WB的失敗圖分析

WB問題條帶分析

報告人：楊羚1、目的條帶啥也沒有原因：只重復做沒有思考。這次目的條帶和內(nèi)參的二抗種屬是不同的。網(wǎng)上查閱經(jīng)驗：一點沒有，甚至連內(nèi)參都沒有，可能抗體加錯了，轉(zhuǎn)膜問題甚至膜放反；

條帶細微接近沒有，上樣量少，一抗?jié)舛鹊?，顯色液失效...........解決辦法：實驗前檢查抗體種屬是否加錯，確認轉(zhuǎn)膜沒有問題。20150825_重復做CST1只有點內(nèi)參20150826_CST1重做2、高背景20150814_JNk高效價第一次.bmp原因：封閉不夠好，洗膜不充充分，抗體濃度特別是二抗過高。網(wǎng)上查閱經(jīng)驗：奶粉封閉時間夠，注意操作規(guī)范，不偷工減料洗膜實際解決方法：奶粉封閉時間延長了半個小時，對于這種剪小后的片，用小洗滌盒洗，總之保證其洗膜充分20150816_JNK高效價第二次.bmp3、出現(xiàn)許多黑點和斑原因：膜上其他部位與一抗或者二抗非特異性結(jié)合。網(wǎng)上查閱經(jīng)驗：不要封閉時才去匆忙配奶粉，要確保奶粉完全溶解,否則不溶顆粒附著膜上。溶解后靜止，輕吸上層牛奶封閉，封閉結(jié)束，三次洗膜徹底

201507內(nèi)參略成功.bmp20150829sirt3失敗品4、條帶拖尾可能原因：蛋白量太大，一抗?jié)舛群蜁r間太長;個人猜測，跑膠的問題解決辦法：調(diào)整蛋白量，同時一抗?jié)舛瓤s小和孵育時間縮短

201508-HSF-LXF..jpg5、出現(xiàn)非均一性背景原因：膜可能干過！解決辦法：確保蛋白面不要被風干很長時間，一定要用不漏水的封閉盒并蓋上蓋子，防止過夜16個小時液體流失。

Gapdh.jpg6、條帶中出現(xiàn)規(guī)則白圈原因：轉(zhuǎn)膜出現(xiàn)氣泡！網(wǎng)絡(luò)經(jīng)驗：放膜時候，使膜U型放，兩邊下壓；蓋海綿前，確定氣泡除盡，蓋后放置動作要小幅輕微，防止產(chǎn)生不必要的氣泡。

7、最邊緣條帶彎曲原因：電泳電流不均解決辦法：盡量不使用兩邊的兩孔

BNP+Gapdh.jpg8、其他電泳過程出現(xiàn)的問題現(xiàn)象（1）整個條帶呈“︶”狀：凝膠冷卻不均一，電泳槽老化。（2）整個條帶呈“︵”：凝膠左右兩頭沒有凝固好（3）溴酚藍拖尾：樣品溶解不好。（4）縱向的紋理：上樣樣品中存在不溶性顆粒（5）溴酚藍很粗：濃縮膠濃縮效果不好，可能是濃縮膠太短，或者是濃縮膠配錯。（6）在分離膠中跑不動：Tris-ClPH值不對，或者忘記加SDS。8、配膠問題導致的失敗——條帶變形

原因：膠體中存在氣泡，或不溶性雜質(zhì)，膠不均不平整解決辦法：配膠的小燒杯，水，SDS，tris等等干凈無雜質(zhì)。貼邊角加入液體，凝固時間避免大幅度動作觸碰。

9、配膠問題導致的失敗——條帶啞鈴狀原因：配膠問題，可能是插或拔梳子引起的凹凸不平整；還有可能，樣品含較多雜質(zhì)雜質(zhì)沉積空中間.......10、其他（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是膠的濃度與目的蛋白的濃度不對應(yīng)，比如說100KD的蛋白你用12%的膠跑，或者說20KD的蛋白你用6%的膠跑。（2）蛋白質(zhì)降解。蛋白質(zhì)降解后很可能會在比原來位置低的地方出現(xiàn)主帶，然后會出現(xiàn)一些其他帶，最主要特點是所有的條帶比正常的都低，并且條帶模糊不清晰。（3）所有條帶連成一片沒有間隔。原因最可能是上樣量過多，其次是樣品彌散（比如電泳長時間停止樣品彌散）。(4).