氧化應(yīng)激影響成骨細(xì)胞功能的研究綜述,人體解剖學(xué)論文

氧化應(yīng)激影響成骨細(xì)胞功能的研究綜述,人體解剖學(xué)論文骨質(zhì)疏松癥〔osteoporosis,OP〕是一種以骨量下降、骨組織微構(gòu)造毀壞為特征，使骨脆性增加，易發(fā)生骨折的代謝性骨病[1].隨著人口老齡化，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。氧化應(yīng)激被以為是介入骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2].氧化應(yīng)激與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松和糖尿病性骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-5].骨質(zhì)的完好性依靠于成骨細(xì)胞的骨構(gòu)成功能與破骨細(xì)胞的骨吸收功能的平衡[6],氧化應(yīng)激可影響成骨細(xì)胞功能。本文就氧化應(yīng)激影響成骨細(xì)胞功能的研究進(jìn)展作一綜述。體內(nèi)研究活性氧〔reactiveoxygenspecies,ROS〕聚集、增加可致氧化應(yīng)激，其具有雙重作用，可氧化、毀壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA,導(dǎo)致細(xì)胞功能改變，可以激活胞內(nèi)多重適應(yīng)性信號通路[7-10].細(xì)胞內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)，華而不實(shí)銅鋅超氧化物歧化酶〔CuZn-SOD〕發(fā)揮重要作用，它由sod1基因編碼[11-12].有文獻(xiàn)報(bào)道，隨年齡增長，sod1基因敲除小鼠表現(xiàn)為明顯骨量下降、骨膠原交聯(lián)異常，sod1敲除鼠成骨細(xì)胞數(shù)量、類骨質(zhì)外表積、礦化物外表積、骨構(gòu)成率顯著下降[13],提示sod1基因敲除可致成骨細(xì)胞增殖、存活和分化功能下降。提取sod1基因敲除鼠原代成骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)sod1敲除鼠成骨細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量顯著增加、成骨細(xì)胞增殖下降、凋亡增加。應(yīng)用抗氧化劑維生素C可逆轉(zhuǎn)sod1基因敲除對小鼠骨代謝及成骨細(xì)胞功能的影響，提示sod1敲除鼠骨表型改變主要原因是氧化應(yīng)激增加，而非sod1基因缺失所致。體外研究ROS與細(xì)胞凋亡H2O2作為ROS的主要成分，可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因AIF、Bax和caspase-3,9表示出，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡[14].氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡已被廣泛認(rèn)可[15-16],但ROS致成骨細(xì)胞凋亡的詳細(xì)分子機(jī)制尚未明確。有研究發(fā)現(xiàn)H2O2可激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶〔ERK〕表示出，而應(yīng)用ERK上游信號MEK1/2抑制劑PD98059不僅可降低成骨細(xì)胞凋亡率，還可改善H2O2誘導(dǎo)的Bax表示出增加和線粒體膜電位超極化[17].提示ERK作為線粒體依靠途徑的上游信號啟動凋亡信號，在H2O2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡經(jīng)過中發(fā)揮積極作用。復(fù)原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸〔NADPH〕氧化酶4〔Nox4〕是產(chǎn)生ROS的重要酶類，H2O2可誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞氧化應(yīng)激增加、Nox4表示出上調(diào)和凋亡增加，應(yīng)用辛伐他汀和RNAi技術(shù)沉默成骨細(xì)胞Nox4表示出后，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷顯著下降，提示在一定程度上辛伐他汀可通過抑制Nox4表示出上調(diào)進(jìn)而保衛(wèi)成骨細(xì)胞免受H2O2損傷.ROS的另一主要來源是線粒體，抗毒素A可通過線粒體依靠途徑增加成骨細(xì)胞凋亡、ROS生成，降低線粒體功能，而用白芍苷預(yù)處理后細(xì)胞色素C、心磷脂、線粒體功能增加，最終減弱抗毒素A對成骨細(xì)胞的氧化損傷.ROS與細(xì)胞增殖H2O2可抑制成骨細(xì)胞增殖，應(yīng)用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸〔NAC〕后成骨細(xì)胞增殖明顯改善[20].Wang等研究發(fā)現(xiàn)不同濃度氟化鈉干涉成骨細(xì)胞后其胞內(nèi)ROS水平上升、增殖下降、細(xì)胞阻滯在S期〔DNA合成期〕,提示氟化鈉可能通過增加細(xì)胞氧化應(yīng)激抑制增殖、阻滯細(xì)胞生長，而另一研究發(fā)現(xiàn)維生素D所致的ROS增加在一定程度上可促進(jìn)人成骨細(xì)胞系SaOS2增殖和能量代謝[22].提示ROS的作用可能與胞內(nèi)ROS水平、作用時(shí)間有關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子FoxO可保衛(wèi)多種細(xì)胞免于ROS損傷，在成骨細(xì)胞系中FoxO1可增加細(xì)胞增殖、分化，減少凋亡。FoxO1作為miR-182的作用靶點(diǎn)，其表示出可被miR-182抑制，進(jìn)而降低成骨細(xì)胞增殖和分化，損害骨生成[23].哺乳動物雷帕霉素靶蛋白〔mTOR〕是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵信號分子[24],Lia等[25]研究發(fā)現(xiàn)小劑量、短時(shí)間H2O2刺激可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞ROS增加進(jìn)而活化mTORC1,促進(jìn)細(xì)胞增殖。而大劑量、長時(shí)間H2O2刺激誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS明顯增加，mTOR表示出下調(diào)，抑制細(xì)胞增殖，該經(jīng)過與腺苷酸活化蛋白激酶〔AMPK〕介導(dǎo)的調(diào)控相關(guān)蛋白〔Raptor〕〔S792〕磷酸化密切相關(guān)。而另一研究則以為H2O2可通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白B1〔cyclinB1〕表示出、誘導(dǎo)G〔2〕細(xì)胞周期阻滯抑制細(xì)胞增殖，H2O2抑制mTOR信號通路在其降低細(xì)胞增殖的經(jīng)過中并無作用[26].ROS與細(xì)胞分化大量研究證明H2O2可影響成骨細(xì)胞分化[27-28].Zhang等[29]指出高糖所致的成骨細(xì)胞ROS水平增加可提高堿性磷酸酶〔ALP〕活性，降低礦化功能，下調(diào)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2〔Runx2〕、Ⅰ型膠原蛋白、骨鈣蛋白基因表示出，促進(jìn)過氧化物酶增殖受體〔PPAR-〕、脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白〔ap2〕基因表示出，ROS的以上作用可被NAC逆轉(zhuǎn)。高糖環(huán)境下ROS通過激活PI3K/Akt信號通路進(jìn)而抑制成骨分化，促進(jìn)成脂分化。Arai等[28]發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，暴露于單一H2O2無毒濃度的成骨細(xì)胞礦化功能下降50%,調(diào)節(jié)抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2基因表示出上調(diào)，成骨標(biāo)志物Runx2、ALP和骨涎蛋白〔BSP〕基因表示出顯著降低，提示ROS致成骨細(xì)胞分化下降與抗氧化酶系統(tǒng)表示出上調(diào)和成骨基因表示出改變密切相關(guān)。Arakak等[30]發(fā)現(xiàn)用促分化培養(yǎng)基培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞14d,細(xì)胞礦化和ALP、骨鈣蛋白基因表示出顯著上升，細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)不斷從網(wǎng)狀向碎片狀變化，胞內(nèi)ROS含量明顯增加，而正常培養(yǎng)條件下成骨細(xì)胞無明顯變化。用NAC處理后ROS水平、成骨細(xì)胞分化功能呈劑量依靠性下降。提示ROS作為胞內(nèi)信號分子，其作用在成骨細(xì)胞分化經(jīng)過中必不可少。ROS與自噬自噬與自噬相關(guān)分子：自噬〔autophagy〕是溶酶體降解胞內(nèi)衰老、損傷的細(xì)胞器和部分蛋白質(zhì)、糖類等的一種程序性細(xì)胞死亡經(jīng)過，是細(xì)胞對環(huán)境的有效反響，以維持細(xì)胞本身穩(wěn)定。該經(jīng)過由自噬相關(guān)基因〔autophagyrelatedgene,Atg〕調(diào)控，Atg最早在酵母菌中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)34種Atg,華而不實(shí)大部分都能在哺乳動物中找到同源基因，如Atg1同源基因是ULK〔UNC-51likekinase〕家族蛋白ULK1和ULK2,Atg17同源基因是FIP200〔focaladhesionkinasefamilyinteractingproteinof200kDa〕、Atg6〔Beclin1〕、Atg8〔LC3〕.這些基因互相聯(lián)絡(luò)，如ULK1/2-mAtg13-FIP200復(fù)合物的構(gòu)成可促使細(xì)胞自噬的發(fā)生[31-32].Atg4可分割微管相關(guān)蛋白1輕鏈3〔LC3〕前體構(gòu)成LC3Ⅰ，隨后由Atg7依靠的泛素化樣系統(tǒng)加工，生成膜結(jié)合形式LC3-Ⅱ，最終將LC3Ⅱ粘連在自噬體膜上，該經(jīng)過是細(xì)胞自噬的一個(gè)重要經(jīng)過，因而LC3-Ⅱ被廣泛作為自噬標(biāo)志物，其表示出水平的高低和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的變化代表了自噬活性的強(qiáng)弱[33].LC3-Ⅱ和Atg12-Atg5結(jié)合體是自噬體膜的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，共同反映自噬活性。p62/SQSTM1是一種泛素結(jié)合蛋白，可與LC3互相作用進(jìn)而介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中泛素化蛋白質(zhì)通過自噬途徑被溶酶體降解[34],其表示出增加表示清楚自噬活性下降，反之自噬活性增加，它能夠作為檢測自噬流量大小的標(biāo)志物[35].自噬與mTOR:mTOR是一種保守的絲/蘇氨酸激酶，有mTORC1和mTORC2兩種活性形式，它作為細(xì)胞內(nèi)的中心信號調(diào)節(jié)因子，可接受激素、能量、氧化應(yīng)激等多種信號刺激[36-40].華而不實(shí)mTORC1在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、能量代謝和細(xì)胞自噬等方面發(fā)揮重要作用[31,41],mTORC1可通過磷酸化、調(diào)節(jié)下游信號分子絲/蘇氨酸核糖體蛋白S6激酶1〔S6K1〕,繼而激活S6,進(jìn)而選擇性增加編碼核糖體蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的mRNA翻譯[42],抑制自噬小體構(gòu)成。mTOR受多種上游刺激因子調(diào)控，如AMPK、絲裂原激活蛋白激酶〔MAPK〕、磷脂酰肌醇-3-羥激酶〔PI3K〕、蛋白激酶B〔AKT〕等，華而不實(shí)AKT/mTOR/p70S6K信號通路可負(fù)性調(diào)節(jié)自噬[43-44].mTOR/p70S6K信號通路可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞自噬功能[45-46],然而其與成骨細(xì)胞自1[47]研究發(fā)現(xiàn)，無血清培養(yǎng)條件下MC3T3-E1細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3,beclin1和ULK1及其蛋白表示出顯著增加，應(yīng)用雌激素后自噬進(jìn)一步加強(qiáng)，且雌激素的該作用與mTOR磷酸化受抑制有關(guān)。ROS與細(xì)胞自噬：近年細(xì)胞自噬與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、慢性代謝性疾病如糖尿病、骨質(zhì)疏松等的關(guān)系備受關(guān)注。無論是正常細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞，胞內(nèi)ROS水平增加均可誘導(dǎo)自噬[48-49].Lu等[50]研究顯示小白菊素可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生ROS,進(jìn)而激活凋亡和AMPK-自噬通路。那么ROS與成骨細(xì)胞自噬之間又有何關(guān)系呢？體外研究[51]發(fā)現(xiàn)H2O2可激活MG63細(xì)胞AMPK信號通路，增加胞內(nèi)氧化應(yīng)激，促進(jìn)自噬，且H2O2所致的自噬增加與AMPK依靠的ULKI激活和mTORC1抑制有關(guān)。Alberto等[52]發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞自噬與胞內(nèi)ROS水平密切相關(guān)。暴露于高糖培養(yǎng)基中的MC3T3-E1細(xì)胞ROS含量、氧化蛋白、自噬顯著增加，應(yīng)用NAC后，成骨細(xì)胞的以上變化均被逆轉(zhuǎn)，提示高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞ROS增加可致自噬增加。在正常培養(yǎng)條件下Atg7基因沉默的成骨細(xì)胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)量和細(xì)胞凋亡顯著增加，提示自噬功能受損可能增加胞內(nèi)ROS,加重細(xì)胞氧化損傷。當(dāng)前高糖環(huán)境下ROS影響成骨細(xì)胞自噬功能的詳細(xì)分子機(jī)制尚未說明，可能與mTOR信號通路抑制相關(guān)。自噬與細(xì)胞凋亡：自噬和凋亡關(guān)系密切[47].為進(jìn)一步討論高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞凋亡和自噬之間的互相聯(lián)絡(luò)，Alberto等[52]應(yīng)用化學(xué)抑制劑和基因沉默等方式方法，發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下自噬抑制劑組和Atg7基因沉默組較單純高糖組成骨細(xì)胞凋亡率顯著增加，應(yīng)用NAC后，以上各組成骨細(xì)胞活性增加、凋亡減少，提示高糖環(huán)境下自噬增加作為一種保衛(wèi)機(jī)制使細(xì)胞免于氧化損傷，降低細(xì)胞凋亡。Yang等應(yīng)用無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡、自噬，并用雌激素干涉無血清培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)雌激素可顯著減少細(xì)胞凋亡，加強(qiáng)細(xì)胞自噬，且雌激素可通過ER-ERK-mTOR信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞自噬進(jìn)而減少凋亡。自噬與細(xì)胞分化、增殖：Alberto等[52]還觀察了成骨細(xì)胞自噬與分化的互相關(guān)系。他們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)干擾Atg7表示出后，與正常培養(yǎng)基組成骨細(xì)胞相比，高糖組的成骨細(xì)胞分化特異性基因Runx2、Osx、骨鈣素〔Osteocalcin〕表示出和細(xì)胞礦化能力顯著降低，提示細(xì)胞自噬受損可加劇高糖對成骨細(xì)胞