《環(huán)境微生物學(xué)》實驗四細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀察

實驗四細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀察

細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀察目的要求染色劑和染色的原理實驗材料實驗程序思考題目的要求學(xué)習(xí)微生物涂片掌握細(xì)菌的一般染色發(fā)和革蘭氏染色進(jìn)一步熟練掌握顯微鏡油鏡的使用技術(shù)觀察和識別細(xì)菌細(xì)胞的特殊構(gòu)造染色劑和染色原理Ⅰ微生物染色的基本原理，是借助物理和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。化學(xué)因素如：正負(fù)離子之間的相互吸引等染色劑染料按其電離后所帶電荷的性質(zhì)可分為以下類型：1.酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。2.堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。3.中性（復(fù)合）染料：如伊紅、美蘭等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于細(xì)胞核染色）。4.單純?nèi)旧哼@類染料的化學(xué)親和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類（Sudanb)的染料。染色劑和染色原理Ⅱ微生物染色常用染料如下表：實驗材料涂片染色用的細(xì)菌培養(yǎng)物１.大腸桿菌（Escherichiacoli)24h的斜面培養(yǎng)物。

２.枯草桿菌（Bacillussubtilis)12—16h的斜面培養(yǎng)物。載玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、各種染色液、火柴、無菌牙簽、玻璃鉛筆、蒸餾水。顯微鏡、鏡頭油、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯等。示范片１.蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）的芽孢；

２.膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillusmucillaginosus）的莢膜；３.枯草芽孢桿菌的鞭毛。實驗程序Ⅰ

（細(xì)菌染色的方法和步驟）細(xì)菌染色的方法:

１.單染色法：用一種染色液染菌體后，就可以觀察微生物的大小、形狀、和細(xì)胞排列狀況，但不能鑒別微生物以及它的特殊構(gòu)造等。２.復(fù)染色法：用兩種或兩種以上染色液進(jìn)行染色，有協(xié)助鑒別微生物的作用，故也稱鑒別染色法。常用的有：革蘭氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法、細(xì)胞染色法等。染色技術(shù)的一般過程

涂片干燥固定染色媒染脫色復(fù)染水洗干燥鏡檢實驗程序Ⅱ

（簡單染色的方法和步驟）簡單染色法（一般染色法）１.菌種：牙垢細(xì)菌２.涂片３.干燥：自然氣干或酒精燈高處微微加熱。４固定５.染色：在整個涂面上滴加齊氏石炭酸復(fù)紅，染色１分鐘。６.水洗：傾去染液，用自來水細(xì)流沖洗至流下的水中無染料顏色為止。７干燥：空氣中自然干燥。８鏡檢：在油鏡下觀察牙垢中的各種細(xì)菌形態(tài)并繪圖。實驗程序Ⅲ

（革蘭氏染色的方法和步驟）革蘭氏（Gram）染色法1.涂片2.初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。4.脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約30秒，后立即用流水沖洗。5.復(fù)染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。6.

鏡檢：觀察染色結(jié)果并繪圖。革

蘭

氏

染

色

法1.涂片固定2.單染—結(jié)晶紫染液第一次染色

1min

3.媒染—碘-碘化鉀溶液浸濕30S4.脫色—95%乙醇溶液進(jìn)行顏色洗脫5.復(fù)染—紅色的藩紅染液第二次染色

呈現(xiàn)第二次染色的效果紅色；稱革蘭氏陰性菌（紅陰G-）細(xì)菌呈現(xiàn)第一次染色的效果紫色，革蘭氏陽性菌（紫陽G＋）；實驗程序Ⅳ

（莢膜染色的方法和步驟）莢膜染色法（示范）：莢膜薄，易變形，因此在涂片過程中不能用加熱固定。1.

取斜面培養(yǎng)72h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌涂片，自然干燥，自然固定。2.染色：在已自然晾干的涂面上，滴加1%結(jié)晶紫染色液染色2min，以20%硫酸銅沖洗數(shù)次，再用自來水沖洗1次，晾干。3.鏡檢：油鏡觀察示范片并繪圖（菌體紅色，莢膜無色）。細(xì)菌莢膜和負(fù)染色法實驗程序Ⅴ

（鞭毛染色的方法和步驟）菌液的制備及涂片：菌種應(yīng)預(yù)先連續(xù)傳代5—6代。1.接種：先在斜面底部加入0.5—1mL無菌水，取活化的枯草桿菌1—2環(huán)菌苔，接種于無菌水中，300C培養(yǎng)15—18h。2.制備菌液：挑取斜面底部近水面處菌苔數(shù)環(huán)，移入1mL與菌種同溫的無菌水中，在280C溫箱中保溫10min。3.鞭毛涂片：先用懸滴法觀察其運動性，若運動性很強(qiáng)，即可涂片。涂片后自然干燥、固定。染色：染色液必須新配制，涂片必須充分晾干才能染色。

1.先用剛過濾的鞭毛染色液A染7.5—8min左右。

2.傾去A液，再加鞭毛染色液B液染3—5min，水洗，自然干燥。