分子遺傳學第四章 基因操作

第四章基因操作

Genemanipulation

第一節(jié)堿基互補的能力

一、DNA的熱變性1．G－C含量高的DNA具有較高的熔解溫度，可以根據熔解溫度的不同將GC含量不同的DNA分子分開，并可推測DNA分子中G－C的相對含量。2．根據熔解溫度的差別在DNA分子中作基因定位和分離基因。組蛋白是與核DNA結合的堿性蛋白，富含精氨酸，其編碼區(qū)相對富含G－C對。?海膽組蛋白基因在較底溫度時（61℃）的變性電鏡圖，每種組蛋白基因被一個富含A－T對區(qū)域間隔開。用S1核酸酶處理，消除單鏈。H1H2AH3H2BH4二、互補單鏈的復性

利用互補單鏈復性的特點可以確定基因缺失的位置和大小：一個缺失突變體的DNA和一個野生型的DNA一起復性后就可確定缺失區(qū)。

ab

cdea,

b,c,d,e,abdea,b,d,e,

abcde

a,b,c,d,e,abde

a,b,d,

e,a

bcd

ea,b,d,e,HeatMixandcool三、染色體上DNA序列的定位

用特異性RNA或DNA作探針與染色體上相應的DNA互補區(qū)域作雜交，從而確定該特異性基因的位置稱染色體原位雜交（insituhybridizationofchromosome）。Insituhybridizationofhumanmetaphasechromosomesusingfluorescenttechnique(FISH)第二節(jié)限制性內切酶

一、宿主限制現象XXABX-AX-BABAB

X-AX-BX-AX-B100%100%0.002%100%PhageInfectBacteria從兩個不同菌株A和B來的噬菌體X具有不同的感染能力X-AAX-ABX-BAX-A100%100%很差無法分離到能感染A細菌的X-B來的噬菌體用很少一些感染力差的結果說明：噬菌體的宿主范圍取決于它所來源的細菌菌株，而不是噬菌體的基因型；宿主的基因型對噬菌體有一種修飾作用，但并不改變噬菌體DNA的序列。細菌的基因型決定該細菌對各種噬菌體感染的敏感性，一種噬菌體的基因型決定它所能感染細菌的范圍，它們之間具有密切的依賴和限止關系。

在不同基因型的細菌中生長的噬菌體其具有不同的感染能力二、DNA的修飾☆是什么限制了X－B噬菌體在菌株A中的繁殖呢？

是由于宿主的一種核酸酶的作用，它能將噬菌體DNA切成許多無感染力的片段，宿主細胞具有破壞其陌生DNA的防衛(wèi)系統?！钤鯓颖Ｗo宿主自身的DNA和感染性X－A噬菌體DNA免受宿主核酸酶的攻擊？

有一種酶能在特定序列上修飾特異性堿基，但是并不改變這些堿基的編碼性質。如在胞嘧啶和腺嘌呤上增加一個甲基后就能保護DNA免受核酸酶的攻擊，該過程稱甲基化作用（methylation）。在宿主限制現象中有兩個相互的過程：（1）由于宿主核酸酶的作用破壞了侵入的噬菌體DNA，從而限制了噬菌體的繁殖；（2）噬菌體DNA修飾免除了限制酶的作用。BacteriumAhasthecapacitytomodifyDNAwhereasBdoesnot

三、限制酶的特異性1970年，HamiltonSmith從流感嗜血桿菌d株分離到能識別特定核苷酸序列，切點專一的限制酶－HindII

↓

5’－G－T－Py－Pu－A－C－3’3’－C－A－Pu－Py－T－G－5’↑Smith進一步證明宿主誘導的甲基化作用保護了具有同樣序列的DNA免受HindII的切割：↓m

5’－G－T－Py－Pu－A－C－3’3’－C－A－Pu－Py－T－G－5’

m↑

**Py：pyrimidinePu：purine?E.coli的R質粒的一個基因產生的限制酶EcoRI，它對SV40病毒的環(huán)狀DNA分子上只有一個切點。

5’－G－A－A－T－T－C－3’3’－C－T－T－A－A－G－5’

上述序列是旋轉對稱的。由于切點是錯開的，因此使SV40的環(huán)狀分子切開成具有粘性末端（stickyends）的線狀分子。上述序列中腺嘌呤的甲基化也能保護DNA免受EcoRI的切割。

mm

?回文序列—palindrome↓

5’……G

A

ATTC……3’

3’……CTT

AAG……5’↑EcoRI切點的兩條鏈中的序列從相反方向閱讀是一樣的，稱為回文序列—palindrome。從正向和反向閱讀是同一句子：

ABLEWASIEREISAWELBA幾種限制酶的名稱和識別序列T↓CTAGA

AGATC↑TXbaI

C

TGCA↓G

G↑ACGTCPstI

A↓AGCTT

TTCGA↑AHindIIIGAT↓ATC

CTA↑TAGEcoRV

G↓AATTC

CTTAA↑GEcoRI

G↓GATCC

CCTAG↑GBamHI識別位點序列內切酶四、限制酶作圖1．在DNA分子上確定限制酶切點的相對順序是一種重要的染色體作圖法。從圖上任何兩個切點之間的距離可估計出核苷酸的數目。2．方法要點：特定來源的DNA經不同的酶消化后，樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，可得到限制位點的圖譜。123455,3,3,5,酶1酶21234532P32P酶1酶2Digestion1234532P1234532P32PABCDEF(a)(b)32P1234512345酶2ABC12345DEF1245酶1(a)(b)根據重疊的亞片段排列原先片段的順序亞片段位于原先片段12345ADAEBEBFCF(c)3根據重疊的亞片段排列原先片段的順序，可以得到一個DNA的酶切圖譜。1122334455DAEBFC123452121酶切位點2121酶切圖譜練習題：

從某一生物的基因組BamHI文庫中獲得了長3.0kb的片斷,如用EcoRI消化該片斷獲得1.7kb、0.9kb和0.4kb三種片斷;如用HindⅢ消化獲得1.6kb和1.4kb片斷;如用上述兩酶混合消化獲得1.2kb、0.9kb、0.5kb合0.4kb四種片斷。根據上述結果繪制限制性圖譜。要求標出EcoRI、HindⅢ和BamHI的位點和它們間的距離。第三節(jié)重組DNA

在細菌細胞中選擇性地擴增特定DNA片段的過程稱分子克?。╩olecularcloning）。重組DNA技術的基本步驟

（1）獲得目的基因，一般是有重要生物學功能的外源基因。（2）在限制性內切酶和連接酶的作用下，將目的基因與克隆載體相連接，組成一個新的重組DNA分子（recombinantDNA（3）將重組DNA分子引入受體細胞，并在細胞中進行DNA復制，最常用的受體細胞為大腸桿菌。（4）對轉化子（含有重組分子的受體細胞）進行篩選和鑒定，以確認含有外源基因。大量培養(yǎng)細胞可獲得目的基因的大量拷貝，或基因表達的產物等。一般意義上的重組DNA技術專指在細菌細胞中特異性地擴增特定DNA片段的分子克隆技術，廣義上的重組DNA技術還延伸到整個基因工程的應用領域。重組DNA技術的基本步驟

外源DNA載體重組E.coli目的基因的制備構建重組DNA分子，首先要獲得有用的目的基因片段，最常用的方法有三種：（1）直接從一生物中提取基因組DNA，并構建該基因組的文庫（genelibrary）再從中調出目的基因的克隆。（2）以mRNA為模板反轉錄合成互補的DNA，稱cDNA，并構建cDNA克隆。（3）采用聚合酶鏈反應（PCR）特異性地擴增某一目的基因的片段。細胞內總DNA的提取和基因文庫的構建各種生物的特定組織（如血液、肝臟、植物組織、細菌細胞等）都含有大分子量的DNA。由于目的基因位于整個基因組DNA中，難以檢出和分離，可以先將基因組DNA用內切酶切成較小的片段，再將它們分別與載體相連，并轉入細菌細胞中進行繁殖和擴增，再對各個不同的克隆作出檢定。非選擇性地在細菌細胞中克隆某一生物的隨機DNA片段的過程稱鳥槍法，全部克隆集合體稱某一生物的基因文庫。組成一個生物的基因文庫的全部重組質?；蛑亟M噬菌體中的目的基因就代表了一個生物的整個基因組。一、直接產生粘性末端用于組成一個新的重組DNA分子（recombinantDNA）16-2

二、加尾連接（Tailing）1．同聚物加尾?末端轉移酶（terminaltransferase）能催化DNA的3’末端加上核苷酸尾，如將dA和dT加到不同的DNA末端，就可以連接成重組質粒，polyG和polyC也可用相同方法加尾。

?同聚物加尾連接的優(yōu)點：加尾后DNA片段自身不會環(huán)化，可提高異源DNA重組率。缺點：加入的polyA和polyT可能影響基因表達；外源基因克隆擴增后不能用限制酶重新從重組質粒中切出來。TTAAAATT5,3,3,5,5,3,3,5,AAAAAAA5,3,5,3,AAAAAAATTTTTTTTTAAAAAAAAATTTTTTTTT5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,5,3,EcoRI外切酶末端轉移酶dATPshear外切酶末端轉移酶dTTPTTTTTTTTTPlasmidDNADrosophilaDNADNApolymerase,DNAligase末端轉移酶（terminaltransferase）能催化DNA的3’末端加上核苷酸尾，如將dA和dT加到不同的DNA末端，就可以連接成重組質粒2．人工接頭的應用人工接頭是一個合成的含有特定限制酶識別順序的核苷酸片段。

EcoRI

↓CCGAATTCGGEcoRI

GGCTTAAGCC

人工接頭↑

EcoRI

＋T4DAN連接酶人工接頭EcoRI外源DNA粘性末端用于連接載體人工接頭的應用

四、載體Vectors能使克隆的片段不斷復制的一類DNA分子稱載體，應具備以下特點：（1）分子量小，核苷酸序列清楚，具有一些單一酶切位點或人工插入的多克隆位點區(qū)。（2）分子中具有一個復制起始點，能使載體自身和插入的外源DNA共同復制。（3）具有易于篩選重組分子的標志，如抗藥性。

(4)比較容易從宿主細胞中回收1．質粒：

雙鏈環(huán)狀DNA分子，能經轉化導入E.celi中優(yōu)點：能使宿主細胞產生抗性，便于選擇質粒，在細胞中的拷貝數多。

Acolor-enhancedelectronmincrographofcircularplasmidmoleculesisolatedfromthebacteriumE.coli..TheplasmidpUC18offersseveraladvantagesasavactorforcloningCloningwithaplasmidvector.16-9利用LacZ基因的插入失活篩選重組子

許多載體的多克隆位點區(qū)插入在LacZ基因區(qū)中。LacZ基因編碼β-半乳糖苷酶的一個亞基，它可以使攜帶載體的細菌在含有X-gal（能被β-半乳糖苷酶水解的底物）的培養(yǎng)界上形成藍色的菌落。當外源基因插入到多克隆位點區(qū)后就阻斷了LacZ基因的編碼區(qū)，使LacZ基因失去了功能，因此，凡是插入了外源基因的重組質粒進入宿主細胞后，這些細胞就不能利用X-gal，結果在培養(yǎng)基上形成白色的菌落。挑選出白色菌落可作進一步鑒定。

APetriplateshowingthegrowthofbacterialcellsafteruptakeofrecombinantplasmids.16-6菌落原位雜交篩選和鑒定克隆的基因根據重組質粒中的目的基因的序列，合成一段與之互補的DNA序列，并使其標記上放射性同位素，該段DNA稱為探針。再用探針與菌落中的DNA進行雜交，可從許多未知的菌落中挑選出克隆有目的基因的菌落。2．λ噬菌體它的頭部通常能包裝進45kb長的DNA分子，基因組中間部分是裂解性生長的非必需區(qū)，因此在其區(qū)域內轉換插入大的外源DNA片段可以不影響其復制功能。

3．單鏈病毒在感染E.coli過程中，感染性單鏈能轉變?yōu)殡p鏈的復制型。分離這種復制型的雙鏈可用作克隆的載體。這種噬菌體用作克隆的優(yōu)點：在重新感染合適的宿主時，它產生的噬菌體顆粒是單鏈DNA，為DNA序列分析提供方便。4．表達載體ExpressionVectors具有合適的轉錄和轉譯起始信號，外源基因插入合適的區(qū)域后能夠表達的載體。某些載體質粒既具有E.coli的復制起始區(qū)，又具有動物病毒SV40的復制起點，這樣的質粒既可在E.coli中復制，又可在培養(yǎng)的動物細胞中復制，應此稱為穿梭載體。ShuttleVectors第四節(jié)重組DNA方法學

一、克隆戰(zhàn)略

1．無選擇地從一個限制酶切的混合物中克隆全部片段，然后再篩選所需的目的基因。

非選擇性地在細菌中克隆一個高等生物的隨機DNA片段的方法稱為鳥槍法（Shotgunning），全部克隆的集合體稱為一個基因文庫（genebank,orgenelibrary）。組成一個基因文庫的全部重組質粒或全部重組噬菌體代表了一個生物整個基因組。2．用一目的基因的一個探針從整個DNA酶切片段的集合體中選出合適的酶切片段，然后再克隆特定的片段。組成一個基因文庫的全部重組質?；蛉恐亟M噬菌體代表了一個生物整個基因組。二、鑒定克隆的基因1．用特定的內切酶消化重組質粒，電泳比較切出片段的大小。2．SouthernBlotting

酶切和電泳只能對重組克隆作出初步鑒定，可得知克隆片段的大小但尚難確定克隆片段是否目的基因。Southern發(fā)明了一種對電泳凝膠中的DNA作分子雜交鑒定的方法。該方法可用于重組質粒鑒定，轉基因生物中外源基因的插入位置，遺傳病的分子診斷等。單鏈DNA能結合到硝酸纖維濾膜上，酶切物經電泳后，瓊脂糖膠作變性處理，然后將DNA吸印到膜上，用32P標記的DNA或RNA探針與膜上的DNA作雜交，自顯影后可顯示出目的基因的位置和大小。TheSouthernblottingtechniquesouthernblotafterhybridization,exposure,anddevelopment.ThebandsshowDNAfragmentscomplementarytothenucleotidesequenceoftheprobe.3．用cDNA克隆作探針，從基因文庫中篩選目的基因克隆。

用反轉譯酶從mRNA制備cDNA，全部cDNA片段與質粒載體相連，轉化E.coli得到的全部克隆稱為cDNA文庫。*一個基因的cDNA克隆和genomic克隆可能在大小上有很大區(qū)別，為什么？4．直接分析克隆基因表達的蛋白在生物的不同器官和組織，或在細胞的不同的分化階段會有某些特定基因的表達，此時細胞中的特定基因會特異性轉錄成特定蛋白的mRNA，因此可用反轉錄方法獲得該基因的cDNA。用反轉錄酶從mRNA合成cDNA；全部cDNA片段與載體相連并轉入細菌細胞獲得的全部克隆稱cDNA文庫，再從cDNA文庫中調出目的cDNA克隆。

思考題：假定人生長激素基因的cDNA(1kb)已經插入在某一載體的BamHI和EcoRI的酶切位點中，該克隆大小為5kb。例舉兩種鑒定該基因的具體方法，要求寫出實驗步驟，并且用圖表示鑒定結果。

三，克隆基因的定點誘變□

意義：基因的功能通常是通過其突變體來認識其作用的。在重組DNA技術中常需研究DNA序列上特定部位的功能，或改變基因編碼區(qū)個別氨基酸的密碼子以提高該基因表達蛋白質活性等。

□定義:特異性地改變某一基因的方法稱定點誘變site-directedmutagenesis

克隆基因的定點誘變

根據基因中欲改變位點的核苷酸序列設計一段引物，引物中含有突變的堿基。在聚合酶作用下，合成一條互補的含有突變基因的鏈，將雜合雙鏈引入大腸桿菌細胞，經復制后會產生一個野生型和一個突變型基因的細胞，再用分子雜交法作鑒定。思考：如何用分子雜交法篩選和鑒定一個野生型和一個突變型基因？第五節(jié)DNA序列分析

DNA序列分析是最終了解基因結構和組成的重要工具,在人類基因組計劃中測定人基因組的全部核苷酸序列是該計劃的核心。1977年Sanger發(fā)明了以雙脫氧核苷三磷酸（2’3’ddNTPs）作為DNA合成終止劑的“末端終止法”，開創(chuàng)了基因核苷酸序列測定的先河，最早完成了Φ×174全部序列的測定。為此Sanger第二次獲得諾貝爾獎。發(fā)現了重疊基因

Sanger等最早對Φ×174病毒作DNA序列分析，該病毒基因組全長5400bp，共編碼9種蛋白質，但根據該9種蛋白質分子量推算其編碼區(qū)，明顯超過病毒基因組5400bp長的核苷酸所能編碼的容量。如何解開這個謎？Sanger回答了這個問題：在基因組中存在重疊基因！重疊基因定義：在一種蛋白質的核苷酸編碼序列中包含了另一種蛋白質的編碼序列，所不同的是各自以不同的讀碼框轉譯。Φ×174病毒的重疊基因如下：

ABCDJFGHE重疊基因概念與密碼子的非重疊性

Sanger采用獨創(chuàng)的序列分析方法對Φ×174病毒基因組作序列分析，提出了令世人驚訝的重疊基因概念，是對基因認識的重大發(fā)展。重疊基因是利用兩種不同的讀碼框架編碼兩種不同的蛋白質，在每一讀碼框中密碼子解讀仍是不重疊的。如下圖：

aa1aa2359

6061

62

63149150151152↑

ATGAGTCAA……GTTTATGGTACGCTG……GAAGGAGTGATGTAA

175189445aa1aa23

4

8990↓

基因E開始基因E終止↑基因D開始基因D終止Sanger序列分析方法原理采用單鏈DNA（或將含有外源基因的重組質粒DNA變性），在引物和DNA聚合酶的作用下，在四組獨立的反應中除加有4種dNTPs外（其中之一為同位素標記），再分別加入4種ddNTPs中的一種作為鏈延伸的終止劑，結果將在四組反應管中產生長度不等的4組寡核苷酸鏈，它們分別終止于被測鏈的每一個A、G、C或T。如在加有ddATP的反應管中產生的是一系列以A為結尾的寡核苷酸鏈；在加有ddGTP的反應管中形成的是以G為結尾一組寡核苷酸鏈等等，再經聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜和放射自顯影即可從放射自顯影膠片上讀出DNA序列。OBase

HHO=P–P–P–O

OOO

OOO2’、3’ddNTP的結構，注意其3’位置是一個H而不是OH，因此后續(xù)的脫氧核苷酸不能接到3’位上從而造成鏈的終止。SangerDNA序列分析示意圖

DNAsequencinggelshowingtheseparationoffragmentsinthefoursequencingreactions(oneperlane).InDNAsequencingusingdideoxynucleotideslabeledwithfluorescentdyes,allfourddNTPsareaddedtothesametube,andduringprimerextension,allcombinationsofchainsareproduced.16-20AutomatedDNAsequencingusingfluorescentdyes,oneforeachbase.思考題：假定某一克隆基因的部分序列為5，—TCACGTAAGT—3，，試根據Sanger序列分析方法原理畫出測定上述序列的放射自顯影示意圖，并對示意圖作必要的標注和解釋。第六節(jié)基因工程

由基因工程方法產生的生物稱為轉基因生物，它一般是指由導入外源DNA的細胞發(fā)育而成的生物。

基因工程

□

定義：根據分子生物學和遺傳學的原理，將一種生物的遺傳物質DNA轉移到另一生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達出所需要的產物。一、利用微生物基因工程生產重組基因工程藥物利用基因工程技術不但能得到大量的具有特殊功能的基因。而且可以讓這些特殊功能的基因生產出具有特殊功能的蛋白質藥物，這是目前基因工程領域中最活躍最有成果和極富商業(yè)價值的領域之一，究其原因：（1）蛋白質和多肽是基因表達的直接產物，可用重組DNA技術進行研究和生產。（2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高醫(yī)療價值的藥物，用常規(guī)分離的方法很難制取。目前有幾十種基因工程藥物，常用的有：干擾素、白細胞介素、乙肝疫苗、人胰島素和人生長激素等。人類最早的商業(yè)化基因工程藥物是人胰島素和人生長激素，于80年代初投放市場，用大腸桿菌來生產，是基因工程

發(fā)展的里程碑?！跻葝u素是治療糖尿病的重要藥物，之前從豬或牛的胰腺中提取分離，含量少而且會有毒素。□人生長激素是治療侏儒癥，青少年增高和促進創(chuàng)傷組織修復的藥物，生長激素具有種屬特異性，從動物腦組織來源的生長激素不能用于人類，之前只能從剛死亡的人大腦垂體中分離純化，來源極有限；而且發(fā)現長期應用會對人類有毒副作用。Themethodusedtosynthesizerecombinanthumaninsulin.19-15溴化氰例子大鼠肝臟F抗原蛋白基因在大腸桿菌中表達

F蛋白定位在肝細胞漿中，正常人肝組織中的F蛋白含量是血清中1370倍，只有肝細胞被破壞時，F抗原才釋放到血漿中，使血清中F抗原含量升高，

F抗原用作肝病診斷，首先需獲得純的F抗原。目前國內外大多采用生化提取的方法從人肝臟組織中分離F抗原，由于難以得到F抗原純品，給大量制備診斷試劑帶來困難。利用原核（大腸桿菌）表達系統，成功表達了大鼠肝臟F抗原，表達產物經SDS，Western-blot分析，分子量為43kD，同時具有F抗原的免疫學活性，可作為一種基因工程產品用于今后的免疫檢測工作。方法：基因克隆。提取大鼠肝臟總RNA，對其進行反轉錄和PCR（RT-PCR）擴增出目的基因（F-antigen’scDNA），然后將其與pET-15b載體進行連接，轉化大腸桿菌BL21(DE3)plyss，在含氨卞青霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上篩選轉化子。將酶切結果正確的表達質粒命名為pET15b-F。

表達載體pET15b-F構建示意圖F抗原表達經IPTG誘導后，含表達載體pET15b-F的表達菌株表達出一外源蛋白，該蛋白大小在43kD左右，與文獻報道大鼠F蛋白大小一致。且在該表達系統中得到高表達，外源蛋白表達量約占全菌總蛋白的40%。F抗原純化與鑒定

離心后所得包涵體蛋白經過初步純化和溶解后，經過親和層析柱（Ni2+-chargedIDAHis-bindcolumn）純化，得到一分子量約為43kD的單一蛋白帶（Fig.A泳道8）。表達產物的Western-blot鑒定結果顯示：該表達蛋白可與豚鼠抗人F蛋白的抗血清發(fā)生特異性結合反應，在硝酸纖維素膜上呈現一條分子量為43kD的顯色帶（Fig.B）

SDSandWestern-blotoftheexpressedFAntigen(A) 1.Proteinmolecularweightstandard;2.pET15b-FinducedbyIPTG;3.inclusionbodyofthelysate;4.supernatantofthelysate;5.pET15b-Fnon-inducedbyIPTG;6.pET-15binducedbyIPTG;7.non-plasmidinducedbyIPTG;8.purifiedtargetprotein(B)Western-blotofthepurifiedtargetprotein.GuineapigpolyclonalantiserumagainsthumanFantigenwasusedasprimaryantibody.(A)12345678(B)二、用真核細胞表達和生產基因工程藥物

雖然用大腸桿菌細胞表達基因工程藥具有許多優(yōu)點，如成本低等，但由于原核系統表達的真核基因蛋白有時缺乏生物活性，其原因由于原核生物缺乏合適的轉譯后修飾機制。因此用真核細胞表達和生產基因工程藥物已受到重視。□真核細胞反應器：外源基因在合適的載體帶動下轉染進入體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞，昆蟲細胞或酵母細胞，通過大規(guī)模培養(yǎng)細胞表達外源基因。幾種重要的基因工程藥物已可用真核細胞反應器完成治療癌癥抗病毒預防病毒性肝炎治療血友病治療貧血癥治療心臟病促生長，增強免疫功能

酵母菌酵母菌哺乳動物細胞哺乳動物細胞哺乳動物細胞昆蟲細胞

α干擾素乙肝疫苗集落刺激因子紅細胞生成素組織溶纖酶原激活劑人生長激素

應用細胞名稱

昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(InsectcellandBaculovirusExpressionSystem)

是一種高效的真核細胞表達系統桿狀病毒因其病毒粒子呈棒狀或桿狀而得名。苜蓿尺蠖核型多角體病毒(Autographacalifornica

multiple

nuclearpolyhedrosisvirus，AcMNPV)作為桿狀病毒-昆蟲細胞真核基因表達系統的載體被廣泛應用。1.幼蟲吞食了感染有多角體的食物,多角體在消化道的堿性環(huán)境下溶解，釋放出病毒顆粒，2.每個病毒顆粒的脂蛋白外被又與腸壁細胞的質膜相融合，最終將核殼體釋放至胞質中，核殼體再將自己的DNA轉入細胞核內。3.在感染后12h采用出芽方式離開宿主細胞，在跨過宿主細胞的質膜時，以宿主的質膜形成自己的外被，形成表型為出芽型病毒粒子（buddedvirus,BV），生活史

PolyhedrinProteinVirionEnvolopeNucleocapsidcross-sectionNucleocapsidLongitudinal-sectionPolyhedronenvelopeDNA-蛋白復合體由39KD衣殼蛋白外被所包圍，形成一個核衣殼，若干個核衣殼外面再包被一層脂蛋白外被就成為病毒顆粒。幾個病毒顆粒聚集成一簇，嵌在晶狀基質中成為一個多角體包含體。多角體包含體的組成?桿狀病毒基因表達的級聯式時序調控桿狀病毒的基因表達分為4個時期：極早期（immediate-early,α）、晚早期(delayed-early,β)、晚期(late,γ)和極晚期(verylate,δ)。通常，每一后續(xù)時期基因的表達水平都高于前一時期基因表達的水平，其中極晚期基因表達水平顯著提高，這也是構建桿狀病毒表達載體的基礎。如Fig所示。

FigSchematicrepresentationofthefourphasesofbaculovirusgeneexpressioninvitro多角體蛋白P10蛋白由于多角體蛋白基因及P10蛋白基因具有非常高效的啟動子，同時由于這兩個基因的產物不參與感染病毒顆粒的形成，可以從病毒基因組中去除而不會對病毒的復制及感染造成影響。由于這兩個特點，使人們得以設計利用桿狀病毒啟動子在昆蟲細胞中表達外源基因.桿狀病毒表達載體構建由于AcMNPV基因組的巨大，不可能用單一的限制性酶來對它進行操作，所以目前使用的桿狀病毒表達載體系統大多采用構建轉移載體（transfervector）的方法。將帶有外源基因的轉移載體DNA和野生型病毒DNA共轉染體外培養(yǎng)的昆蟲細胞，使得轉移載體與野生型病毒發(fā)生同源重組，外源基因取代多角體基因，如Fig所示。通過重組病毒空斑純化得到能表達外源基因的重組病毒。

TransfervecterPpClonedgenePt5,3,PolyhedringeneAcMNPVDNARecombinantAcMNPVFig.共轉染發(fā)生同源重組獲得重組病毒

野生型病毒感染的昆蟲細胞由于存在多角體基因，空斑測定時產生有多角體的空斑（occ+）。重組后由于多角體蛋白基因已被外源基因所取代，只能產生無多角體的空斑（occ-）。在光學顯微鏡下根據折光率的不同可區(qū)分這兩種不同表型的空斑。由此經過幾輪的空斑純化即可獲得多角體缺陷的重組病毒。用重組病毒感染宿主細胞，感染后期得到外源基因的高效表達。與野生型病毒共轉染培養(yǎng)的昆蟲細胞

用磷酸鈣沉淀法將重組轉移載體質粒pVL1393-hGH與野生型病毒AcMNPVDNA共轉染貼壁培養(yǎng)狀態(tài)良好的Sf9細胞，由于pVL1393多角體啟動子兩側存在與多角體基因同源序列，可與野生型病毒基因發(fā)生同源重組，從而使人生長激素基因替代野生型病毒中的多角體蛋白基因，得到重組病毒rAcV-hGH。

重組病毒的Southern雜交鑒定，hGHcDNA整合進桿狀病毒基因組的正確位置中表達產物的SDS與Western-blot分析三、植物基因工程□定義：將外源目的基因導入體外培養(yǎng)的植物組織或細胞，通過組織或細胞培養(yǎng)使之發(fā)育成完整的再生植株——轉基因植株。1.冠癭瘤——天然的植物基因工程自然界某些植物受到農桿菌的侵染會形成腫瘤——冠癭瘤。其形成的機理是由于農桿菌中含有的一種誘發(fā)腫瘤的質粒所引起的，稱為Ti質粒（tumor-inducingplasmid，簡稱Ti質粒）。Ti質粒上的一段DNA能轉移到侵染的植物部位細胞中，并插入到植物染色體中，由于該片段（稱T-DNA）上具有誘發(fā)腫瘤的基因，所以能誘發(fā)植物產生腫瘤。T-DNATumorproductionNopalinesynthesisT-DNAtransferfunctionNopalineutilizationOriginofreplicationTiplasmidTi質粒（胭脂堿型）簡圖冠癭瘤——天然的植物基因工程2.農桿菌Ti質粒作為植物基因工程載體科學家根據冠癭瘤形成的分子機理，通過改建農桿菌Ti質粒，使Ti質粒中的致瘤基因失活，同時插入目的基因，使之成為基因工程載體。通過感染轉化植物組織和細胞，并使之培養(yǎng)成完整的植株。CointegrateTi-plasmidTobaccoplantcellTrasformedcellCulturedcellPlantletTransgenictobaccoplantCelloftransgenicplant植物基因工程程序圖3.抗除草劑基因工程(Genetransferofglyphosateresistance)

草甘膦在低濃度時非常有效，對人無毒，可被土壤中微生物分解。草甘膦能被植物細胞的葉綠體的酶（EPSP合成酶）所分解，該酶對細菌和植物中的氨基酸的合成很重要，沒有這種酶的作用，植物就會干枯和死亡。從抗草甘膦的細菌中分離和克隆EPSP合成酶的基因和抗除草劑基因工程

抗除草劑基因工程示意圖首先從抗草甘膦的細菌中分離和克隆EPSP合成酶基因，再進行植物抗除草劑基因工程GenetransferofglyphosateresistanceTobaccoleavesexpressingthehepatitisBantigen.轉基因植物葉片表達乙肝病毒表面抗原。葉片用抗乙肝病毒表面抗原的抗體處理的結果。

正常葉片4.具有易于長期保鮮的轉基因西紅柿的制作過程原理如下：

通常的西紅柿不易保存保鮮，這是由于一種蛋白酶的催化成熟的結果。將這種酶的基因分離出來，再根據該基因序列結構合成它的互補基因，再將這種互補基因轉入到西紅柿植株中，它將會產生出一種與上述蛋白酶基因正常轉錄的mRNA相互補的mRNA（稱反義RNA），并且與之結合成雙鏈，使之不能正常翻譯成催化西紅柿成熟的蛋白酶。未成熟的西紅柿易于長期保存保鮮和運輸。只需用乙烯處理后即可成熟供應市場。轉基因西紅柿的途徑

5．植物細胞的轉化方法（1） 葉圓片共培養(yǎng)轉化（2） 單細胞水平上的轉化在Kan培養(yǎng)基上選擇轉化的組織——再生植株。5．轉基因植株的遺傳以孟德爾比例傳遞。轉基因植株的一對染色體

Kan自交1/4Kans1/2Kanr1/4Kanr思考題：

Kanr能在轉基因植株中以組成型的方式表達，如對轉化植株的花藥作培養(yǎng)所得花粉植株抗性和敏感性比例如何？轉化植株自交或與野生型回交的結果如何？

四.轉基因動物

1.定義:轉基因動物是指以實驗方法導入外源基因,并在其基因組內穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物.

2.意義:(1).建立轉基因動物模型以研究外源基因在整體動物中的表達調控規(guī)律;(2).改變動物基因型使其表型更符合人類需要;(3).可用轉基因動物產生人類需要的生物活性物質.轉基因生物反應器

□定義：將目的基因導入動物體內形成轉基因生物，由于基因表達，可以從轉基因動物的特定組織或器官（乳汁、血液等）獲得目的基因產物。使轉基因動物象一個活的發(fā)酵罐一樣來生產目的基因的產物。采用上述方法獲得的轉基因羊，可從羊奶中提取出治療心臟病的藥物tPA（組織溶解酶原激活劑）。

轉基因的方法:按基因導入方式劃分,建立轉基因動物主要有：顯微注射法,反轉錄病毒感染法胚胎干細胞法.顯微注射與反轉錄病毒感染方法都是把DNA直接導入受精卵或在不同的發(fā)育階段.受精卵四細胞胚胎囊胚原腸胚

轉基因動物

顯微注射

反轉錄病毒感染

DNA

DNA

在受精卵不同發(fā)育階段的轉基因方法轉基因動物的應用研究遺傳疾病的基因治療人類倫理道德一般不允許直接對人的受精卵進行基因操作，一般是將處理過的體細胞移植到患者體內。但這種操作具有一定的危險性，必須首先在動物體內進行試驗。所以，通過培育缺陷性狀得到矯正的動物(或細胞)可以為這類疾病的基因治療提供動物(或細胞)模型。

基因剔除技術

研究人類基因功能的重要手段是基因敲除。由于人和老鼠的基因非常接近，因此當懷疑人類基因圖譜中的某一片段同某種疾病相關時，就將老鼠體內的這個基因去除掉，看它會長成什么樣。

如果沒眼，那么被去除的基因就是決定長眼的基因。

基因敲除（geneknockout）是指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上將該基因去除，然后從整體觀察實驗動物，推測相應基因的功能。這與早期生理學研究中常用的切除部分-觀察整體-推測功能的三部曲思想相似。基因敲除還包括引入新基因及引入定點突變。既可以是用突變基因敲除相應的正常基因，也可以用正常基因敲除相應的突變基因?；蚯贸膽妙I域主要有：1、建立人類疾病的轉基因動物模型基因敲除小鼠是研究疾病的發(fā)生機理、分子基礎及診斷治療的重要實驗材料。2、改造動物基因型，研究基因敲除小鼠在胚胎發(fā)育及生命各期的表現，可以得到該基因在生長發(fā)育中的作用，為研究基因的功能和生物效應提供模式。3、治療遺傳病去除多余基因或修飾改造原有異?；蛞赃_到治療的目的.五.動物克隆技術克隆的基本概念

克隆是英文clone的譯音，最早來自希臘字clonos，意指樹枝條。動詞clonizos是砍樹枝。名詞clone意指無性繁殖（系），作為動詞意指產生無性繁殖系的過程，所以clone可以稱為無性繁殖或復制

現在的克隆技術可分為三個層次：基因、細胞、個體。.

克隆技術的生物學基礎——細胞及細胞的全能性根據細胞學說，細胞是一切生物體的結構和功能單位，無論是進行有性繁殖還是進行無性繁殖的生物，都是有細胞構成的。要突破生物有性繁殖和無性繁殖的界限應該從它們的共性出發(fā)，從操作細胞開始?？寺〖夹g所依賴的理論基礎19世紀30年代提出細胞學說，細胞是生物有機體的結構和生命活動的單位，又是生物個體和系統發(fā)育的基礎，1902年Haberlandt提出植物細胞全能性的設想。根據細胞理論，提出高等植物器官和組織可以不斷分割直至單個細胞的觀點。

細胞全能性（Celltotipotency）：任何一個處于細胞分化臨界期之前的細胞，只要處于合適的條件即可以發(fā)育為完整的生物體，也可以發(fā)育成任何組織或器官等。例如植物體的每個細胞都具有在離體條件下誘導分化形成完整植株的能力，這是由于每個細胞都具有完整基因組實現的。

植物細胞全能性實驗的重要事件：

1.

Steward，1958，從胡羅卜根游離單細胞培養(yǎng)成完整植株。2.Guha，1964，曼陀羅花藥培養(yǎng)成單倍體植株。

3.Takebe，1971，煙草原生質體培養(yǎng)成植株。

動物細胞的全能性？長期認為在動物發(fā)育的早期胚胎階段，每個胚胎細胞都具有全能性，但是隨著胚胎發(fā)育，胚胎細胞逐漸失去了這種全能性而開始功能分化，有的發(fā)育成神經組織，有的發(fā)育成肌肉組織。關鍵的問題是：動物細胞的分化過程是不可逆的嗎？1.動物克隆的早期設想：1938年，德國胚胎學家HansSpemann提出了用成年體細胞的核移植到未受精的卵細胞中，來實現動物的無性繁殖，未成功2.從低等動物開始，兩棲類和魚類1952年RobertBriggs和ThomasJKing用囊胚核移植方法產生了蝌蚪，未生成青蛙。1962年Gurdon用成年蛙體細胞克隆出青蛙，1965年童第周完成了金魚的核移植成功。3.1984年SteenWilladsen成功利用胚胎細胞的細胞核移植到未受精的卵細胞中產生了一頭綿羊，后來有小鼠，兔，山羊，牛，豬等克隆成功。4.以后長期用較晚期胚胎細胞和體細胞核移植一直失敗，產生了一種觀點：用高度分化的動物體細胞進行克隆在生物學上是不可能的?5.Wilmut，1997年，用綿羊乳腺細胞核移植，實現了在去核卵細胞中重新編程（Reprogramming），開創(chuàng)了高等動物體細胞克隆新時期。動物克隆技術的發(fā)展經歷從胚胎細胞的克?。òㄅ咛デ懈睿┑襟w細胞克隆的過程

胚胎細胞克隆技術產生的新個體并非是親代的自我復制，而是多生了幾個雙胞胎，并未引起世人注意。體細胞克隆可達到親代個體的自我復制。

□核移植技術將供體復制對象的細胞核轉入到去掉細胞核的卵細胞中。由于體細胞包含有全部的遺傳信息，可以從體細胞獲得完整的動物個體?？寺⊙颉岸嗬颉钡恼Q生說明動物體細胞也具有全能性，因此它是真正意義上的動物克隆，動物克隆的基本過程以克隆羊為例，動物克隆的基本過程如下圖

克隆動物的應用：1.快速克隆出優(yōu)良的種畜和遺傳上一致的實驗動物；2.動物資源的種質保存，包括地球上頻危動物的挽救等（異種核移植）；3.生產移植器官；4.與轉基因技術相結合研制生物反應器生產基因藥物。

轉基因體細胞克隆技術比轉基因動物（通過原核注射）的方法優(yōu)越：后者整合率和表達率低，經常出現嵌合體。

5.克隆人。是全世界注目的焦點，有人設計了克隆人的技術路線

動物克隆中急待解決的問題1.成功率低(1-3%)2.供體核和受體胞質細胞周期的同步化是影響克隆胚胎發(fā)育的重要因素.

3.線粒體來源的問題:發(fā)現有些克隆動物的線粒體(mtDNA)為雜合體,既有受體胞質的,也有供體細胞來的.4.端粒酶的問題：正常細胞沒有端粒酶，所以端粒會隨著細胞分裂而變短，細胞衰老。那么克隆動物是否會隨著供體細胞的縮短的端粒而提前衰老呢？有發(fā)現Dolly羊的端粒限制性片段平均長度（meanterminalrestrictionfragment,TRF)比同齡對照短。供體細胞培養(yǎng)時間越長，TRF越短.□

動物克隆的危險性：1．克隆動物已出現廣泛的免疫缺陷或早期夭亡。2．克隆動物過程中也極有可能產生遺傳性的變異（無性系變異），這在植物的克隆中已廣泛得到研究和驗證（會發(fā)生染色體變異，基因組DNA擴增和某些轉位因子的激活）。第七節(jié)遺傳病——基因診斷和基因治療

一、基因診斷

□

感染性疾病的診斷：人類感染了外源的病毒、細菌等引起的傳染性疾病的診斷可以直接分析患者的組織、器官或血液等來確定是否有外來病源性生物的基因。如HIV的DNA序列已經搞清，可以根據該序列設計合成一段引物，再從受檢人的血液或組織中抽提極微量的DNA為模板進行DNA的擴增，如獲得與HIVDNA序列相同的特定長度的DNA片段，即可確定受檢者攜帶HIV病毒?！?/p>

人類遺傳性疾病的產前診斷

人類有200多種遺傳病可用基因診斷技術作出準確的診斷，甚至在發(fā)病前和出生前作出診斷。如胎兒的羊水和胎盤絨毛細胞可從母體內取得，取出的細胞可以進行染色體核型、性別、生化和基因組缺陷的檢測1．檢測限制性位點的變化（1）鐮形細胞貧血癥是編碼血紅蛋白β鏈的一個決定谷氨酸的密碼子GAG變成了編碼纈氨酸的密碼子GTG，從而使血紅蛋白質分子結構和功能發(fā)生根本的改變，該患者的紅細胞由正常的園盤形變成鐮刀形。正常紅細胞鐮形紅細胞

（2）檢測原理：由于血紅蛋白基因上單個核苷酸的替換（A→T），使該部位的正常序列由CCTGAGG變成CCTGTGG，從而使患者DNA中消失了一個可被特定內切酶（MstII）切割的切點。MstII識別的序列為CC↑TNAGG。下圖為正常和異常蛋白、基因和內切酶識別位點變化圖。β—珠蛋白基因——————————————————/////////內含子///////////////////////////——————————————————↑0.2kb↑

1.1kb↑

M

M

M

（在異常中消失）

—脯——纈——谷——CCT—GTG—GAG—

MstII識別位點消失異常S—脯——谷——谷——CCT—GAG—GAG—

MstII識別位點正常A氨基酸序列和基因序列

血紅蛋白類型

(3).Southern雜交檢測鐮形細胞貧血癥提取羊水或絨毛細胞DNA，用限制性內切酶MstII對DNA酶解，經電泳和Southern吸引轉膜后，用放射性標記的β-株蛋白基因探針對膜上的DNA作雜交，根據經放射自顯影后的膠片上雜交斑點的多少和位置可作出診斷：正常人的β-珠蛋白基因（βAβA）中有3個MstII切點，可將該DNA上切成2個片段，它們?yōu)?.2kb和1.1kb長，因此會在相應位置產生二條雜交帶；異?；颊叩摩轮榈鞍谆颍é耂βS）中，只有2個切點，可將該DNA切一條長1.3kb的片段。突變攜帶者（雜合子），其β-珠蛋白等位基因中，一個是正常的基因，它有3個切點，切成2個片段；另一個攜帶突變的基因片段中只有2個切點，產生一個大的片段。(4).Southern雜交檢測結果

2、異常序列檢測(allele-specificoligonucleotides,ASO)如果某一特定核苷酸發(fā)生異常，可用在該基因相應區(qū)段上正常的野生型序列的寡核苷酸作為探針，經Southern雜交確定：雜交時的溫度是重要條件。因為野生型和突變型只差一個核苷酸，都可能與正常野生型探針雜交。在較高溫度時，互補序列才能雜交，只有一個錯配堿基的DNA也不能雜交。Genotypedeterminationusingallele-specificoligonucleotides(ASOs).19-73.PCR檢測法用Southern雜交法對鐮形細胞貧血癥作產前診斷需要足夠的細胞，并需提取純化DNA，并作酶切和雜交等步驟，不但所需時間較長，而且有一定的風險。PCR法：根據β-珠蛋白基因序列設計二條引物；取得極微量胎兒絨毛細胞或患者血液，裂介細胞粗提DNA，然后作PCR擴增，無論是正?；虍惓Ｕ叨紩a生1.3kb長的DNA片段。再對擴增樣品作酶切和電泳，其結果可直接從電泳圖獲得：該法簡便，只需微量細胞就可作出診斷。正常異常攜帶者1.3電1.1泳↓0.2□

PCR原理（1）變性，在95℃高溫下模板雙鏈DNA解開成單鏈DNA。（2）退火，將反應系統降至55℃，使引物能與模板單鏈DNA的特定部位配對結合。（3）鏈延伸：在72℃，以單鏈為模板，在引物的3’末端以互補原則合成新鏈。每一周期可使目的基因擴增一倍，經30個周期可擴增230目的基因片段。PCR技術是DNA操作的重大發(fā)明，Mullis等獲得了1993年諾貝爾獎。基因芯片技術（DNAmicroarraysorDNAchips)

□概念：基因芯片技術是DNA雜交探針與半導體工業(yè)技術相結合的產物。將各種探針固定于支持物上后與帶有熒光標記的DNA樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號，進而獲取被測樣品中DNA分子的數量和序列信息。該技術可用于大規(guī)模篩查由基因突變引起的疾病。□檢測原理和步驟：

(1)．制作芯片：根據疾病基因中的突變位點區(qū)域的核苷酸序列合成20個核苷酸長的探針，將其固定于芯片上，芯片上可固定成千上萬個探針。（2）．從被測對象的細胞中提取DNA，用酶切成較小的片段，并對DNA作熒光標記，并熔解成單鏈。（3）．將樣品滴加到芯片上并與芯片上的探針雜交，凡是與探針互補的酶切片段會固定于特定位置上，不能互補的片段會被洗脫掉。（4）．對芯片上的熒光作掃描和分析。GenescreeningusingaDNAmicroarray.

遺傳咨詢的若干倫理問題

遺傳病的定義

遺傳病是由于遺傳物質發(fā)生改變而造成的疾病，它可在上下代之間按一定的方式垂直傳遞，并且在有血緣關系的個體間由于遺傳繼承，有一定的發(fā)病比例。遺傳疾病的分類（一）染色體?。ǘ﹩位蜻z傳病（三）多基因遺傳病遺傳病的發(fā)病率有增高趨勢1956年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約4‰；1968年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約6‰；1977年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約10.8‰；遺傳病本身具有的嚴重性遺傳性(hereditary):

患者家庭的上、下垂直發(fā)病或同代間的水平發(fā)病，家系中往往有多個發(fā)病的個體；先天性(inborn):

在胎兒期即存在遺傳損害，生后即出現缺陷，給預防和治療造成極大的困難；終生性(lifelong):

患者受累終生直至死亡（AR）（AR）（AR）（AD）（XR）（線粒體病）遺傳服務中應遵循的倫理學原則遺傳服務的四大倫理原則尊重自主行善無傷害公正產前診斷中涉及道德問題上的4項基本準則

尊重夫婦雙方的選擇對個人和家庭不產生傷害產前診斷的結果可靠產前診斷和遺傳咨詢的自愿性二、基因治療（genetherapy）

人類的遺傳性疾病治療的常規(guī)方法：（1）手術治療，如先天性心臟病通過手術加以矯正.（2）藥物治療，如生長激素缺乏癥（侏儒）可注射人生長激素等?！趸蛑委煻x：應用基因工程手段用正常基因導入基因有缺陷的靶細胞中，使正?；虮磉_，并合成相應的產物，使細胞恢復正常的功能，使疾病得到治療。□基因治療的類別：根據基因轉移到受體細胞的不同，可分為體細胞基因治療和生殖細胞基因治療。（1）．體細胞基因治療：將正常的外源基因導入到患者特定的體細胞中，并使其正常表達，合成患者所缺的某種蛋白質或酶，使患者的癥狀得以改善。（2）．生殖細胞基因治療：將正?；驅牖颊叩纳臣毎⑹芫鸦蛟缙谂咛ゼ毎?，使這類細胞中的某些異?；虻墓δ艿靡曰謴?，最終發(fā)育成正常個體。1.基因治療方法和步驟

(1)．通常將正常的基因首先與基因轉移的載體相連接，常采用的載體有反轉錄病毒載體和腺病毒載體。(2)．將患者的體細胞（稱靶細胞）作體外培養(yǎng)，常用的有T淋巴細胞，骨髓干細胞，皮膚成纖維細胞、肌細胞、肝細胞等(3)．外源基因的轉移，將外源基因通過載體導入到靶細胞中，常用轉染的方法（加入磷酸鈣）導入到細胞中，并與細胞中核DNA整合到一起，也可用重組病毒感染靶細胞轉移外源基因。(4)．對能正常表達目的基因的靶細胞作檢定后回輸到患者體內。

重癥聯合免疫缺陷（Severecombinedimmunodeficiencydisease，簡稱SCID），患者缺乏正常人體免疫功能，其染色體上編碼腺苷脫氨酶（簡稱ADA）的基因發(fā)生突變所致。由于ADA是嘌呤代謝中的一種酶，該基因缺陷將導致患者身體細胞中脫氧腺苷的累積，達到高濃度時脫氧腺苷將對免疫系統細胞（如T-細胞