第三章基因工程所需的基本條件

1基

因

工

程選用參考書：華東理工大學(xué)張惠展2基因工程5

2

3

4

1

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7

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9

基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本條件基因工程的操作過程目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建大腸桿菌基因工程酵母基因工程哺乳動(dòng)物基因工程高等植物基因工程3第三章基因工程的基本條件C用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞B用于基因克隆的載體A用于核酸操作的工具酶4A用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶5學(xué)習(xí)內(nèi)容

重點(diǎn)討論限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶在DNA切割和連接中的應(yīng)用，并簡(jiǎn)要介紹其他與基因克隆有關(guān)的其它的重要的酶。

6限制性核酸內(nèi)切酶7一、限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。

（Restrictionendonuclease）82.性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端

自我保護(hù)作用3.功能細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1.來源910限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA進(jìn)行分解，切成小片斷。（1）限制（Restriction）11細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。（2）修飾（Modification）①Dam甲基化酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG或CCTGG序列在第二個(gè)胞嘧啶上C5位置上引入甲基1213（3）限制與修飾系統(tǒng)相關(guān)的三個(gè)基因（來自大腸桿菌K和B株）①hsd

R:編碼限制性內(nèi)切酶②hsd

M:編碼限制性甲基化酶③hsd

S:編碼限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)這類酶能識(shí)別DNA分子上的特定位點(diǎn)，并將雙鏈DNA切斷這類酶使DNA分子特定位點(diǎn)上的堿基甲基化，即起修飾DNA的作用。作用是協(xié)同上述兩種酶識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)。141973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：二、限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語表示寄主菌的物種名，組成酶的基本名稱。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus

influenzae）用Hin表示152.

如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個(gè)字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則用一個(gè)大寫字母表示此染色體外遺傳成分。如HindⅡ：d菌株

EcoRI：抗藥性R質(zhì)粒

163.

如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶的先后次序。

如HindⅡ：d菌株中發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)酶4.

所有的限制酶，除以上名稱外還要冠以系統(tǒng)名稱。限制性內(nèi)切酶的系統(tǒng)命名為R，甲基化酶為M。如R.Hind

Ⅲ表示限制性內(nèi)切酶

M.HindⅢ表示相應(yīng)的甲基化酶實(shí)際應(yīng)用中，R常被省略。17Ⅰ

型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出四種不同類型的限制性內(nèi)切酶。主要的三種：三、限制性內(nèi)切酶的類型Ⅱ

型限制性內(nèi)切酶Ⅲ

型限制性內(nèi)切酶18首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌B株和K株分離的。1.Ⅰ型限制性內(nèi)切酶的基本特性

如EcoB和EcoK。亞基R、M、S分別具有限制性內(nèi)切酶、甲基化酶和DNA特異性位點(diǎn)識(shí)別活性19（1）識(shí)別位點(diǎn)序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC未甲基化修飾的特異序列。20需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）（3）輔助因子在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約1000—1500bp處隨機(jī)切開一條單鏈，不產(chǎn)生特異片斷，應(yīng)用不大Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位點(diǎn)21首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。（1）識(shí)別位點(diǎn)序列識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型的回文結(jié)構(gòu)）。大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)與DNA的來源無關(guān)，即沒有種的特異性。2.Ⅱ類限制性內(nèi)切酶的基本特性

分離的第一個(gè)酶是HindⅡ基因工程用途最大22稀有切割限制酶（rarecutter）可以識(shí)別6個(gè)以上的核苷酸序列的少數(shù)的限制內(nèi)切酶。如Not

I

（GCGGCCGC）某些限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列中，某一個(gè)或兩個(gè)堿基并非嚴(yán)格專一。如HindⅡ可識(shí)別4種核苷酸序列：

Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-23EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端（2）切割位點(diǎn)切開雙鏈DNA，形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識(shí)別位點(diǎn)處24含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：[1]粘性末端（stickyends，cohensiveends）?。?’端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）ⅱ）3’端凸出（如Pst

I切點(diǎn)）255‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C

…5’OHPOHPⅰ）5’端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）265‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPⅱ）3’端凸出（如Pst

I切點(diǎn)）27i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個(gè)平齊末端容易得多。[2]粘性末端的意義①連接便利2829B末端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。A

末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。②末端標(biāo)記③補(bǔ)平成平齊末端30[3]平齊末端（bluntend）在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上同時(shí)切割5’-GATATC-3’3’--5’CTATAG如EcoR

V31PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘

…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘

…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

[3]平齊末端（bluntend）在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上同時(shí)切割32[4]平齊末端的特點(diǎn)連接困難，連接效率低，只有粘性末端連接效率的1%，這種連接常出現(xiàn)多聯(lián)體連接。粘性末端與平齊末端連接的處理方法?。┨硌a(bǔ)法：利用DNA聚合酶Ⅰ(klenowfragment）將堿基添補(bǔ)到目的基因的粘性末端上。33ⅱ）削除(平)法利用S1和Bal31等核酸酶將目的基因粘性末端的單鏈突出部分削去，使其成為平齊末端34不同來源的酶，識(shí)別相同的序列，切割方式相同或不同。識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同如HindⅢ

和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’[5]同裂酶（Isoschizomer)①完全同裂酶：35XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：36識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bgl

Ⅱ、Bcl

I、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。[6]同尾酶(Isocaudamers）375’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來的酶識(shí)別。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBgl

Ⅱ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBgl

ⅡSau3A38限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性和切割效率，稱為星號(hào)（*）活性。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。

[7]限制酶的酶活性①星號(hào)（*）活性39EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時(shí)可識(shí)別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時(shí)候要特別注意！740②誘發(fā)星號(hào)（*）活性的原因ⅰ）高甘油含量ⅱ）內(nèi)切酶用量過大ⅲ）低離子強(qiáng)度ⅳ）高pHⅴ）含有機(jī)溶劑，如乙醇ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二價(jià)陽離子的存在酶量不宜過多，盡量遵循生產(chǎn)商推薦的反應(yīng)條件41在離它的不對(duì)稱識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。移動(dòng)切割（shiftedcleavage):GACGCNNNNNHga

ICTGCGNNNNNNNNNN5’3’[8]Ⅱs型限制性內(nèi)切酶42（3）Ⅱ型限制性內(nèi)切酶不具有甲基化功能Ⅱ型酶的甲基化修飾活性由相應(yīng)的甲基化酶承擔(dān)。它們識(shí)別相同的DNA序列，但功能不同。如EcoRI限制性內(nèi)切酶和EcoRI甲基化酶前者：5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’后者：5’-GAA*TTC-3’

3’-CTT*AAG-5作用的位點(diǎn)也不相同43（4）II型限制性內(nèi)切酶對(duì)單鏈DNA的切割定義為切割雙鏈DNA，但有一些還可以特異識(shí)別并切割單鏈DNA的相應(yīng)位點(diǎn)，只是切割效率比較低如：HhaⅠ切割單鏈DNA比切割雙鏈DNA效率低50％443.Ⅲ類限制性內(nèi)切酶

在完全肯定的位點(diǎn)切割DNA，但反應(yīng)需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG45核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性特性

Ⅰ類內(nèi)切酶Ⅱ類內(nèi)切酶Ⅲ類內(nèi)切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特異性位點(diǎn)識(shí)別序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC

回文序列（Ⅱs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG46切割位點(diǎn)在距離識(shí)別位點(diǎn)至少1000bp處隨機(jī)切開一條單鏈位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近距寄主特異性位點(diǎn)3’端24－26bp處酶催轉(zhuǎn)換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)識(shí)別未甲基化的序列進(jìn)行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用十分有用用處不大47四、限制性內(nèi)切酶酶解反應(yīng)條件1.標(biāo)準(zhǔn)酶解體系的建立

一個(gè)單位（U）的限制性內(nèi)切酶定義：

在合適的溫度和緩沖液中，在20μl的反應(yīng)體系中，1h完全酶解1μgDNA所需要的酶量。推薦：稍過量的酶（2-5倍）和較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間482.酶解過程

配酶解體系混勻反應(yīng)終止酶解結(jié)果鑒定49①酶解體系一般20μl，保證酶液體積不超過反應(yīng)總體積的10%前提下，盡量降低反應(yīng)總體積。加樣順序一般是：ddH2ObufferDNA酶

50大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM

低鹽酶100mM

中鹽酶150mM

高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hrDTT：二硫蘇糖醇51②混勻移液槍吹打或手指輕彈管壁若底物分子很大（如基因組DNA），應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩。混勻后微量高速離心機(jī)進(jìn)行短暫離心，使管壁液體全部下沉。52③反應(yīng)終止三種方法：ⅰ)加乙二胺四乙酸（EDTA）至終濃度10mmol/L;加十二烷基硫酸鈉（SDS）至終濃度0.1%(W/V)ⅱ)65℃加熱20min或者70℃加熱10minⅲ)酚/氯仿抽提螯合Mg2+53④酶解結(jié)果鑒定快速進(jìn)行微型瓊脂糖凝膠電泳觀察然后決定是否終止反應(yīng)54酶切后發(fā)現(xiàn)除了目的DNA條帶外，還有其它條帶酶存在“星號(hào)”活性，造成非特異性切割；不正確的操作，導(dǎo)致其它內(nèi)切酶污染；底物DNA中可能存在其它DNA污染。電泳后電泳條帶擴(kuò)散，電泳條帶移動(dòng)距離異常

底物DNA不純；內(nèi)切酶不純；酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結(jié)合在一起使電泳條帶移動(dòng)距離異常553.限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA分子的消化

1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)Ⅱ型限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。CTTAAGGAATTC（1）內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合模式

56內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開12341234（2）完全消化57只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度、增大反應(yīng)體積或減少酶量可達(dá)到局部消化的目的。123414（3）局部消化58（4）幾種常用限制酶識(shí)別位點(diǎn)59604.限制性內(nèi)切酶酶解反應(yīng)中的注意事項(xiàng)

①大多數(shù)廠家供應(yīng)的限制內(nèi)切酶為濃縮液1U的酶液足以在1h內(nèi)消化10μgDNA，酶和底物比例2-10U/ugDNA,避免使用過高的酶濃度②濃縮液使用前可用1×限制酶緩沖液稀釋③限制性內(nèi)切酶在含50%的甘油的緩沖液中，于-20℃穩(wěn)定保存61DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。1.DNA的純度五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素①純化DNA②加大酶的用量，1ugDNA用10U酶③延長(zhǎng)保溫時(shí)間④擴(kuò)大反應(yīng)體積（>20l）一般采取62需要合適的底物：底物（DNA）純度要高.不能含有RNA和蛋白質(zhì);也不能含有過高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有機(jī)試劑。DNA的濃度不宜過高，高濃度的DNA會(huì)使溶液的粘度增加從而抑制酶分子的擴(kuò)散導(dǎo)致酶切反應(yīng)不徹底。常為50ul內(nèi)含1ugDNA。63大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2.DNA的甲基化程度DNA腺嘌呤甲基化酶（DNAadeninemethylas,dam)（修飾GATC中的A）；DNA胞嘧啶甲基化酶（DNAcytosineethylas,dcm)（修飾CCA/TGG的C）。基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。64不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。每微克DNA用1～5單位的酶，保溫1~2小時(shí)。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065Apy

IBstE

IIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.溫度65是影響限制酶活性的重要因素4.緩沖液(Buffer)（1）緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強(qiáng)度Tris-HCl：維持pH,大多數(shù)為7-7.6二硫蘇糖醇（DTT）：防止酶氧化,保持酶穩(wěn)定性牛血清白蛋白（BSA）等：中性蛋白質(zhì),防止酶在低濃度的蛋白質(zhì)溶液中變性商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液66（2）兩種或兩種以上的酶切割DNA樣品①在相同的緩沖液中反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行②若需要不同的緩沖液,采用3種方法ⅰ)先用要求低離子強(qiáng)度的酶切割（低鹽酶）,再加NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度,并用第二種酶切割（高鹽酶）；ⅱ)先用一種酶切割,然后用2.5倍體積的乙醇沉淀酶解產(chǎn)物,

再重懸于另一種緩沖液中進(jìn)行第二種酶切割；ⅲ)使用所有限制性酶的通用buffer,如KGB(谷氨酸鉀

buffer),經(jīng)適當(dāng)稀釋可達(dá)到各種限制性酶要求的buffer條件。67練習(xí)題何為限制性內(nèi)切酶？有哪些類型，各有什么作用和特點(diǎn)什么是限制性內(nèi)切酶的星號(hào)活性？受哪些因素影響？限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是【】

Ａ修復(fù)自身的遺傳缺陷

Ｂ促進(jìn)自身的基因重組

Ｃ強(qiáng)化自身的核酸代謝

Ｄ提高自身的防御能力

Ｅ補(bǔ)充自身的核苷酸消耗

68DNA連接酶69從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口DNA連接酶70DNA連接酶:一種能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶1967年，世界上數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶。

71（1）大腸桿菌連接酶1.兩種共價(jià)連接DNA限制片段的DNA連接酶只能連接粘性末端，背景低，準(zhǔn)確性高二、DNAligase的特點(diǎn)（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端；還能連接齊平末端72（1）必須是兩條雙鏈DNA（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件73DNA連接酶的基本性質(zhì)將DNA雙鏈上相鄰的3’羥基和5’磷酸基團(tuán)共價(jià)結(jié)合形成磷酸二酯鍵，并使之修復(fù)T4-DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick74（4）DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mM，pH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃，4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1mgl-DNA（Hind

Ⅲ片段）所需的酶量。75如何連接由限制性內(nèi)切酶切割形成片斷的末端？76連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。四、連接反應(yīng)的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2.實(shí)用溫度所以一般采用4~16C77增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少同一個(gè)分子末端自我連接的現(xiàn)象。1.DNA末端的濃度五、影響連接反應(yīng)的因素10~20倍2.插入片段與載體的濃度比例兩種構(gòu)型：線狀分子和環(huán)狀分子與DNA濃度及DNA分子長(zhǎng)度相關(guān)783.反應(yīng)溫度黏性末端：12～16℃平頭末端：10～20℃4.ATP濃度一般，ATP最適的終濃度為0.5mmol/L.ATP濃度高至5mmol/L，影響平頭末端的連接ATP濃度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平頭末端的連接。79六、DNA連接的反應(yīng)體系酶切純化后的DNA片斷連接緩沖液DNA連接酶80從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多。七、平頭雙鏈DNA片段的連接操作81加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）

加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)

加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用

加入單價(jià)陽離子（NaCl），最終濃度150-200mM提高平頭末端連接效率的方法包括：DNA聚合酶8283DNA聚合酶（DNApolymerase)能在引物和模板的存在下，把脫氧核糖多核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’－OH末端，催化核苷酸的聚合作用.84一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶7.TaqDNA聚合酶851.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’－OH端2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。86DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較871.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)DNAPolIKlenowfragment(76KD）

枯草桿菌蛋白酶實(shí)際上是大腸桿菌DNA聚合酶IC端大片段，由Klenow通過枯草桿菌蛋白酶位點(diǎn)特異性降解而得三、DNA聚合酶在基因工程中的用途88①3’端補(bǔ)平5’5’klenow②DNA3’末端標(biāo)記補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow（2）主要用途893’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種-32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA限制性內(nèi)切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h90③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物91（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)2.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化，由噬菌體基因43編碼。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解單鏈更快）。①來源②酶活性92③特點(diǎn)A當(dāng)沒有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。B如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。C在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。935’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’94（2）T4DNA聚合酶的用途標(biāo)記末端（取代合成法或置換合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的dNTP。①補(bǔ)平隱蔽末端②DNA3’末端標(biāo)記95酶切中間產(chǎn)生兩個(gè)末端標(biāo)記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片斷T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’內(nèi)切酶切無dNTPsDNA修飾酶9697一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1.來源小牛胸腺。2.組成大小兩個(gè)亞基。3.特性5’3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）98②不需要模板?、傩枰?’—OH、二甲胂酸緩沖液。③底物可以是單鏈DNA、是3’—OH突出的雙鏈DNA、平末端需Co2+激活，但反應(yīng)效率低。④隨機(jī)添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP

，末端轉(zhuǎn)移酶994.末端轉(zhuǎn)移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。外源DNA載體DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉(zhuǎn)移酶100（2）再生酶切位點(diǎn)便于回收克隆片斷。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow補(bǔ)平101AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端轉(zhuǎn)移酶dTTPAAAAAA外源DNA102（3）DNA3’－OH末端標(biāo)記AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位點(diǎn)HindⅢ位點(diǎn)連接催化非放射性或放射性標(biāo)記物摻入DNA片斷的3’端。（生物素-11-dUTP等）103

二、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細(xì)菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。1042.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH堿性磷酸酶3.堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體份子自我連接105單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶5’5’5’106A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能與脫磷酸的載體OH連接。107ATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個(gè)nick，但轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會(huì)被修復(fù)。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA108第五節(jié)核酸外切酶（Exonucleases）是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解核苷酸的酶。一、單鏈DNA外切酶1.大腸桿菌核酸外切酶I（exoI）5’3’外切識(shí)別5’-OH2.大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’3’、3’5’外切識(shí)別3’-OH、5’-P109二、雙鏈DNA外切酶1.核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’5’外切識(shí)別3’-OH主要用途：在DNA雙鏈的末