第五章黃酮類化合物(2012級(jí))

（Flavonoids）第五章黃酮類化合物※黃酮類化合物在中草藥中的存在：槐米、陳皮、黃芩、葛根、銀杏葉等；※在植物體內(nèi)，黃酮類化合物一部分與糖結(jié)合成苷，另一部分則以游離形式存在；※黃酮類化合物多具有顏色；※生理活性多樣。本章內(nèi)容

第一節(jié)概述

第二節(jié)理化性質(zhì)

第三節(jié)提取與分離

第四節(jié)結(jié)構(gòu)測(cè)定一、基本結(jié)構(gòu)二、分類三、存在形式

第一節(jié)

概述

一、基本結(jié)構(gòu)2-苯基色原酮C6-C3-C6

第一節(jié)

概述

黃酮類化合物是泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)（A-與B-環(huán)）通過(guò)中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物。定義:結(jié)構(gòu)特征具有高度共軛體系——為基本生色團(tuán)，且母核上有-OH或-OCH3

取代（助色團(tuán)）;符合C6-C3-C6

基本骨架;均屬酚類衍生物。（查耳酮）（二氫黃酮）解氨酶

桂皮酰羥化酶丙二酰輔酶A

AB苯丙氨酸桂皮酰輔酶A

生物合成的基本途徑同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證明：A環(huán)來(lái)自于三個(gè)丙二酰輔酶A，B環(huán)則來(lái)自于桂皮酰輔酶A。同時(shí)證明：間苯三酚并不是黃酮類化合物生物合成的前體化合物。1.C環(huán)開(kāi)環(huán)：稱查耳酮(Chalcone)

五元環(huán)：橙酮3.B環(huán)連在C3位：稱異黃酮(Isoflavone)2.C2，C3飽和：即加“二氫”，稱二氫黃酮(Flavanone)二、分類

根據(jù)中央三碳鏈的差異

4.C3位有無(wú)-OH，有：為黃酮醇(Flavonol)

無(wú)：為黃酮(Flavone)5.4-C=O被還原：稱黃烷類如：黃烷-3,4-二醇，黃烷-3-醇6.其它類：花色素類、口山酮類、高異黃酮類、雙黃酮類等二、分類

根據(jù)中央三碳鏈的差異

二、分類

根據(jù)中央三碳鏈的差異

（1）黃酮類（8）二氫查耳酮類（2）黃酮醇類（9）橙酮類（3）二氫黃酮類（10）花色素類（4）二氫黃酮醇類（11）黃烷醇類（5）異黃酮類（12）雙苯吡酮類（6）二氫異黃酮類（13）高異黃酮類（7）查耳酮類

（14）其他黃酮類

（1）黃酮類黃酮類：是以2-苯基色原酮為基本母核，3位無(wú)含氧取代的一類化合物。

典型化合物：

芹菜素黃芩素黃芩苷川陳皮素芹菜素:5,7,4`-三OH

芹菜苷:-7-O-芹糖

OHOHOH黃芩素:5,6,7-三OH川陳皮素:5,6,7,8,3`,4`-六OCH3OHOHOHOCH3OCH3OCH3OCH3OCH3OCH3D-ApiOHOH(2)黃酮醇類：黃酮基本母核的3位上連有羥基或其他含氧基團(tuán)。典型化合物：山柰酚、槲皮素蘆丁、楊梅素OOOH槲皮素:3,5,7,3`,4`-五OHOHOHOHOHOH山柰酚:3,5,7,4`-四OHOHOHOHOH二氫黃酮：黃酮基本母核的2、3位雙鍵被氫化而成。(3)二氫黃酮典型化合物：橙皮素、橙皮苷、甘草素、甘草苷二氫黃酮類（Flavanones）OO如橙皮中的橙皮素和橙皮苷；甘草中的甘草素和甘草苷。橙皮素R=H橙皮苷R=蕓香糖OOOHROOCH3OH甘草素R=H甘草苷R=glcOOHOOR(4)二氫黃酮醇：是黃酮醇類的2、3位被氫化的黃酮醇類化合物，而且常與相應(yīng)的黃酮醇共存于同一植物中。

二氫黃酮醇類（Flavanonols）OOOH典型化合物：二氫槲皮素二氫桑色素OOHOOHOHOHOHOOHOOHOHOHHO黃柏葉中具有抗癌活性的黃柏素-7-O-葡萄糖苷也屬于二氫黃酮醇類。黃柏素-7-O-葡萄糖苷OOOOHOHOHglcOH（6）異黃酮異黃酮類：母核為3-苯基色原酮的結(jié)構(gòu)，即B環(huán)連接在C環(huán)的3位上。異黃酮類（Isoflavanone）OO典型化合物：

大豆素、大豆苷、大豆素-7，4′-二葡萄糖苷、葛根素和葛根素木糖苷常存在于豆科植物葛根。大豆素R1=R2=R3=H大豆苷R1=R3=HR2=glc葛根素R2=R3=HR1=glc大豆素-7，4’-二葡萄糖苷R1=HR2=R3=glc葛根素木糖苷R1=glcR2=xylR3=HOOOR3R1R2O（6）二氫異黃酮

異黃酮基本母核的2、3位被氫化。二氫異黃酮類（Isoflavanones）OO典型化合物：紫檀素三葉豆紫檀苷高麗槐素魚(yú)藤酮

如：中藥廣豆根-----抗癌活性毛魚(yú)藤----------殺蟲(chóng)和毒魚(yú)紫檀素R=CH3三葉豆紫檀苷R=glc高麗槐素R=H魚(yú)藤酮OROOOOOOOOCH3OCH3O（7）查耳酮查耳酮:兩苯環(huán)之間的三碳鏈為開(kāi)鏈結(jié)構(gòu)，即三碳鏈不構(gòu)成環(huán)。查耳酮類（Chalcones）如:紅花的花中含有的紅花苷紅花苷OHOOHOHOOHglc（8）二氫查耳酮

查耳酮αβ雙鍵氫化而成

二氫查耳酮類（Dihydrochalcones）OHO如：蘋果種仁中含有的梨根苷。梨根苷OHOHOOHOglc（9）橙酮橙酮(噢口弄類):C環(huán)為含氧五元環(huán)。母核碳原子的編號(hào)也與其他黃酮類不同。橙酮類OCHO12345671'2'3'4'5'6'如:在黃花波斯菊花中含有的硫磺菊素屬于此類。硫磺菊素OCHOHOOHOH12345671'2'3'4'5'6'（10）花色素結(jié)構(gòu)特點(diǎn):基本母核的C環(huán)無(wú)羰基，1位氧原子以（金羊）鹽形式存在。

花色素類（Anthocyanidins）O+OH如:矢車菊苷元、飛燕草苷元以及它們所組成的苷最為常見(jiàn)。矢車菊苷元R1=OHR2=H飛燕草苷元R1=R2=OH天竺葵苷元R1=R2=HO+OHHOOHR1OHR2（11）黃烷醇類根據(jù)C環(huán)上的3，4位存在羥基的情況分為黃烷-3-醇和黃烷-3，4-二醇。1.黃烷-3-醇類，又稱兒茶素類黃烷三醇類（Flavan-3-ols）OOH如兒茶素：中藥兒茶中的主要成分，有四個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，但在植物中主要有異構(gòu)體兩個(gè)，兒茶素和表兒茶素。兒茶素表兒茶素2.黃烷-3，4-二醇類,又稱無(wú)色花色素類黃烷－3，4－二醇類（Flavan-3,4-diols)OOHOH在含鞣質(zhì)的木本植物和蕨類植物。

如：無(wú)色矢車菊素。

無(wú)色矢車菊素OOHHOOHOHOHHOH（12）雙苯吡酮類

又稱為苯駢色原酮，母核由苯環(huán)和色原酮的2，3位駢合而成，是一種特殊類型的黃酮類化合物。OO常分布龍膽科、藤黃科、百合科植物中

如：芒果葉和知母葉中的異芒果素

-----具有止咳去痰作用。異芒果素OOHOHOOHOHHOCH2OHHOOH（13）高異黃酮

基本母核為3-芐基色原酮高異黃酮類（Homoisoflavones）OO3（14）其他黃酮類

包括雙黃酮類，黃酮木脂體類，生物堿型黃酮等。裸子植物：銀杏素銀杏素OOOHCH3OOCH3OOOHHOOH2’-羥基查耳酮(深黃色)二氫黃酮(無(wú)色)各類別間存在一定的轉(zhuǎn)化關(guān)系三、存在形式

多以苷存在：O-苷，C-苷糖的種類單糖：D-Glc,D-Gal,L-Rha,L-Ara,D-GluA,D-Xyl

等雙糖：Glcβ1→2glc，Glcβ1→6glc，

Rhaα1→6glc等三糖：Glcβ1→2glc

β1→2

glc，

Glcβ1→6glc

β1→2

fru等酰化糖：2-乙酰葡萄糖、咖啡?；咸烟堑?。糖的連接位置①O-糖苷:如:黃酮醇類,3-,7-,3’-,4’-單糖鏈苷；或3,7-,3,4’-,7,4’-雙糖鏈苷。②C-糖苷:

通常以6-位或8-位連接，例如：牡荊素牡荊素常見(jiàn)取代基：

-OH，-OCH3，-CH3，異戊烯基，亞甲氧基取代基的位置：

-OH，-OCH3等含氧基團(tuán)：A環(huán)：5，7位

B環(huán)：3‘，4’位

烷基：A環(huán)：6，8位

B環(huán)：3‘位

第二節(jié)

理化性質(zhì)

本節(jié)內(nèi)容一性狀

二溶解性

三酸堿性

四顯色反應(yīng)晶形：苷元多為結(jié)晶，少數(shù)苷為無(wú)定形粉末顏色：與分子中是否存在交叉共軛體系及助色團(tuán)(-OH，-OCH3等)的種類、數(shù)目以及取代位置有關(guān)。一性狀色原酮2-苯基色原酮

黃酮(醇)及其苷類——灰黃～黃色查耳酮——黃～橙黃色，二氫黃酮(醇)——無(wú)色異黃酮——顯微黃色花色素及其苷元——紅（pH＜7）紫（pH＝8.5）藍(lán)（pH＞8.5）

二溶解性

游離苷元：易溶于有機(jī)溶劑，難溶于水

苷類：可溶于水、乙醇、甲醇水溶度：苷元＜苷苷連糖數(shù)目多，水溶度大苷元：黃酮(醇)、查耳酮二氫黃酮(醇)花色素平面型分子非平面型分子離子水溶性增大

三酸堿性（一）酸性來(lái)源：游離Ar-OH

強(qiáng)弱：與Ar-OH數(shù)目、位置有關(guān)例:黃酮酸性規(guī)律溶于NaHCO3NaOH水液Na2CO3或Ca(OH)2水液7,4`-二OH>7-OH或4`-OH>Ar-OH>5-OH>3-OH此性質(zhì)可用于提取、分離。(PH梯度洗脫)(二)堿性強(qiáng)酸下形成洋鹽堿性

黃酮類化合物分子中-吡喃酮環(huán)上的1-位氧原子，因有未共用的電子對(duì)，故表現(xiàn)微弱的堿性，可與強(qiáng)無(wú)機(jī)酸，如濃硫酸、鹽酸等生成（金羊）鹽，但生成的（金羊）鹽不穩(wěn)定，加水可分解。

四顯色反應(yīng)

(一)還原反應(yīng)(二)金屬鹽類絡(luò)合反應(yīng)(三)硼酸顯色反應(yīng)(四)堿性試劑顯色反應(yīng)HCl--Mg反應(yīng)HCl—Zn反應(yīng)NaBH4反應(yīng)鋁鹽、鉛鹽、鋯鹽、鎂鹽、二氯化鍶、三氯化鐵氨蒸氣Na2CO3(一)還原反應(yīng)

1、HCl-Mg(Zn)反應(yīng)

—鑒定黃酮類化合物最常用的顏色反應(yīng)一般黃酮（醇）、二氫黃酮（醇）顯紅～紫紅色，少數(shù)顯紫～蘭色操作：樣品/乙醇中加入少許鎂粉振搖，滴加幾滴濃HCl，即1~2分鐘可顯色（必要時(shí)加熱）。（1）同類化合物，當(dāng)B環(huán)上有OH，OCH3取代時(shí)，呈現(xiàn)的顏色亦隨之加深。（2）查耳酮、橙酮、兒茶素不顯色，異黃酮除個(gè)別例外，一般不顯色。（3）個(gè)別黃酮化合物不呈色。二氫黃酮類/EtOH2％NaBH4/MeOH濃HCl紅～紫色(一)還原反應(yīng)

2、NaBH4反應(yīng)

—二氫黃酮類化合物專屬性較高的反應(yīng)2.NaBH4(K)反應(yīng)

NaBH4

是二H黃酮的專屬試劑，其它黃酮

類化合物均不顯色，可與之區(qū)別。

KBH4

反應(yīng)顏色:紅~紫色反應(yīng)機(jī)理:（二）金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)絡(luò)合應(yīng)具備的條件：以上任一結(jié)構(gòu)都可以與一些金屬鹽生成有色絡(luò)合物常用金屬鹽試劑有:1.鋁鹽常用1%AlCl3或Al(NO3)3

乙醇(甲醇)液黃酮的絡(luò)合物為黃色,有熒光。應(yīng)用:（1)定性：鑒別是否為黃酮化合物。（2）定量：將黃酮化合物與AlCl3反應(yīng)后有最大吸收峰，用于定量。2、鉛鹽常用1%PbAc2或Pb(OH)Ac水溶液，黃酮類可與生成水不溶性沉淀(黃~紅色)

沉淀顏色與酚OH數(shù)目、位置有關(guān)PbAc2：只能與分子中具有鄰二酚OH或兼有3－OH、4－酮基或5－OH、4－酮基結(jié)構(gòu)的化合物反應(yīng)生成沉淀。Pb(OH)Ac：沉淀能力大，與一般酚OH均可與之沉淀。可用于提取分離、鑒定3．ZrOCl2（鋯鹽）

5-OH黃酮類3-OH2%枸櫞酸

黃（3-OH黃酮）褪色（5-OH黃酮）2%ZrOCl2黃甲醇3-OH，4-酮基絡(luò)合物穩(wěn)定性＞5－OH，4-酮基絡(luò)合物（二氫黃酮醇除外）原因：＞4、鎂鹽常用1%MgAc2

甲醇溶液方法：在紙上滴一滴供試液，噴以醋酸鎂的甲醇液，加熱干燥，在UV光下觀察。應(yīng)用：二H黃酮（醇）顯天藍(lán)色熒光，若有區(qū)分C5－OH，色澤更為明顯。其它黃酮類顯黃~橙黃~褐色。

5.氯化鍶（SrCl2）

——鑒別鄰二OH具鄰二酚OH黃酮類/氨性甲醇

綠色～棕色乃至黑色↓6、三氯化鐵反應(yīng)酚OH顯色反應(yīng)，無(wú)專屬性但一般僅在含有氫鍵締合的酚羥基時(shí)，才呈現(xiàn)明顯的顏色。

1、4、6反應(yīng)可在試管或紙片上進(jìn)行。（三）硼酸顯色反應(yīng)有該結(jié)構(gòu)的黃酮為正反應(yīng)（亮黃色）

5-OH黃酮（醇）

包括

2`-OH查耳酮在與硼酸生成不同顏色OHO例：草酸中：顯黃色并具綠色熒光

檸檬酸（丙酮）中：只顯黃色無(wú)熒光應(yīng)用：該反應(yīng)可將上述三類黃酮與其它類別黃酮相區(qū)別（四）堿性試劑顯色反應(yīng)1.黃酮類的鑒別：日光或UV光下，通過(guò)紙斑反應(yīng)，觀察試樣用氨蒸氣或其它堿性試劑處理后的顏色變化情況，對(duì)于鑒別黃酮類化合物有一定意義。2.鑒定二氫黃酮類與查耳酮：

二氫黃酮無(wú)色查耳酮橙－黃色二氫黃酮類易在堿液中開(kāi)環(huán)，轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的異構(gòu)體－查耳酮類化合物，顯橙－黃色。3.黃酮醇與其它類型黃酮相區(qū)別：黃酮醇類在堿液中先呈黃色，通入空氣后變?yōu)樽厣?，?jù)此可與其它黃酮類區(qū)別4.黃酮類化合物如分子中有鄰二酚OH或C3，C4`-二OH取代時(shí)，在堿液中不穩(wěn)定，易氧化，顏色變深，由黃色－深紅色－綠棕色沉淀。

第三節(jié)黃酮類化合物的提取與分離

一、提?。ㄒ唬┐痔幔ǘ┚贫?、分離

一、提取（一）粗提存在形式：花、葉、果等組織中——苷木部堅(jiān)硬組織中——游離苷元選擇溶劑：①黃酮苷，極性稍大的苷元

——丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水、甲醇-水（1：1）、甲醇③花青素類——可加少量酸（如

0.l％鹽酸）④黃酮苷元——宜用極性較小的溶劑（氯仿、乙醚、醋酸乙酯）等提取②多糖苷類——沸水提取

對(duì)粗提取物可進(jìn)行精制處理，常用的方法有：

一、提取

（二）精制①溶劑萃取法②堿提取酸沉淀法③炭粉吸附法①溶劑萃取法1．醇浸液、去脂溶性色素——加石油醚２．水提取液去除水雜質(zhì)（蛋白質(zhì)、多糖等）

——加多倍量濃醇醇浸液除去親脂性雜質(zhì)水提取除去水溶性雜質(zhì)醇液醇液①溶劑萃取法②堿提取酸沉淀法

適合酸性成分——具有Ar-OH的黃酮

此法適用于含量高的已知黃酮成分如：rutin(蘆丁)10~20%

baicalin(黃芩苷)4~5%

常用該法

hesperdin(橙皮苷)4~5%黃酮苷類雖有一定極性，可溶于水，但卻難溶于酸性水，易溶于堿性水，故可用堿性水提取，再于堿水提取液中加入酸，黃酮苷類即可沉淀析出。此法簡(jiǎn)便易行。如：槐米中蘆丁的提取見(jiàn)教材P182例如：從槐花米提取蘆丁過(guò)程

槐花米→加6倍量水→煮沸→以石灰乳調(diào)pH=8-9→微沸30min→趁熱過(guò)濾→殘?jiān)偎笠淮巍喜纱螢V液→60-70℃時(shí)以濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=4-5→靜置24小時(shí)→抽濾→水洗至中性→60℃干燥得粗品蘆丁→沸水重結(jié)晶→70-80℃干燥得純品蘆丁。藥材堿水液

H+

OH-

沉淀（黃酮苷，苷元）

水（水雜，M+）操作流程：應(yīng)當(dāng)注意：（1）堿液濃度不宜過(guò)高，以免在強(qiáng)堿性下，尤其加熱時(shí)會(huì)破壞黃酮母核。（2）酸化時(shí)，酸性也不宜過(guò)強(qiáng)，以免生成（金羊）鹽，致使析出的黃酮類化合物又重新溶解，降低產(chǎn)品收率。（3）藥料中含有大量果膠、粘液等不溶性雜質(zhì)時(shí)，如花、果類藥材，宜用石灰乳或石灰水代替其它堿性水溶液進(jìn)行提取，以使上述含羥基的雜質(zhì)生成鈣鹽沉淀，不致溶出。這也有利于黃酮類化合物的純化處理。（三）炭粉吸附法——適于苷類的精制甲醇粗提液活性炭

黃酮—活性炭

沸水

沸甲醇

7％酚/水

15%酚/醇

二、分離（一）柱色譜法（二）梯度pH萃取法（一）柱色譜法

（1）硅膠柱色譜柱色譜法（2）聚酰胺柱色譜

（3）葡聚糖凝膠(Sephadexgel)柱色譜（1）硅膠柱色譜適于分離異黃酮，二H黃酮（醇）及高度甲基化（或乙?；┑狞S酮（醇）類少數(shù)情況下，硅膠加水去活性后，也可用來(lái)分離某些極性較大的黃酮（2）聚酰胺柱色譜黃酮、酚類、醌類吸附原理：H鍵吸附理論特點(diǎn)：吸附強(qiáng)度主要取決于黃酮類化合物分子中羥基的數(shù)目與位置及溶劑與黃酮類化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力的大小。影響聚酰胺吸附化合物能力的因素：

1.與所采用溶劑的類型有關(guān)

2.與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)——酚OH數(shù)目及位置有關(guān)酚OH數(shù)目：苷元不同時(shí)，聚酰胺吸附能力為：黃酮醇>黃酮>二H黃酮醇>異黃酮，洗脫能力則相反酚OH位置：酚OH不能形成分子內(nèi)H鍵吸附>能形成分子內(nèi)H鍵

>黃酮類化合物從聚酰胺柱上洗脫時(shí)有下列規(guī)律：①苷元相同，洗脫先后順序一般是：三糖苷雙糖苷單糖苷苷元②母核上增加羥基，洗脫速度減緩。羥基數(shù)目相同時(shí)，洗脫先后為：具有羰基鄰位羥基黃酮具有羰基對(duì)（或間）位羥基黃酮③不同類型黃酮化合物，先后流出順序一般是：異黃酮二氫黃酮醇黃酮黃酮醇實(shí)例④分子中芳香核、共軛雙鍵多者則吸附力強(qiáng)，所以查耳酮往往比相應(yīng)的二氫黃酮難于洗脫。如：（3）葡聚糖凝膠(Sephadexgel)柱色譜常用型號(hào)：Sephadex-G型

Sephadex-LH20型原理：(1)分離苷元：吸附強(qiáng)弱

(2)分離苷：分子篩作用洗脫劑：甲醇、乙醇、堿水、含水丙酮等

（3）葡聚糖凝膠(Sephadexgel)柱色譜常用型號(hào)：Sephadex-G型

Sephadex-LH20型原理：(1)分離苷元：吸附強(qiáng)弱

(2)分離苷：分子篩作用洗脫劑：甲醇、乙醇、堿水、含水丙酮等

洗脫先后順序：分離游離黃酮主要是吸附作用，極性小大順序洗脫。分離黃酮苷類，主要是分子篩作用，分子量大小順序洗脫?？偟南疵擁樞颍禾嵌嗟能仗巧俚能沼坞x苷元（極性小大）（二）梯度pH萃取法原理：酸性強(qiáng)弱不同方法：有機(jī)溶劑溶解，堿水梯度萃取溶劑堿性：弱強(qiáng)苷元出柱順序：酸性強(qiáng)弱Example第四節(jié)黃酮類化合物的檢識(shí)與

結(jié)構(gòu)鑒定目前主要采用的方法有：①與標(biāo)準(zhǔn)品或與文獻(xiàn)對(duì)照PC或TLC得到的Rf或hRf值（Rf100）②分析對(duì)比樣品在甲醇溶液中及加入診斷試劑后得到的UV光譜③1H-NMR④13C-NMR⑤MS1.紙色譜

(1)常用溶劑系統(tǒng)（展開(kāi)劑）醇性BAW(n-BuOH-HAc-H2O)4:1:5

TBA(t-BuOH-HAc-H2O)3:1:1

水飽和的n-BuOH等水性H2O、

不同濃度的：2%醋酸、15%醋酸等

3%NaCL、HAC-濃HCL-H2O30:3:3一、色譜法在黃酮類化合物鑒定中的應(yīng)用

(2)不同極性溶劑中Rf值的比較

a.在醇性展開(kāi)劑中不同苷元時(shí):平面性分子Rf值>非平面型分子同類型苷元時(shí):苷元Rf值>單糖苷>雙糖苷

即：醇性溶劑展開(kāi)時(shí)，①同一類型苷元，羥基越多，Rf越小。②羥基被甲氧基取代，Rf增大。③醇性溶劑展開(kāi)時(shí)，羥基糖苷化，極性增大，Rf下降。①②③用酸水展開(kāi)時(shí)，上述順序顛倒。

b.在水性展開(kāi)劑中(極性大的化合物Rf值大）不同苷元時(shí):平面性分子Rf值<非平面型分子同類型苷元時(shí):苷元Rf值<單糖苷<雙糖苷如:BAW4:1:5Rf值quercetin>rutin15%HAcquercetin<rutin

(3)顯色①UV下觀察，可見(jiàn)有色班點(diǎn)，氨蒸氣處理后常有明顯的顏色變化。②顯色劑

1~2%AlCl3(MeOH)（UV）

或1%FeCl3-1%K3Fe(CN)61:1水液混合物的鑒定常用雙向色譜法：第一向：醇性溶劑展開(kāi)，例如BAW系統(tǒng)，（分配作用原理進(jìn)行分離）第二向：水類溶劑展開(kāi)，例如2-6%醋酸水，化合物極性大，吸附弱。（吸附作用原理進(jìn)行分離）2.薄層色譜（TCL）⑴硅膠TLC－鑒定與分離弱極性化合物。⑵聚酰胺TLC－適用范圍廣，特別適合分離含游離酚羥基的黃酮及其苷類。

(1)硅膠TLC

常用展開(kāi)劑：分離黃酮苷元：甲苯-甲酸甲脂-甲酸5:4:1CHCl3-MeOH8.5:1.5分離黃酮苷元的衍生物：苯-丙酮9:1苯-醋酸乙酯（7.5:2.5）

(2)聚酰胺TLC

常用展開(kāi)劑：

a.含水極性溶劑：不同濃度的含水乙醇（形成H鍵）

b.親脂性有機(jī)溶劑：分配色譜原理乙醇-水-乙酰丙酮(2:4:1)

苯-甲酮-丁酮(6:2:2)(3)顯色劑同PC顯色劑二、紫外及可見(jiàn)光譜在黃酮類鑒定

中的應(yīng)用測(cè)定黃酮類化合物的UV吸收光譜，對(duì)結(jié)構(gòu)的鑒定有特殊意義特點(diǎn)：1.用量少

2.用特殊試劑使黃酮母核上官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，提供取代基的位置或數(shù)量的信息一般程序：

1．測(cè)定樣品甲醇液的UV光譜2．測(cè)定樣品甲醇液+診斷試劑后的UV光譜3．若為苷類→水解，或甲基化后水解→測(cè)苷元或衍生物的UV光譜

（一）黃酮類化合物在甲醇溶液中的UV光譜特征在多數(shù)黃酮類化合物在UV光譜中有兩個(gè)主要吸收帶，即在200~400nm區(qū)域內(nèi)有兩個(gè)吸收帶帶Ⅱ220~280nm帶Ⅰ300~400nm

1.黃酮及黃酮醇類

兩者譜形相似，但帶Ⅰ位置不同帶Ⅱ帶Ⅰ

黃酮240~280nm

304~350nmI<350nm

黃酮醇240~280nm

352~385nmI>350nm3-OR240~280nm328~357nm木犀草素(黃酮類)槲皮素(黃酮醇類)

黃酮及黃酮醇類UV光譜（甲醇）①表5-8:說(shuō)明母核氧取代程度升高,則帶Ⅰ紅移.

②表5-8:帶Ⅱ的峰位主要受A環(huán)氧取代程度的影響，取代程度升高,則帶Ⅱ紅移；B環(huán)的取代對(duì)其峰位影響甚微，但可影響它的形狀。③若OH甲基化或苷化,引起相應(yīng)吸收帶,尤其帶Ⅰ紫移.

④若OH乙?；?原來(lái)酚OH對(duì)光譜的影響全消除.

規(guī)律：2.查耳酮及橙酮類

共同特點(diǎn):帶Ⅰ很強(qiáng)為主峰，帶Ⅱ?yàn)檩^弱，為次強(qiáng)峰。帶Ⅱ帶Ⅰ

查耳酮220~270

340~390

橙酮220~270

3.異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇

共同特點(diǎn):帶Ⅱ強(qiáng)吸收為主峰,帶Ⅰ很弱，常在主峰的長(zhǎng)波方向有一肩峰。帶Ⅱ帶Ⅰ

異黃酮245~270二氫黃酮(醇)270~295診斷試劑：

因黃酮中具有酚羥基、羰基，加入某些試劑，使其化學(xué)結(jié)構(gòu)變化，吸收峰位改變，這些試劑稱為診斷試劑。(二)加入診斷后引起的位移及其在結(jié)構(gòu)測(cè)

定中的意義以黃酮及黃酮醇為例一般程序:1.測(cè)定樣品在MeOH中UV吸收光譜-原始譜帶

2.加入診斷試劑后測(cè)定UV及可見(jiàn)光譜常用的診斷試劑:①甲醇鈉;②醋酸鈉(熔融及未熔融);③醋酸鈉/硼酸;④三氯化鋁及三氯化鋁/鹽酸

①甲醇鈉:a.檢查黃酮(醇)中游離3-OH或4`-OH

有4`-OH帶Ⅰ+40~60nm,峰強(qiáng)度不下降有3-OH帶Ⅰ+50~60nm,峰強(qiáng)度減弱

b.檢查黃酮(醇)中游離3,4`-OH體系或

3,3`,4`-三OH等對(duì)堿敏感的OH，其產(chǎn)生吸收峰,強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)而遞減.②醋酸鈉(未熔融)NaOAc比NaOMe

的堿性弱,只能使強(qiáng)酸性O(shè)H離子化,檢查7-OH,3-OH,4`-OHa.7-OH存在,帶Ⅱ+5~20nmb.4`-OH存在,無(wú)3-OH或7-OH取代時(shí),帶Ⅰ在長(zhǎng)波一側(cè)有明顯的肩峰。醋酸鈉(熔融)堿性提高,表現(xiàn)與NaOMe

類似效果.③NaOAc/H3BO3

NaOAc與H3BO3的混合物用于檢識(shí)黃酮母核上的所有鄰二酚OH

a.若B環(huán)有鄰二酚OH存在,則帶Ⅰ+12~30nmb.若A環(huán)有鄰二酚OH存在（但不包括5,6－位），則帶Ⅱ+5~10nm

④AlCl3及AlCl3/HCl(1)AlCl3與含3-OH或5-OH的黃酮(醇)以及鄰二酚OH螯合,使吸收峰紅移

(2)由于AlCl3形成絡(luò)合物的穩(wěn)定性為:3-OH

>5-OH

>鄰二酚OH∴酸水存在下穩(wěn)定破壞螯合不螯合但MeOH中加數(shù)滴酸水仍穩(wěn)定

AlCl3/HCl譜圖＝AlCl3譜圖則結(jié)構(gòu)中無(wú)鄰二酚OHAlCl3/HCl譜圖≠AlCl3譜圖則結(jié)構(gòu)中可能有鄰二酚OHa.若B環(huán)有鄰二酚OH存在則帶Ⅰ紫移30~40nmb.若A.B環(huán)可能有鄰二酚OH,則帶Ⅰ紫移50~65nmAlCl3/HCl譜圖＝MeOH譜圖，示無(wú)3-及/或5-OHAlCl3/HCl譜圖≠M(fèi)eOH譜圖，示可能有3-及/或5-OHa若只有5-OH存在,帶Ⅰ+35~55nmb只有3-OH存在,帶Ⅰ+60nmc可能同時(shí)有3及5-OH,帶Ⅰ+50~60nm

d若除5-OH外,尚有6-O取代,則帶Ⅰ+17~20nm說(shuō)明：（1）+NaOMe或NaOAc,OHONa，變?yōu)殡x子化合物，共軛系統(tǒng)中的電子云密度增加，紅移另有3,4’-OH或3,3’,4’-OH時(shí)，在NaOMe作用下易氧化破壞，故峰有衰減。（2）NaOAc為弱堿，僅使酸性較強(qiáng)者，如7,4’-OH解離。（3）AlCl3及AlCl3/HCl形成絡(luò)合物的能力：①黃酮醇3-OH>黃酮5-OH（二氫黃酮5-OH）>鄰二酚羥基>二氫黃酮醇5-OH

②鄰二酚羥基和二氫黃酮醇5-OH在酸性條件下不與

AlCl3絡(luò)合；但不在酸性條件下，五者皆與Al3+絡(luò)合；形成絡(luò)合物越穩(wěn)定，紅移越多。三、氫核磁共振在黃酮類結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用1H-NMR已成為天然黃酮類化合物結(jié)構(gòu)分析的一種非常重要的方法測(cè)定方法:1.直接測(cè)定法:常用CDCl3,DMSO-d6，氘代吡啶做溶劑。

2.間接測(cè)定法:即將黃酮類化合物作成三甲基硅醚衍生物，四氯化碳作溶劑。（OHOSi(OCH3)3）1．A環(huán)質(zhì)子

（1）5，7-二羥基取代δH-85.70～6.90（1HdJ=2.5Hz）δH-65.70～6.90

（1HdJ=2.5Hz）H-6較高場(chǎng)歸納黃酮類化合物H-NMR的規(guī)律（2）7-羥基取代δH-5

7.90～8.20（1HdJ=9.0Hz）δH-66.70～7.10

（1HddJ=2.5HzJ=9.0Hz）δH-86.70～7.00（1HdJ=2.5Hz）２．B環(huán)質(zhì)子（1）4’-O-R取代B環(huán)質(zhì)子分別為H-2’，6’及H-3’，5’兩組，構(gòu)成AA`BB`系統(tǒng)，可粗略看AB偶合系統(tǒng)，出現(xiàn)在δ6.50~7.90處，大體上位于比A環(huán)質(zhì)子稍低的磁場(chǎng)區(qū)。（表5-14）（2）3’，4’-O-R取代δH-5’6.70～7.10（1HdJ=8.5Hz）

δH-2’7.20～7.90（1HdJ=2.5Hz）δH-6’7.20～7.90

（1HddJ=2.5HzJ=8.5Hz）

（3）

3`,4`,5`-三OR3`,4`,5`-為三OH時(shí):H-2`,6`

δ6.5~7.5S

3`或5`-OH甲基化或苷化時(shí):H-2`,6`d

3．

C環(huán)質(zhì)子

其所示特征是區(qū)別各類黃酮類化合物的主要依據(jù)。1)黃酮醇黃酮

H-3δ6.3~6.8S(尖單峰)

2)異黃酮類

H-2位于C=O的β位，通過(guò)碳與氧相接，故以單峰（S）出現(xiàn)在比一般芳香質(zhì)子較低磁場(chǎng)區(qū)δ7.6~7.8ppm

3)二氫黃酮(醇)

二氫黃酮ABX系統(tǒng)H-2與兩個(gè)磁不等同的H-3偶合，故作為一個(gè)雙二重峰出現(xiàn)，中心位于δ5.20處。兩個(gè)H-3因有相互偕偶及H-2的鄰偶，將分別作為一個(gè)雙峰出現(xiàn)，中心位于δ2.80處。但往往相互重疊。二氫黃酮醇H-2及H-3分別作為一個(gè)二重峰出現(xiàn)。H2（δ4.90）H3（δ4.30）兩質(zhì)子互為反式4)查耳酮及橙酮類芐氫:δ6.50-6.70(1H,s)

δ6.37-6.94(1H,s,DMSO-d6)查耳酮橙酮δ7.30~7.70δ6.70~7.40(四)糖上的質(zhì)子1.單糖苷成苷后，糖端基質(zhì)子C-1”-H

與其他H比較。一般在較低磁場(chǎng)區(qū)。見(jiàn)P198，表5-17。原因:1)由苷鍵O原子上電子與苷元P-π共軛

2)糖上C1與O()相連吸電子,使C1缺電子,致使H-1上電子云密度降低多,H-1共振峰在較低磁場(chǎng)區(qū)出現(xiàn).

A.成苷位置不同,糖端基質(zhì)子的化學(xué)位移不同例.黃酮醇類3–O-糖苷4`,5,7-O-糖苷

δ低場(chǎng)一些5.70~6.0ppm4.8~5.2ppm

B.與糖的種類有關(guān)例.黃酮醇–3-Oglc苷黃酮醇-3-O-rha苷

H-1δ5.7-6.0ppm5.0~5.1ppm

2.雙糖苷苷元-O-糖-O-糖

直接與苷元相連的端基質(zhì)子共振峰在稍低磁場(chǎng)(化學(xué)位移稍大)末端糖的端基質(zhì)子因離黃酮母核較遠(yuǎn)，受到的負(fù)屏蔽影響相對(duì)較小，化學(xué)位移稍小(共振峰在較高磁場(chǎng))(五)6-及8-C-CH3δ

2+

且6-C-CH3質(zhì)子恒定地出現(xiàn)在較

8-C-CH3質(zhì)子稍高場(chǎng)0.2ppm如：異黃酮6-C-CH3：

δ2.04~2.27

8-C-CH3:δ2.14~2.45(六)乙酰氧基的質(zhì)子

——據(jù)乙酰化物進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定

化學(xué)位移應(yīng)用芳香族2.30~2.50ppm乙?；瘻y(cè)定酚OH數(shù)目脂肪族

1.65~2.10ppm由脂肪族乙酰氧基數(shù)目推測(cè)苷中結(jié)合糖的數(shù)目(七)甲氧基上的質(zhì)子苷元上一般δ3.50~4.10ppm

13C-NMR在黃酮類化合物結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用

黃酮類化合物結(jié)構(gòu)鑒定

60年代UV70年代UV1H-NMR80年代主要為13C-NMR

13C-NMR信號(hào)歸屬一般通過(guò):(1)用簡(jiǎn)單化合物（如苯乙酮、桂皮酸）及其衍生物的光譜進(jìn)行比較

(2)用經(jīng)驗(yàn)性的簡(jiǎn)單芳香化合物的取代基位移加和規(guī)律計(jì)算等方法加以解析(一)黃酮類化合物骨架類型的判斷(二)黃酮類化合物取代圖式的確定方法(三)黃酮類化合物O-糖苷中糖的連接位置(四)雙糖苷及低聚糖苷中分子內(nèi)苷鍵及糖的連接順序13C-NMR在黃酮類化合物結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用

(一)黃酮類化合物骨架類型的判斷利用中央三碳核的信號(hào)特征,推測(cè)黃酮化合物的骨架類型（見(jiàn)P200，表5-21）。另，雙黃酮類化合物中，如果分子的兩部分氧化水平不一致時(shí)，則會(huì)在不同磁場(chǎng)處出現(xiàn)兩個(gè)C=O基吸收。(二)黃酮類化合物取代圖式的確定方法

采用芳香碳原子的信號(hào)特征確定取代基的取代圖式，但不能據(jù)此確定骨架的類型。1.取代基位移的影響通常：①A-環(huán)上引入取代基，位移效應(yīng)只影響A環(huán)；②B-環(huán)上引入取代基，位移效應(yīng)只影響B(tài)環(huán)；③黃酮母核上引入5-OH時(shí)，情況特殊（A環(huán)及C2，C3，C4）。2.5，7-二羥基黃酮類中C-6及C-8信號(hào)的特征3.6位取代基和8位取代基的確定4.B環(huán)的取代基圖式(三)黃酮類化合物O-糖苷中糖的連接位置形成O-糖苷后，苷元及糖均將產(chǎn)生相應(yīng)的苷化位移。苷化位移值受以下兩因素影響：①苷元上成苷的酚OH位置；②糖的種類。1.糖的苷化位移及端基碳的信號(hào)糖上C1δ95~105左右成苷后，糖上C1則苷化位移約為+4.0~6.0ppmC1C1例:β-D-glc

96.6

α-L-rha

95黃酮