分離工程第七章

第七章色譜In1903，俄國植物學(xué)家MichaelTsweett’sWork(seeBer.Deut.Botan.Ges.,1906;24:384).Chromatography=(chromatus=color,graphein=towrite).A、圖形包含的意義B、分離機(jī)制C、柱效D、分離度紙層析第一節(jié)

色譜學(xué)基礎(chǔ)

1、一般過程2、分類3、名詞術(shù)語4、理論

4.1、塔板理論

4.2、速率理論

4.3、分離度

4.4、定性分析

4.5、定量分析

4.6、定量方法

5 應(yīng)用:違禁藥物分析丁卡因N-烯丙基原嗎啡概念與原理層析：根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動(dòng)速度的不同而進(jìn)行分離的方法。原理：互不相溶的兩相分別稱為固定相和流動(dòng)相，固定相填充與柱中，在一端（入口）加入一定量的料液后，連續(xù)輸入流動(dòng)相，料液中的溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間發(fā)生擴(kuò)散傳質(zhì)，產(chǎn)生分配平衡。分配系數(shù)m大的溶質(zhì)在固定相上存在的幾率大，隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度小。這樣，溶質(zhì)之間由于移動(dòng)速度的不同而得到分離，在層析柱出口處各個(gè)溶質(zhì)的濃度變化如前圖所示。1 色譜一般過程組件及過程：A 色譜柱(column)：B 固定相(stationaryphase)：C 流動(dòng)相(flowphase)：D 洗脫液(elution)：E 檢測(cè)器(detector)：F 部分收集器(portioncollector)2 色譜分類

1)、按應(yīng)用的目的A、制備性色譜(preparationChromatography)：工業(yè)規(guī)模，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模B、分析性色譜(analyticalChromatography)：GC、LC、HPLC、TLC等。

2)、按流動(dòng)相A、GC:

氣-固色譜法(固定相為固體)

氣-液色譜法(將不揮發(fā)的液體固定在適當(dāng)?shù)墓腆w載體上作為固定相)B、LC

液-固色譜(固定相為固體)

液-液色譜(液體固定相固定在適當(dāng)?shù)墓腆w上)

3)、按色譜的展開形式A、柱色譜法B、毛細(xì)管色譜法C、平板色譜法：硅膠板色譜、紙色譜2 色譜分類4)、按展開程序A)、洗脫法：料液中的溶質(zhì)根據(jù)其在固定相和流動(dòng)相中的分配行為的不同，在柱出口處被展開形成相互分離的色譜峰。B)、頂替法：與A相似，不同在于：采用的洗脫液中含有與固定相的親和力比料液中各個(gè)組分都大的物質(zhì)（稱頂替劑），它將料液中所有溶質(zhì)按其與固定相的親和力的大小不同從柱中按次序出來。適于大量處理稀溶液。C)、迎頭法：與一般的固定床吸附操作相同，大量料液連續(xù)輸入到層析柱中，直到在出口處發(fā)生溶質(zhì)穿透，只有最先穿透的（分配系數(shù)大OR??？）組分能以純粹的狀態(tài)得到部分回收，之后的流出液均為雙組分或多組分的混合物。最常見的是A，本章主要討論的內(nèi)容。5)、按原理分類2 色譜分類國際通用色譜法分類及其縮寫

3 色譜的名詞術(shù)語分配系數(shù)m：式中，cs和cm分別為組份在固定相和流動(dòng)相中的濃度。m類型：A、B型曲線是一條典型的吸附等溫線，吸附色譜法屬于這類曲線。C和D型吸附等溫線很少遇到。C曲線為線性分配等溫線。線性色譜：溶質(zhì)濃度低時(shí)，m為常數(shù)時(shí)的色譜意義：容易理解，溶質(zhì)流過色譜柱時(shí)，m大的組份通過色譜柱所需要的時(shí)間長(zhǎng)，m小的組份需要的時(shí)間短；當(dāng)樣品中各組份在兩相的m不同時(shí)，就能實(shí)現(xiàn)差速遷移，達(dá)到分離的目的。Why?3 色譜的名詞術(shù)語色譜術(shù)語：A、基線：B、峰高：色譜峰頂與基線間的垂直距離，以h表示。

C、保留值：死時(shí)間tm：不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間。因?yàn)槲镔|(zhì)不被固定相吸附，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相的流動(dòng)速度相近：保留時(shí)間tr：試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間tr’：.3 色譜的名詞術(shù)語tr的表達(dá)：時(shí)間單位(如s,d,h),距離單位(如cm)，體積(ml,l)表示。tr意義：色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組份的tr常受到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保留體積等參數(shù)進(jìn)行定性檢定。D、死體積VM：指色譜柱內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和，當(dāng)后兩項(xiàng)很小而可忽略不計(jì)時(shí)，VM可由tm與流動(dòng)相體積流速F0(ml/min)計(jì)算：E、保留體積VR：指從進(jìn)樣開始到被測(cè)組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過的流動(dòng)相體積。保留體積與tr的關(guān)系如下：F、調(diào)整保留體積V’R：某組份VR扣除VM后，稱該組份的V’R

，即3 色譜的名詞術(shù)語G、相對(duì)保留值2,1：某組份2與組份1的調(diào)整保留值之比，即： 由于2,1只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無關(guān)，因此，它是色譜法中，如GC、HPLC中，廣泛使用的定性數(shù)據(jù)。

注意：2,1絕不是兩個(gè)組份保留時(shí)間或保留體積之比在定性分析中，通常固定一個(gè)色譜峰作為標(biāo)值(s),然后再求其它峰(i)對(duì)這個(gè)峰的相對(duì)保留值。此時(shí)r,i

可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常選擇一對(duì)最難分離的物質(zhì)對(duì)，將它們的相對(duì)保留值作為重要參數(shù)。在這種特殊情況下，可用符號(hào)a表示：

式中t’r,2為下一峰的調(diào)整保留時(shí)間，所以這時(shí)a總是大于1。3 色譜的名詞術(shù)語H)、分配比k,即容量因子：意義：色譜柱對(duì)組份保留能力的重要參數(shù)k與m的關(guān)系：4)、區(qū)域?qū)挾壬V主峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素。度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法：A、標(biāo)準(zhǔn)差：0.607倍峰高處峰寬的一半。B、半峰寬Y1/2：峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬。它與的關(guān)系為C、基線寬度Y：色譜兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距。它與的關(guān)系是3 色譜的名詞術(shù)語色譜曲線反映出的重要信息：A、根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以斷樣品中所含組份的最少數(shù)；B、根據(jù)色譜峰的保留值(或位置)，可以進(jìn)行定性分析；C、根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析；D、依據(jù)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，評(píng)價(jià)色譜柱分離效能；E、色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù)。4 色譜理論

兩組份完全分離必須滿足：A、兩組份的分配系數(shù)必須有差異；B、區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)小于區(qū)域分離的速度；C、在保證快速分離的前提下，提供足夠長(zhǎng)的色譜柱。它不僅應(yīng)說明組份在色譜柱中移動(dòng)的速率，而且應(yīng)說明組份在移動(dòng)過程中引起區(qū)域擴(kuò)寬的各種因素。塔板理論和速率理論均以色譜過程中分配系數(shù)恒定為前提，故稱為線性色譜理論。速率理論對(duì)色譜分離條件的選擇具有實(shí)際指導(dǎo)意義，因此本節(jié)將重點(diǎn)介紹

4.1 塔板理論

塔板模型:

將色譜柱視為精餾塔，即色譜柱是一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板高(platehigh)為H。假設(shè)在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達(dá)到分配平衡，然后隨著流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的方式向前轉(zhuǎn)移。對(duì)一長(zhǎng)為L(zhǎng)的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：

n稱為理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨塔板高H的增大而減小。n與半峰寬及峰底的關(guān)系式為:

式中tr(或Y1/2)應(yīng)采取同一單位(時(shí)間或距離)。上式示：在tR一定時(shí)，如果色譜峰越窄，則說明n越大，H越小，柱效能越高。4.1 塔板理論在實(shí)際工作中，按上式計(jì)算出來的n和H值有時(shí)并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因?yàn)椴捎胻R計(jì)算時(shí)，沒有扣除死時(shí)間tM，所以，常用有效塔板數(shù)n有效表示柱效：有效塔板高為：

例1

已知某組分峰的峰底寬為40S，保留時(shí)間為400S，計(jì)算此色譜柱的理論塔板數(shù)。例2

已知一根1米長(zhǎng)的色譜柱的有效塔板數(shù)為1600塊，組份A在該柱上的調(diào)整保留時(shí)間為100秒，試求A峰的半峰寬及有效塔塔板高度。4.2 速率理論

1956年，荷蘭學(xué)者范姆特（vanDeemter）等人在研究氣液色譜時(shí)，提出了色譜過程的動(dòng)力學(xué)理論——速率理論。他們吸收了塔板理論中塔板高的概念，并同時(shí)考慮影響塔板高的動(dòng)力學(xué)因素，指出：填充柱的柱效受分子擴(kuò)散、傳質(zhì)阻力、載氣流等因素的控制，從而較好地解釋了影響塔板高的各種因素。 譜峰擴(kuò)寬受三個(gè)動(dòng)力學(xué)因素的控制，即渦流擴(kuò)散，分子擴(kuò)散項(xiàng)，傳質(zhì)阻力項(xiàng)。這樣,上述塔板高方程表示 式中，A、B、C為常數(shù)，分別代表分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、渦流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)和傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。由上式知，當(dāng)一定，只有當(dāng)A、B、C較小時(shí)，H才能小，柱效才會(huì)高。反之則柱效低，色譜峰擴(kuò)張。4.3 色譜分離度

柱效n

衡量柱效的指標(biāo)是n(或neff)，柱效則反映了色譜分離過程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。選擇性 為洗脫峰相臨的兩種溶質(zhì)的容量因子之比.分離度 圖是兩相鄰組份在不同色譜條件下的分離情況。a）中兩組份沒有完全分離。b）和c）中兩組份完全分離，前者的柱效雖不高，但選擇性好；后者的選擇性較差，但柱效高。由此可見，單獨(dú)用柱效或柱選擇性并不能真實(shí)地反映組份在色譜柱中的分離情況，所以，在色譜分析中，需要引入分離度(RS)這一概念。4.3 色譜分離度分離度也稱分辨度。它是指相鄰兩色譜保留值之差與兩峰底寬平均值之比，即一般來說，當(dāng)Rs<1時(shí)，兩峰總有部分重疊；當(dāng)Rs=1時(shí)，兩峰能明顯分離；Rs>1.5時(shí)，兩峰才能完全分離。當(dāng)然，更大的Rs值，分度效果會(huì)更好，但會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。利用上式，可以直接從色譜圖上計(jì)算分離度。但該式?jīng)]有體現(xiàn)影響分離度的諸因素。而下式清楚地指出了，分離度受柱效n、選擇性x和容量因子k三個(gè)參數(shù)的控制：意義4.3 色譜分離度意義：第一，增加塔板數(shù)，可以增加分離度，若通過增加柱長(zhǎng)來增加塔板數(shù)，就會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。所以，設(shè)法降低塔板高H，才是增大分離度的最好方法。第二，加大容量因子可以增加分離度，但是會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間，至造成譜帶檢測(cè)困難。一般來說，當(dāng)k>10時(shí)，分離度的提高并不明顯；而當(dāng)k<2時(shí)，洗脫時(shí)間會(huì)出現(xiàn)極小值。因此，在色譜分離中，通常將k控制在2——7之間。第三，選擇性參數(shù)的微小增大，都會(huì)使分離度得到較大的改善。當(dāng)

>2時(shí)，即使在很短的時(shí)間內(nèi)，組份也會(huì)完全分離。當(dāng)

1時(shí)，要完成分離，必須增加柱長(zhǎng)，延長(zhǎng)分析時(shí)間。例如，為了達(dá)到同樣的分離度，當(dāng)

=1.01時(shí)，所需的時(shí)間是

=1.1時(shí)的84倍。顯然，當(dāng)

=1時(shí)，無論怎樣提高柱效，加大容量因子等，Rs均為零。在這種情況下，兩組份的分離是不可能的。4.4 定性分析

制備性色譜定性分析特異性檢測(cè)4.4 定性分析

分析性色譜定性分析1st

在色譜條件一定時(shí)，任何一種物質(zhì)都有確定的保留時(shí)間。2nd 相對(duì)保留值2,1：.4.5 定量分析

定量依據(jù) 在一定色譜條件下，組份i的質(zhì)量(mi)或其在流動(dòng)相中的濃度，與檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)（峰面積Ai或峰高h(yuǎn)i

）成正比： 式中fiA和fih是絕對(duì)校正因子。峰高測(cè)量峰面積測(cè)量1st

自動(dòng)測(cè)量：2nd

手工測(cè)量：手工測(cè)量的有關(guān)計(jì)算峰面積公式為 對(duì)于對(duì)稱的峰，近似計(jì)算公式為 對(duì)于不對(duì)稱的峰的近似計(jì)算公式為 式中Y0.15和Y0.85

分別是峰高0.15和0.85處峰寬值.峰面積的大小不易受操作條件如柱溫、流動(dòng)相的流速、進(jìn)樣的速度等的影響，從這一點(diǎn)來看，峰面積更適于作為定量分析的參數(shù)。4.4 定性和定量分析

定量校正因子1st

絕對(duì)校正因子

組份峰面積和峰高的絕對(duì)校正因子分別為：

由此可見，絕對(duì)校正因子是指某組份通過檢測(cè)器的量與檢測(cè)器對(duì)該組份的響應(yīng)信號(hào)之比。

存在問題： 很明顯，絕對(duì)校正因子受儀器及操作條件的影響很大，偶然誤差和系統(tǒng)誤差較多，故其應(yīng)用受到限制。解決之道：相對(duì)校正因子4.4 定性和定量分析

2nd

相對(duì)校正因子 指組份i與基準(zhǔn)組份s的絕對(duì)校正因子之比，即 式中fAis和fhis分別為組份的峰面積和峰高相對(duì)校正因子，fAs和fhs分別為基準(zhǔn)組份s的峰面積和峰高絕對(duì)校正因子。 必須注意，相對(duì)校正因子因量綱(相當(dāng)于同身寸尺)。 絕對(duì)校正因子很少使用，一般文獻(xiàn)上提到的是相對(duì)校正因子。 優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)校正因子消除了偶然誤差和系統(tǒng)誤差較.3rd

相對(duì)響應(yīng)值 也叫相對(duì)應(yīng)答值，即相對(duì)靈敏度，當(dāng)計(jì)量單位相同時(shí)，它們與相對(duì)校正因子互為倒數(shù)：4.6 定量方法

外標(biāo)法1st

作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

將欲測(cè)組份的純物質(zhì)配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛扰c待測(cè)組份相近，然后取固定量的上述溶液進(jìn)行色譜分析，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品的對(duì)應(yīng)色譜圖，以峰高或峰面積對(duì)濃度作圖。這些數(shù)據(jù)應(yīng)是一個(gè)通過原點(diǎn)的直線。2nd

定量分析 測(cè)定時(shí)，在完全相同的條件下，取制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)同樣量的試樣分析，測(cè)得該試樣的響應(yīng)訊號(hào)后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查出其百分含量。3rd

優(yōu)點(diǎn) 操作簡(jiǎn)單，因而適于工廠控制分析和自動(dòng)分析4th

存在問題 結(jié)果的準(zhǔn)確度取決于進(jìn)樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。4.6 定量方法

內(nèi)標(biāo)法1st

方法：

A、測(cè)定相對(duì)校正因子：已知樣品+一定量標(biāo)準(zhǔn)物，然后進(jìn)行色譜分析。根據(jù)被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物在色譜圖上相應(yīng)的峰面積(或峰高)測(cè)定相對(duì)校正因子。

B、測(cè)定樣品含量：未知樣品+一定量?jī)?nèi)標(biāo)物/基準(zhǔn)物.4.6 定量方法：

2nd

優(yōu)點(diǎn)

內(nèi)標(biāo)法是通過測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及欲測(cè)組份的峰面積的相對(duì)值來進(jìn)行計(jì)算的，因而可以在一定程度上消除操作條件等的變化所引起的誤差。3rd內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)： 在試樣中增加了一個(gè)內(nèi)標(biāo)物，這常常給分離造成一定的困難。4th內(nèi)標(biāo)法的條件

A、內(nèi)標(biāo)物必須是待測(cè)試樣中不存在的；

B、內(nèi)標(biāo)峰應(yīng)與試樣中各組份的峰分開，并盡量接近欲分析的組份。5 應(yīng)用:違禁藥物分析樣品準(zhǔn)備1st100mghairwashedby0.3%Tween20aqeoussolution.2ndhairwascutintosmallfragmentsincubated12hin2ml0.25MHCl3rdtheincubationmixturewasneutralisedbyNaOH4thsolutionwasextractedintoorganicphaseof63%heptane+19%dichloro-methane+18%dichloro-ethane.5thevaporatedbyastreamofairandtheresidueresissolvedinasuitablesolvent.

2、按層析的分離機(jī)理分類

（1）排阻層析(exclusionchromatography)

利用凝膠層析介質(zhì)(固定相)交聯(lián)度的不同所形成的網(wǎng)狀孔徑的大小，在層析時(shí)能阻止比網(wǎng)孔直徑大的生物大分子通過。利用流動(dòng)相中溶質(zhì)的分子量大小差異而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為排阻層析。

（2）離子交換層析(ionexchangechromatography)

利用固定相球形介質(zhì)表面活性基團(tuán)經(jīng)化學(xué)鍵合方法，將具有交換能力的離子基團(tuán)在固定相上面，這些離子基團(tuán)可以與流動(dòng)相中離子發(fā)生可逆性離子交換反應(yīng)而進(jìn)行分離的方法，稱之為離子交換層析。（3）吸附層析(absorptionchromatography)

利用吸附層析介質(zhì)表面的活性分子或活性基團(tuán)，對(duì)流動(dòng)相中不同溶質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，利用其對(duì)不同溶質(zhì)吸附能力的強(qiáng)弱而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為吸附層析。

（4）分配層析(partitionchromatography)

被分離組分在固定相和流動(dòng)相中不斷發(fā)生吸附和解吸附的作用，在移動(dòng)的過程中物質(zhì)在兩相之間進(jìn)行分配。利用被分