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文檔簡介
血樣25-(OH)D3和24R,25-(OH)2D3
測定方法學(xué)研究
引言
中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部研究生課題1.課題來源
引言目的:通過LC-MS/MS方法,定量測定兒童血清中25-(OH)D3和24R,25(OH)2D3的含量意義:
本次研究希望通過建立方法學(xué),利用LC-MS/MS準(zhǔn)確檢測體內(nèi)維生素D3代謝物水平
2.研究目的與意義維生素D是一種陽光維生素,其中維生素D3是存在的主要形式之一,目前被廣泛認(rèn)可的作用,除了可以促進(jìn)兒童和成年人的骨骼健康,還對其他健康有益,包括降低如自身免疫病、常見的癌癥以及心血管疾病等慢性疾病的患病風(fēng)險。VD的來源是通過皮膚接受陽光照射產(chǎn)生或飲食中攝入獲得
?引言然而,維生素D3及其代謝物在體內(nèi)的含量極低,很難測得到。目前測定VD3及其代謝物濃度沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),主要有放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、液相色譜法(HPLC)、電化學(xué)發(fā)光法以及近幾年發(fā)展起來的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)酶免疫分析法曾經(jīng)是檢測血清中VD3及其代謝物濃度的最主要方法,且至今仍在被廣泛應(yīng)用,但酶免疫分析法的主要缺陷是抗體之間的交叉反應(yīng)導(dǎo)致的方法特異性不足
?引言?色譜分析法可對這些分析物進(jìn)行有效分離,從而獲得足夠的特異性。在這一方面,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)法有很大的優(yōu)勢。由于LC-MS/MS法的高選擇性、特異性和靈敏度,目前該分析技術(shù)已被眾多臨床研究機構(gòu)研究公認(rèn)為人體內(nèi)源性物質(zhì)測定的金標(biāo)準(zhǔn)
?引言EylesD,AndersonC,KoP,etal.AsensitiveLC/MS/MSassayof25(OH)vitaminD3and25(OH)vitaminD2indriedbloodspots[J].ClinChimActa,2009,403(1-2):145-15實驗內(nèi)容
一樣本制備標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線儲備液制備25(OH)D3
和24R,25(OH)2D3標(biāo)準(zhǔn)品分別用乙腈定容,配制成濃度分別為1mg/mL、0.2mg/ml的儲備液內(nèi)標(biāo)儲備液的制備內(nèi)標(biāo)d6-25(OH)D3(50μg/mL)用乙醇定容配制成濃度為10μg/mL的儲備液,用乙腈稀釋至100ng/mL即可內(nèi)標(biāo)工作液制備取內(nèi)標(biāo)儲備液用乙腈稀釋至100ng/mL衍生化試劑PTAD溶于乙腈配制成1mg/mL的溶液。將制備好的以上溶液與衍生化試劑儲存于-80℃待對照品的制備呢?
二樣本衍生化XXXXXXXXXXXXXXXX怎么克服?XXXXXXXXX先前有研究報道,我們本次研究的樣本制備與衍生化的方法,樣品前處理簡單,只需要少量的樣品(200μL)和兩步蛋白的沉淀與提取,采用的提取試劑是乙腈,沒有復(fù)雜和耗時的過程,如固相萃取(SPE)或液-液萃?。↙LE);并且在蛋白質(zhì)衍生化過程,樣本不需要在特定條件下進(jìn)行,如此,便于在大批量樣本中進(jìn)行快速測定。由于VD代謝物25(OH)D3和24R,25(OH)2D3離子化效率很低,在質(zhì)譜檢測器中干擾較大,很難有最佳響應(yīng)和圖譜峰形,不利于特異性檢測和痕量物質(zhì)的測定AronovPA,HallLM,DettmerK,etal.MetabolicprofilingofmajorvitaminDmetabolitesusingDiels-Alderderivatizationandultra-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry[J].AnalBioanalChem,2008,391(5):1917-1930
色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化三通過加入的標(biāo)準(zhǔn)衍生試劑,優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)來探討衍生化的標(biāo)準(zhǔn)。為了獲得滿意的分離的色譜柱和不同梯度的流動相。優(yōu)化LC-MS/MS條件被列在“實驗方法”部分。PTAD衍生的維生素D代謝物包括6S和6R兩個差向異構(gòu)體。因為共軛雙烯基團(tuán)將S型雙烯化合物作為目標(biāo)化合物從正面和側(cè)面進(jìn)攻,如圖所示,該結(jié)果是25(OH)D3-PTAD和24R,25(OH)2D3-PTAD的洗脫峰,而主峰是通過產(chǎn)生的6S的異構(gòu)體進(jìn)行定量。
色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化三在正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測條件下,在25(OH)D3
和24R,25(OH)2D3質(zhì)譜圖(如圖所示)的主峰分別為m/z558,m/z574,來自于質(zhì)子化合物C25位失去一個水分子([M+H-H2O]+)。將生物樣本中的待測物與4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)進(jìn)行衍生化反應(yīng),引入極性基團(tuán),增大待測物分子量,增加了待測物的離子化效率和測定靈敏度。待測物衍生生化反應(yīng)過程圖
25(OH)D3-PTAD質(zhì)譜圖24,25(OH)2D3-PTAD質(zhì)譜圖因此,[M+H-H2O]+的離子的結(jié)合需要前體體離子。此外,我們還觀察到在PTAD衍生化的分析物改性物產(chǎn)生質(zhì)荷比(m/z)為298的主要碎片離子,它是從C6和C7之間的鍵斷裂而獲得裂解離子四、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限與定量下限取25(OH)D3和24R,25(OH)2D3標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈逐級稀釋成如下:25(OH)D3(0.10,0.21,1.04,5.21,52.08,197.92,833.33和1000.0ng/mL),24R,25(OH)2D3(0.25,0.50,2.08,7.92,50.0,100.0,200.0和333.33ng/mL),按“項”處理方法處理后測定,以待測物濃度x為橫坐標(biāo),待測物和內(nèi)標(biāo)峰面積比值y為縱坐標(biāo),最小二乘法線性回歸,加權(quán)系數(shù)為1/x2.。標(biāo)準(zhǔn)曲線用方程表示,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性用相關(guān)系數(shù)(r2)表示Analyte標(biāo)曲線性方程(Regressionequation)相關(guān)系數(shù)(r2)線性范圍(ng/mL)定量下限(ng/mL)25(OH)D3y=0.5244x-0.44060.99990.10-1000.00.1024,25(OH)2D3y=0.7135x-1.86780.99360.25-333.330.25表3.1各待測物線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量下限
標(biāo)準(zhǔn)曲線圖A25(OH)D標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
B24,25(OH)2D標(biāo)準(zhǔn)曲線圖各待測物在所建測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸系數(shù)均在0.99以上,25(OH)D3和24,25(OH)2D3的最低定量限(LLOQ)分別為0.10ng/mL、0.25ng/mL
五、精密度、準(zhǔn)確度:加樣回收試驗由于待測維生素D代謝物含量極低并且血清中存在內(nèi)源性物質(zhì),因此很難獲得的,所以方法的準(zhǔn)確度和精密度是由已知分析物與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合人血和制備好的待測未知樣本測得的。日間、日內(nèi)精密度RSD(%)的范圍分別為4.8%~13.4%和5.2%1~2.9%,而準(zhǔn)確度又叫加樣回收試驗,其結(jié)果如表3.2所示,Analyte加入標(biāo)準(zhǔn)品濃度AddedConcentration(ng/mL)Intra-day(日間)Inter-day(日內(nèi))RSD(%)Accuracy(%)RSD(%)Accuracy(%)25(OH)D31007.0100.86.199.41505.4100.35.2102.12005.499.75.4101.524,25(OH)2D31013.4100.312.999.2154.895.76.1103.12012.5101.412.2100.3表3.2精密度與準(zhǔn)確度表明了該方法的準(zhǔn)確性與重復(fù)性良好
五、穩(wěn)定性穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明,在避光條件下,五次凍融循環(huán)后,衍生化的維生素D代謝產(chǎn)物是穩(wěn)定存在的,同樣在4℃自動進(jìn)樣器也可以穩(wěn)定96小時[2,7]。在這種方法中,在避光條件下至少三次凍融循環(huán)后,我們觀察到的衍生分析物是穩(wěn)定,可穩(wěn)定存放在自動進(jìn)樣器在4℃至少72小時?為什么沒做專屬性實驗?zāi)貒馕墨I(xiàn)考證TatsuyaHIGASHI.SimultaneousDeterminationof25-HydroxyvitaminD2and25-HydroxyvitaminD3inHumanPlasmabyLiquidChromatographyTandemMassSpectrometryEmployingDerivatizationwithaCookson-TypeReagentBiol.Pharm.Bull.24(7)738—743(2001)HedwigC.M.Stepman.CandidateReferenceMeasurementProceduresforSerum25-HydroxyvitaminD3and25-HydroxyvitaminD2byUsingIsotope-DilutionLiquidChromatography–TandemMassSpectrometry.ClinicalChemistry57:3441–448(2011)PavelA..MetabolicprofilingofmajorvitaminDmetabolitesusingDiels–Alderderivatizationandultra-performanceliquidchromatography–tandemmassspectrometry.AnalBioanalChem(2008)391:1917–1930結(jié)果與討論
本次研究采用LC-MS/MS測得25(OH)D3和24R,25(OH)2D3的濃度分別在0.10~10000ng/mL、0.25~333.33ng/mL范圍內(nèi),峰面積與濃度線性關(guān)系良好,回歸系數(shù)均在0.99(n=5)以上。25(OH)D3和24R,25(OH)2D3的最低定量限(LLOQ)分別為0.10ng/mL、0.25ng/mL;日間、日內(nèi)精密度RSD(%)的范圍分別為4.8%~13.4%和5.2%1~2.9%;而準(zhǔn)確度又叫加樣回收試驗,加樣回收率的范圍分別為99.4%~102.1%和95.7%~103.1%(n=5)結(jié)果與討論
以上實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)顯示,LC-MS/MS能準(zhǔn)確地測定體內(nèi)VD代謝物的含量,可分別測定
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