分子生物學(xué)研究法上

第四章分子生物學(xué)研究法（上）

--DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)引

言

從20世紀(jì)中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。

基因操作也稱重組DNA技術(shù)，主要包括DNA分子的切割與連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、凝膠電泳、核酸分子雜交、核酸序列分析以及基因人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。

基因工程是指在體外將核酸分子插入各種載體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之進(jìn)入新的寄主細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。本章的主要內(nèi)容第一節(jié)重組DNA技術(shù)回顧第二節(jié)DNA的基本操作技術(shù)第三節(jié)RNA的基本操作技術(shù)第四節(jié)基因克隆技術(shù)第五節(jié)基因芯片技術(shù)第六節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究技術(shù)第一節(jié)重組DNA技術(shù)回顧(ReviewofRecombinantDNATechnique)重組DNA技術(shù)（RecombinantDNATechnique）又稱為基因克?。℅eneCloning）或分子克?。∕olecularCloning）技術(shù)。是按照人們意愿，在體外對(duì)DNA分子進(jìn)行重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA的大量拷貝。重組DNA技術(shù)包括了一系列的基因操作步驟。二、重組DNA技術(shù)的基本步驟

①目的DNA的獲得與載體的制備；②目的DNA與載體的連接；③重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞；④重組DNA的篩選和鑒定；⑤目的DNA的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測與分離純化。三、重組DNA技術(shù)的四大要素

目的DNA

載體（Vector）

工具酶

宿主細(xì)胞（一）目的基因（外源基因）的獲取獲得需要的目的基因常用的方法：1、分離的基因DNA片段或基因；2、mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA；3、化學(xué)合成人工目的基因；4、PCR體外擴(kuò)增的DNA片段。（二）載體載體(Vector)：是指能運(yùn)載外源性DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，并能進(jìn)行自我復(fù)制的DNA?？寺≥d體(cloningvector)：為使插入的外源DNA序列被大量擴(kuò)增而設(shè)計(jì)的載體。表達(dá)載體(expressionvector)：為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而設(shè)計(jì)的載體。允許外源DNA的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。整合載體(integrated

vector):

為把一個(gè)基因插入到染色體中而特意設(shè)計(jì)的載體。1、載體分類按功能分類：（2）按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分類：穿梭載體（Shuttlevector）：是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。如有些載體既能在原核細(xì)胞中復(fù)制又能在真核細(xì)胞中復(fù)制，或能在E.coli

中復(fù)制又能在革蘭氏陽性細(xì)菌中復(fù)制。

原核載體真核載體（3）按載體來源分類：

噬菌體載體（入噬菌體）

質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒（Cosmid）

細(xì)菌人工染色體（BacterialArtificialChromosome，BAC）

P1源的細(xì)菌人工染色體（P1-derivedArtificialChromosome，PAC）酵母人工染色體（YeastArtificialChromosome

YAC）病毒載體哺乳動(dòng)物人工染色體（MammalArtificialChromosome，MAC）人類人工染色體（HumanArtificialChromosome，HAC）植物人工染色體（PlantArtificialChromosome，PAC）常見載體的種類和特征載體類型受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例質(zhì)粒E.coli環(huán)狀＜9kbpUC18/19,T-載體等λ噬菌體E.coli線狀9–24kbΛgt系列絲狀噬菌體E.coli環(huán)狀＜10kbM13mp系列柯斯質(zhì)粒E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,pWE15/16BACE.coli環(huán)狀~300kbPeloBAC系列PACE.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC哺乳類細(xì)胞線性染色體＞1000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒2、載體應(yīng)當(dāng)具備的條件（1）能自主復(fù)制。容易獲得大量的重組的DNA分子；（2）具有合適的外源DNA插入的位點(diǎn)（克隆位點(diǎn)或限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)）。便于接納不同的DNA片段。（3）具備可供選擇的遺傳標(biāo)記。便于進(jìn)行重組體篩選和鑒定。（4）載體本身應(yīng)盡量小。不含或盡量少含多余的DNA部分，這樣可以容納較大的外源DNA。（5）在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性高。多克隆位點(diǎn)Ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記AmpMCS載體（三）工具酶重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶我們的基本目的是：把外源基因與載體連接在一起形成重組DNA分子，最少需要以下兩類工具酶：1、準(zhǔn)確切割DNA分子的工具（“分子手術(shù)刀”）

限制性內(nèi)切酶2、DNA片段的連接工具（“分子縫合針”）

DNA連接酶1、限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”限制性核酸內(nèi)切酶（RestrictionEndonuclease,RE）：是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ命名原則:HindⅢ

屬Haemophilusinfluenzae

d菌株流感嗜血桿菌d菌株的第3種酶①第一個(gè)字母是細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母，要大寫；②第2、3個(gè)字母是細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母，要小寫；

上述字母都是用斜體。③接著是細(xì)菌菌株的第一個(gè)字母，用正體字母書寫；④如果同一菌株有不同的內(nèi)切酶時(shí)，按發(fā)現(xiàn)次序分別用羅馬數(shù)字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……表示。種菌株序識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

即反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，以DNA分子中某一處為軸，其兩側(cè)核苷酸排列呈回文對(duì)稱的序列。每種限制性內(nèi)切酶都有一個(gè)它所識(shí)別、結(jié)合并切割的特異序列，稱為限制性位點(diǎn)或切點(diǎn)（4~8bp）。識(shí)別序列：GGATCCCCTAGGBamHⅠBamHⅠCCCGGGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGSamICCCGGGGGGCCCGGGCCC+平末端（Bluntend）：對(duì)稱軸切割粘性末端（Stickyend）：交錯(cuò)切割切口：平端切口、粘端切口如果用一種限制酶，切割兩種不同的DNA時(shí)，產(chǎn)生相同的末端，混合后“退火”，這兩種不同的DNA分子彼此可以連接，形成重組DNA分子。2、DNA連接酶“分子縫合針”DNA連接酶（DNALigase）：

催化兩條DNA鏈的3′-OH和5′-P之間形成磷酸二酯鍵而把兩個(gè)DNA分子連接在一起。例如:T4DNA連接酶。外源基因與載體的連接方式：（1）粘性末端連接方式：①同一限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的連接②不同限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的連接（2）平端連接適用于：①限制性內(nèi)切酶作用產(chǎn)生的平端②粘端經(jīng)特殊酶處理變?yōu)槠蕉耍?）同聚物加尾連接由末端轉(zhuǎn)移酶（Terminaltransferase）作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再連接。（4）人工接頭平端加上帶有新的酶切位點(diǎn)的寡核苷酸，再用限制酶切產(chǎn)生粘性末端，進(jìn)行連接。（四）宿主細(xì)胞大腸桿菌酵母1、常用種類2、導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化（transformation）轉(zhuǎn)染（transfection）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）二、細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖細(xì)菌轉(zhuǎn)化（Transformation）:

一種細(xì)菌菌株由于捕獲了外源DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。

絕大多數(shù)細(xì)菌，正常條件下僅能獲得極少量的DNA。為了高效轉(zhuǎn)化這些細(xì)菌，必須對(duì)受體細(xì)菌進(jìn)行一些物理或化學(xué)的處理，以增加它們獲得DNA的能力。經(jīng)歷這種處理的細(xì)胞被稱為感受態(tài)細(xì)胞（CompetentCell）。

常用細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法1CaCl2法將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)(0℃）預(yù)處理的低滲氯化鈣(0.1mol/L)溶液中，使細(xì)胞膨脹形成原生質(zhì)球，外源DNA粘附在細(xì)胞表面。42℃下做短暫熱刺激，細(xì)胞吸收外源DNA。在全培養(yǎng)基中生長一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)，涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。常用細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法2電轉(zhuǎn)化法克隆的篩選和鑒定：1、抗生素常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等。2、α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選法實(shí)驗(yàn)室常用帶有不同抗生素的選擇性培養(yǎng)基結(jié)合α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選法鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。載體上：β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和氨基端（N端）146個(gè)氨基酸編碼序列，在編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）；

片段宿主細(xì)胞：編碼β-半乳糖苷酶C端序列

片段宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，LacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為α-互補(bǔ)。X-gal藍(lán)色化合物X-galβ-半乳糖苷酶IPTG（LacZ基因N端序列）LacZ基因N端序列LacZ酶LacZ基因N端序列插入片段（LacZ基因失活）細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖的操作過程第二節(jié)DNA的基本操作技術(shù)（TechniquesforDNAManipulation）一、核酸的凝膠電泳二、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)三、實(shí)時(shí)定量PCR四、基因組DNA文庫的構(gòu)建一、核酸的凝膠電泳

核酸凝膠電泳是重組DNA技術(shù)的核心技術(shù)之一，它可以按分子量大小對(duì)DNA或RNA進(jìn)行分離。因此，可用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段，也是許多分子生物學(xué)研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析、凝膠回收等等一系技術(shù)的技術(shù)基礎(chǔ)。凝膠電泳的基本原理

將一帶電荷的分子放置到電場中，會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O（電泳）。這種分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳遷移率。電場強(qiáng)度越大，帶點(diǎn)分子凈電荷越多，遷移速率越快，分子越慢。

在電泳中往往使用無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)（瓊脂糖or聚丙烯酰胺凝膠），電泳遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。摩擦系數(shù)是分子大小、極性、介質(zhì)粘度等的函數(shù)。因此，在同一凝膠中、一定電場強(qiáng)度下，可根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型的差異以及所帶電荷的多寡，將分子混合物中的各種成分彼此分開。生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈負(fù)離子化狀態(tài)。同時(shí)，由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同大小的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。常用的核酸凝膠電泳有瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。可以在水平或垂直的電泳槽中進(jìn)行。

瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來的。將瓊脂糖粉末加熱到熔點(diǎn)后冷卻凝固便會(huì)形成良好的電泳介質(zhì)。經(jīng)化學(xué)修飾后，瓊脂糖的熔點(diǎn)會(huì)降低（低熔點(diǎn)瓊脂糖），在較低溫度下便會(huì)熔化，常用于DNA片段的制備電泳。

聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成。催化聚合的常以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。

瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2-50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1-1,000bp之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。二、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)KaryB.Mullis(1944-)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）:是利用DNA片段旁側(cè)兩個(gè)短的單鏈引物，在體外快速擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。20世紀(jì)80年代，KaryB.Mullis發(fā)明該技術(shù)。1993獲得NobelPrize。/三、實(shí)時(shí)定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。實(shí)時(shí)定量PCR（RealtimequantitativePCR

）TheoreticalRealLifeLogTargetDNACyclePCR產(chǎn)物積累規(guī)律PCR擴(kuò)增中的“平臺(tái)效應(yīng)”，導(dǎo)致常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)最終產(chǎn)物總量定量的不可靠性。實(shí)時(shí)定量PCR的基本原理

在反應(yīng)體系和反應(yīng)條件完全一致的情況下，PCR擴(kuò)增呈指數(shù)增長時(shí)，模板量與擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比。由于反應(yīng)體系中的熒光基團(tuán)與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，因此通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量。四、基因組DNA文庫的構(gòu)建基因組DNA文庫（GenomicDNAlibrary）:是指將某種生物的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械切割法切成適當(dāng)長度的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞，形成克隆。匯集某種生物全部遺傳信息（基因組DNA中所有序列信息）的重組DNA分子的克隆總和，就稱為該生物基因組DNA文庫?？捎糜诒４婺撤N生物的全部基因、分離特定的基因片段和全基因組序列測定、分析等。構(gòu)建基因組DNA文庫需考慮的問題

代表性和隨機(jī)性

代表性是指文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可以覆蓋整個(gè)基因組，即可以從該文庫中分離任何一段DNA。代表性是衡量文庫質(zhì)量的一個(gè)很重要的指標(biāo)。在文庫的構(gòu)建過程中采用了兩個(gè)策略提高文庫的代表性：一、采用部分酶切或機(jī)械隨機(jī)切割的方法來消化DNA，以保證克隆的隨機(jī)性，保證每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等；二、提高文庫所含基因組DNA的總?cè)萘?，通常用覆蓋基因組的倍數(shù)來衡量。為預(yù)測一個(gè)完整基因組文庫應(yīng)包含克隆的數(shù)目，Clark和Carbon于1975年提出如下的計(jì)算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一個(gè)完全基因組文庫所應(yīng)該包含的重組克隆個(gè)數(shù)p：表示所期望的目的基因在文庫中出現(xiàn)的幾率f：表示重組克隆平均插入片段的大小和基因組DNA大小的比值人的基因組為3×109bp，p=0.99，插入片段平均大小為1.7×104bp，則f=1.7×104/3×109；N=8.1×105

即要有8.1×105個(gè)重組克隆才能包括99%的基因組例如：基因組DNA文庫的構(gòu)建流程

基因組DNA文庫的構(gòu)建程序包含5個(gè)部分：①大片段DNA克隆載體的準(zhǔn)備；②

高純度大分子量基因組DNA（HighMolecularWeightDNA，HMWDNA）的提取；③HMWDNA的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離；④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；⑤重組克隆的挑取、驗(yàn)證和保存。第三節(jié)

RNA基本操作技術(shù)（TechniquesforRNAManipulation）一、總RNA的提取二、mRNA的純化三、cDNA的合成四、cDNA文庫的構(gòu)建五、文庫的篩選一、總RNA的提取細(xì)胞中的總RNA包括信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)以及一些非編碼的小RNA。一個(gè)典型的動(dòng)物細(xì)胞約含有10-5μgRNA，其中rRNA占80%~85%，tRNA和非編碼小RNA占15%~20%，mRNA占1%~5%。按照提取試劑的種類來分，可分為：異硫氰酸胍法、鹽酸胍法、異硫氰酸胍-苯酚法。

Trizol試劑是使用最廣泛的抽提RNA專用試劑。主要由異硫氰酸胍和苯酚組成，可以迅速破壞細(xì)結(jié)構(gòu)，使存在于細(xì)胞質(zhì)及核內(nèi)的RNA釋放出來，并使蛋白質(zhì)與RNA分子分離，還能保證RNA的完整性。常用