醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文答辯課件

醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文答辯研究生：XXX導(dǎo)師：XX教授MEDICALTHESISDEFENSE2021/4/261精品研究的背景及意義材料與方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論123目錄CONTENTS總結(jié)不足與展望致謝4562021/4/262精品

第一部分研究的背景及意義PART01012021/4/263精品研究的背景及意義對(duì)缺血性腦中風(fēng)發(fā)病機(jī)制及防治的研究已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)。缺血大腦迅速獲得血液供應(yīng)是阻止缺血性神經(jīng)元損傷的首要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又進(jìn)一步加重缺血組織的損傷--即缺血再灌注損傷。氧化應(yīng)激和炎癥是缺血再灌注損傷病理生理機(jī)制的重要組成部分。腦缺血再灌注早期即有大量活性氧產(chǎn)生，并迅速啟動(dòng)損傷級(jí)聯(lián)，加劇了初始損害最終導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆的損傷。因此，再灌注早期阻斷氧化應(yīng)激損傷是有效降低遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵。2021/4/264精品研究的背景及意義Genistein具有酪氨酸激酶抑制劑活性和抗氧化作用。4Genistein作為酪氨酸激酶抑制劑可有效減弱短暫全腦缺血造成的神經(jīng)元的延遲性死亡；一個(gè)單純的氧誘導(dǎo)的腦缺血小鼠模型顯示Genistein具有抗氧化活性。5eNOS活性的升高對(duì)腦中風(fēng)具有有益作用。另研究發(fā)現(xiàn)，Genistein能夠誘導(dǎo)eNOS活性并激活核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)，進(jìn)而誘導(dǎo)抗氧化酶表達(dá)、減少心血管疾病的發(fā)生。62021/4/265精品

那么，Genisteinpostconditioning(GPC，即缺血后給予Genistein)是否能通過eNOS/Nrf2/ARE信號(hào)通路降低氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮抗缺血性神經(jīng)元損傷的作用？目前尚未見報(bào)道。

本研究采用四動(dòng)脈結(jié)扎(4-VO)全腦缺血模型，觀察GPC對(duì)缺血性神經(jīng)元的保護(hù)作用，并探討其可能的分子機(jī)制，為臨床防治缺血性腦中風(fēng)提供理論依據(jù)。研究的背景及意義2021/4/266精品

第二部分材料與方法PART02022021/4/267精品大鼠腦立體定位儀大鼠腦微量注射泵冰凍切片機(jī)激光掃描共聚焦顯微鏡酶標(biāo)儀電泳設(shè)備搖床Morris水迷宮超低溫冰箱等組織裂解液BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒eNOS、p-eNOS、Nrf2、HO-1一抗及其相應(yīng)的二抗NBT/BCIP顯色液NeuN、4-HNE、8-OHdG一抗及對(duì)應(yīng)的熒光二抗TUNEL試劑盒材料與方法2021/4/268精品SPF級(jí)成年雄性SD大鼠隨機(jī)分組及4-VO模型ShamI/RVeh1(IR+DMSO)GPCVeh2(GPC+NaCl)L-NAME30m24hI10mI10mI10mI10mI10m30m6h1d5d椎動(dòng)脈電凝并分離頸總動(dòng)脈缺血尾靜脈注射Genistein1mg/kg側(cè)腦室注射L-NAME1mg/5μl0.9%NaCl0.1%DMSO3d7d9d材料與方法2021/4/269精品再灌注5d檢測(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡及存活實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)再灌注30min,6h,1d,3d觀察p-eNOS,Nrf2,HO-1蛋白表達(dá)免疫熒光染色法蛋白免疫印跡技術(shù)TUNEL染色及NeuN染色再灌注3d觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元8-OHdG,4-HNE,Nrf2,HO-1蛋白的表達(dá)及定位Morris水迷宮再灌注7-9d，檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力材料與方法2021/4/2610精品9、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:53:47PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個(gè)人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3

數(shù)據(jù)整理后，應(yīng)用SigmaStat3.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量資料數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析(ANOVA)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組比較用最小顯著差法(LSD)，各實(shí)驗(yàn)組之間比較采用q檢驗(yàn)(Newman-keulstest)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。材料與方法2021/4/2612精品

第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論P(yáng)ART03032021/4/2613精品圖1、NeuN及TUNEL免疫熒光染色觀察再灌注5d大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的存活及凋亡ABC實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論圖A：NeuN(紅色)染色：生存的神經(jīng)元；TUNEL(綠色)染色：凋亡樣神經(jīng)元；圖B：海馬CA1區(qū)1mm

長度內(nèi)NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖；圖C：海馬CA1區(qū)1mm長度內(nèi)

TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖;*P<0.05vs.I/R組，#P<0.05vs.GPC組，n=5;40×,bar=50μm2021/4/2614精品小結(jié)1Genistein后處理對(duì)缺血性神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，eNOS激酶抑制劑L-NAME減弱了該作用，說明eNOS可能參與了此保護(hù)作用。Genistein后處理是否誘導(dǎo)eNOS激活（磷酸化）?實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2021/4/2615精品圖2GPC對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá)的影響圖A：再灌注不同時(shí)間點(diǎn)p-eNOS、eNOS蛋白的表達(dá)；Sh：Sham組；R：再灌注；－：I/R組；＋：

GPC組；GPC:Genistein后處理；圖B：p-eNOS蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖：n=4；*p<0.05vs.I/R組AB實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2021/4/2616精品AB實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論圖3L-NAME對(duì)再灌注3d大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元eNOS磷酸化水平的影響圖A：各實(shí)驗(yàn)組再灌注3dp-eNOS蛋白表達(dá)；圖B：各實(shí)驗(yàn)組再灌注3dp-eNOS蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖，n=5，*p<0.05VS.I/R組；#p<0.05VS.Vehicle2組2021/4/2617精品小結(jié)2Genistein后處理可誘導(dǎo)全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)eNOS磷酸化水平升高，eNOS激酶抑制劑L-NAME可有效降低GPC誘導(dǎo)的eNOS磷酸化水平。結(jié)果揭示：eNOS磷酸化水平升高參與了Genistein的神經(jīng)保護(hù)作用。Genistein后處理是否能有效降低缺血再灌注后神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷呢?4-HNE是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，被公認(rèn)為氧化應(yīng)激最穩(wěn)定的標(biāo)記物8-OHdG，是DNA氧化損傷的特異產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2021/4/2618精品圖4全腦缺血再灌注3d，各實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA1區(qū)4-HNE及8-OHdG免疫熒光染色GPCI/RABGPCI/R圖A：綠色:NeuN；紅色:4-HNE；圖B：紅色:DAPI；綠色:8-OHdG；n=4-5；40×；bar=50μm實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2021/4/2619精品小結(jié)3

GPC能有效降低氧化應(yīng)激損傷；eNOS激酶抑制劑L-NAME廢除了此神經(jīng)保護(hù)作用。Nrf2/ARE信號(hào)是生物體內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)最重要的內(nèi)源性防御系統(tǒng)。那么，GPC是否通過eNOS誘導(dǎo)了此信號(hào)通路?實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2021/4/2620精品C圖5A-CGPC促進(jìn)大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2蛋白表達(dá)圖A：再灌注不同時(shí)間點(diǎn)核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)；圖B：再灌注不同時(shí)間點(diǎn)核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖，n=4，*p<0.05vs.I/R組；圖C：再灌注3d各實(shí)驗(yàn)組Nrf2蛋白的表達(dá)及統(tǒng)計(jì)圖；*p<0.001vs.I/R組，#p<0.001vs.Vehicle2組A實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2021/4/2621精品圖5D免疫熒光染色法觀察大鼠再灌注3d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)Nrf2的表達(dá)及定位綠色：Nrf2；紅色:NeuN；黃色：二者的共定位；40×；bar=30μm.L-NAME實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2021/4/2622精品圖6大鼠再灌注3d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)及其與Nrf2的共定位圖A-B：HO-1蛋白表達(dá)及其統(tǒng)計(jì)圖；圖C：HO-1與Nrf2蛋白的共定位，*p<0.05VS.I/R組；#p<0.05VS.vehicle2組；綠色：Nrf2；紅色：HO-1；藍(lán)色：DAPI；合成圖為三者的共定位；40×；n=4-5；bar=50μm；CL-NAMEI/RShamGPCVehicle2L-NAMEHO-1NeuNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2021/4/2623精品小結(jié)4實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論海馬是學(xué)習(xí)和記憶的重要部位，而海馬CA1區(qū)是缺血最敏感的區(qū)域。那么，GPC是否能改善大鼠缺血后空間學(xué)習(xí)記憶能力?GPC可顯著增加海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞核中Nrf2蛋白的表達(dá)并引起下游靶基因HO-1的表達(dá)，而L-NAME阻斷了此作用。此結(jié)果進(jìn)一步揭示GPC通過eNOS誘導(dǎo)了Nrf2/HO-1抗氧化信號(hào)通路，從而阻斷了缺血再灌注后遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。2021/4/2624精品圖7GPC對(duì)大鼠缺血后空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響圖A-B：潛伏實(shí)驗(yàn)和探索實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)圖；n=5；*p<0.05vs.I/R組；#p<0.05vs.GPC組.圖C-D：潛伏實(shí)驗(yàn)和探索實(shí)驗(yàn)大鼠游泳路程軌跡圖DC實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2021/4/2625精品小結(jié)5GPC能有效的改善大鼠缺血后的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2021/4/2626精品

第四部分總結(jié)PART04042021/4/2627精品GPC對(duì)缺血性神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。GPC能有效改善大鼠短暫全腦缺血后的認(rèn)知功能。GPC可通過誘導(dǎo)eNOS磷酸化水平并上調(diào)Nrf2/HO-1信號(hào)通路，從而降低腦缺血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。020301總結(jié)2021/4/2628精品

第五部分不足與展望PART05052021/4/2629精品不足與展望GPC是否可增加Nrf2的DNA結(jié)合活性有待進(jìn)一步研究。GPC是否也觸發(fā)了其它促生存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（如雌激素受體信號(hào)），從而起到抗缺血性神經(jīng)元損傷的作用。其確切的機(jī)制還有待多層面、多角度的進(jìn)一步探究。2021/4/2630精品

第四部分致謝PART04042021/4/2631精品

實(shí)驗(yàn)和論文的最終完成是我的導(dǎo)師**教授精心指導(dǎo)的結(jié)果。謹(jǐn)借此機(jī)會(huì)，向我敬愛的恩師表示最衷心的感謝！感謝河北聯(lián)合大學(xué)研究生學(xué)院、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室以及形態(tài)中心的各位老師所給予我的指導(dǎo)、關(guān)心與包容！感謝在學(xué)習(xí)及生活中曾經(jīng)與我朝夕相處、共同努力、不懈追求的同學(xué)和朋友們！感謝我的父母、親人和工作單位對(duì)我的支持與鼓勵(lì)，正是他們的理解和關(guān)懷使我順利的完成學(xué)業(yè)！致謝2021/4/2632精品醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文答辯研究生：XXX導(dǎo)師：XX教授Genistein后處理介導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)eNOS/Nrf2/HO-1信號(hào)通路及其