制作書號(hào)：155066·1-18545版權(quán)專有侵權(quán)必究舉報(bào)電話：（010)68533533

GB/T18641-2002偽狂犬病（pseudorabies.PR:Auieszky'sdisease.AD）是危害豬、牛、羊、狗、貓、家免等多種家畜和野生動(dòng)物的一種急性傳染病。除豬以外的動(dòng)物感染偽狂犬病病毒后·主要是以發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎癥狀為特征以死亡為結(jié)局，并呈散發(fā)形式。本病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害最大，豬感染后可引起姓振母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎;仔豬大量死亡，15日齡內(nèi)死亡率為100%.斷奶仔豬死亡率10%～20%,種豬不育，母豬返情，空懷，公豬宰丸發(fā)炎腫脹、菱縮、失去種用能力：育肥豬增重緩慢、飼料報(bào)硼降低。本病呈世界性分本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的病原學(xué)診斷方法主要用于死亡動(dòng)物的病料檢測(cè)和活體動(dòng)物的鼻技子樣品檢測(cè)，其中聚合酶鏈反應(yīng)具有快速、靈敏的特點(diǎn)，可用于大批樣品的檢測(cè)。血清學(xué)診斷主要用于非免疫動(dòng)物的診斷、血清流行病學(xué)調(diào)查和免疫動(dòng)物的抗體水平監(jiān)測(cè)。中和試驗(yàn)特異性強(qiáng)，是國(guó)際通用的法定方法，可用于口岸進(jìn)出口檢疫;膠乳凝集試驗(yàn)，簡(jiǎn)便快速、敏感性高、特異性強(qiáng)，適用于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)適用于實(shí)驗(yàn)室大批樣品檢查、產(chǎn)地檢疫、流行病學(xué)調(diào)查和無(wú)本病健康豬群的建立。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D都是標(biāo)準(zhǔn)的附錄，附錄E是提示的附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口本標(biāo)準(zhǔn)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院負(fù)責(zé)起草，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所參加起草，本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳煥春、何啟蓋、李曉成、吳斌、方六榮、金梅林、邱德新、吳美州

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18641-2002偽狂犬病診斷技術(shù)DiagnostictechniquesforAujeszk'sdisease1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了偽狂犬病的診斷方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬、羊、犬、貓等及其他易感動(dòng)物偽狂犬病的診斷。其中病毒分離鑒定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、家免接種試驗(yàn)適用于偽狂犬病病毒的檢測(cè)：中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)適用于非免疫動(dòng)物偽狂犬病抗體的檢測(cè)以及免疫后抗體水平的監(jiān)測(cè)：膠乳凝集試驗(yàn)適用于實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)對(duì)偽狂犬病抗體的早期檢測(cè)。病毒分離鑒定2.1試驗(yàn)材料改良最低要素營(yíng)養(yǎng)液(DMEM)培養(yǎng)基配方見附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK.)或豬腎細(xì)胞系（PK-15)細(xì)胞，新生牛血清，青霉素·鏈霉素·0.22m微孔濾膜，細(xì)胞培養(yǎng)瓶。2.2操作步驃2.2.1病料的采集：對(duì)死亡病畜或活體送檢并處死的動(dòng)物，以無(wú)菌手術(shù)采集大腦、三叉神經(jīng)節(jié)、扁桃體肺等組織，冷藏送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2.2.2樣品處理：待檢組織在滅菌乳缽內(nèi)剪碎，加入滅菌玻璃砂研磨,用滅菌生理鹽水或DMEM培養(yǎng)液（見附錄A）制成1：5乳劑.反復(fù)凍融三次，經(jīng)3000r/min離心30min后.取上清液經(jīng)0.22m微孔濾膜過濾，加入青霉素溶液至最終濃度為300TU/mL、鏈霉素為100g/mL,-70℃保存作為接種材料。2.2.3病料接種：將病料濾液接種已長(zhǎng)成單層的BHK細(xì)胞(或PK-15細(xì)胞)接種量為培養(yǎng)液量的10%.37℃恒溫箱中吸附1h.加入含10%新生牛血清(已經(jīng)過56C水浴滅活30min,過濾除菌,無(wú)支原體)的DMEM培養(yǎng)液，置37C溫箱中培養(yǎng)。2.2.4觀察結(jié)果：接種后36h～72h.細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，拉網(wǎng)、脫落。如第一次接種不出現(xiàn)細(xì)胞病變.應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代.如仍無(wú)細(xì)胞病變.則判為偽狂犬病病毒檢測(cè)陰性。2.2.5病毒的鑒定：將出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物，用聚合酶鏈反應(yīng)或家免接種試驗(yàn)，或作進(jìn)一步監(jiān)定。3聚合酶鏈反應(yīng)3.1試驗(yàn)材料蛋白酶K，十二烷基硫酸鈉(SDS).苯酚,三氯甲烷,異戊醇(分析純)溴化乙鍵(EB).TEN緩沖液【見附錄B(標(biāo)準(zhǔn)的