第13章-流失細胞術

第十三章

流式細胞術

流式細胞術（flowcytometry，F(xiàn)CM）是對細胞或細胞顆粒進行定量分析和細胞分類研究的技術。流式細胞儀又稱為熒光激活細胞分類器，是流體噴射術、激光光學技術、電子計算機技術和顯微熒光光度術相結合的高科技產品。應用流式細胞術可對單細胞逐個地進行高速準確的定量分析和分類，每秒測定達數(shù)千到數(shù)萬個細胞，且有高度的重復性。這種高速信息的測量分析和高純度分類的新技術，為細胞生物學提供了一種強有力的研究手段。

第一節(jié)

基本原理

一、流式細胞儀的主要組件1．液流系統(tǒng)

包括各種管道、壓力調節(jié)開關、液體流動室和超聲振蕩器噴嘴。單個細胞懸液在狹窄的管道中流動，由于細胞受流體力學的作用，極易形成貼邊、堆積,從而造成阻塞。為克服此種現(xiàn)象，利用流體聚焦的原理，在不同的壓力作用下使鞘液（通常用PBS）和細胞懸液在噴嘴內形成層流液束，通過細胞測量區(qū)。

2．光學系統(tǒng)

光學系統(tǒng)包括激發(fā)光源、各種光學濾片和各種光信號探測器。激光光源通常是采用激光器或汞燈等。激發(fā)光束激發(fā)細胞所攜帶的熒光物質產生熒光，通過光電轉換器和光電倍增管把微弱的信號變成電的信號，光信號通過不同的濾片把不同波長的光信號分開，把干擾光濾掉。3．電子系統(tǒng)

電子系統(tǒng)包括各種放大器、模數(shù)轉換電路、高壓電源和各種分析處理輔助系統(tǒng)，還包括把不同細胞分離開來的邏輯控制系統(tǒng)。4．計算機系統(tǒng)

把從細胞獲取的數(shù)據記錄儲存起來，利用各種不同的軟件對數(shù)據進行分析加工處理，把結果以圖、表的形式輸出。

二、流式細胞儀的工作原理

流式細胞儀要求被檢細胞用熒光染料染色，呈懸浮狀態(tài)。經染色的細胞通過樣品進入管被壓進超聲波振蕩器噴嘴的中央部，同時將無細胞的液體經過另一進入管壓入噴嘴，使之形成包圍細胞懸液的鞘液（圖13-1）。在鞘液和細胞懸液存在一定壓力差的情況下，中央的細胞懸液和周圍鞘液的分層液流快速通過50μm的噴嘴圓孔，被噴射出來。當同軸流動的細胞懸液和鞘液通過激光器發(fā)出的氬離子激光束照射小區(qū)時，單行流動的細胞發(fā)射出熒光，熒光檢測器接受聚焦后的熒光信號。

多數(shù)流式細胞儀可以同時收集兩種以上不同波長的熒光信號，檢測細胞膜表面或細胞內熒光分子的數(shù)量。散射光檢測器則接受細胞散射偏轉后的激光束信號，此信號可反映細胞的物理化學特性、大小、數(shù)量和類型。前向角散射強度信號與細胞的大小有關。散射光強度信號則反映細胞內部結構，即流式細胞儀可以同時收集兩個方向散射光的信號。兩種光檢測器所產生的信號，經過電子系統(tǒng)的處理，產生脈沖，并使測量過的細胞在形成微滴時，帶上不同的電荷（充電）。

當充電微滴通過帶有恒定靜電壓的偏轉板時，帶正電荷的細胞微滴在靜電場作用下落入左方的細胞收集器，而帶負電荷的細胞微滴落入右方的細胞收集器，不帶電荷的細胞微滴落入中央的容器中，從而實現(xiàn)細胞分選的目的。這種分類技術能以每秒高達5000~10000個細胞的速度分類細胞，純度在90%~99%之間，細胞活性在通過儀器過程中不受影響。流式細胞儀僅對懸浮細胞進行分析和測量，并進行統(tǒng)計學分析，但無法得到細胞的形態(tài)學以及多種動力學功能參數(shù)，尤其不能滿足細胞的解剖定位研究。第二節(jié)

單細胞懸液的制備

流式細胞術所得結果好壞首先取決于細胞樣品處理制備方法的優(yōu)劣。所以，要保證細胞在制備過程中和儲存期間細胞表面和細胞內部的成分不被破壞和去失，特別是要分析的那些成分。

一、單層細胞培養(yǎng)

使用標準培養(yǎng)技術，單層生長的細胞容易分離。單層細胞用PBS或Hanks平衡液加0.25%Trypsin洗，當細胞變圓時（在倒置顯微鏡下觀察），倒出Trypsin液體后用手拍打振動培養(yǎng)瓶使細胞脫落，然后加入緩沖液搖動培養(yǎng)瓶并用細管取出含有細胞的上清液。

二、組織從新鮮組織制備單個細胞懸液，有的比較容易，例如淋巴結組織用注射器反復抽吸幾次即可得到足夠量的細胞；有的就比較困難，常要用機械分散和酶消化相結合的方法處理，如肝、睪丸用酶消化處理很容易得到單個細胞。但睪丸生殖細胞胞質之間橋接引起相鄰細胞溶解，形成人為的稱為合胞體的多核假象。很難與DNA含量和體積上相似的單個細胞區(qū)分開。神經細胞的處理參見細胞培養(yǎng)。

三、血細胞制備方法（一）全血溶解技術通過選擇性的溶解紅細胞，獲得外周血中單個核細胞和多形核細胞。1．試劑

氯化銨溶解緩沖液pH7.3。細胞洗滌緩沖液：不含鈣鎂的Hanks平衡鹽液或1×PBS緩沖液。2．方法

（1）取0.5~1ml用肝素或EDTA抗疑的外周血，加入15ml離心管內，加20倍于血體積的氯化銨溶液混勻，室溫下溶解8~l0min（紅細胞完全溶解應為透明紅色）。（2）180g離心5min，小心吸出上清，然后把沉淀的白細胞用細胞洗滌緩沖液洗兩次，80g離心5min。吸出上清，再把細胞懸浮在冷的緩沖介質中備用。

（二）梯度-密度離心分離法該方法可離出單個核細胞（淋巴細胞和單核細胞）。1．材料

淋巴細胞分離液；PBS緩沖液。2．方法

（1）所用試劑預熱到25℃以獲得正確的密度。（2）取5ml外周血用肝素或EDTA抗凝，并加等體積的PBS稀釋混勻。加2ml淋巴細胞分離液到圓錐形離心管的底部，用吸管取5ml用PBS稀釋的抗凝血小心地放到淋巴細胞分離液液面上，注意不要使之混合。

（3）室溫下400g離心20min，使離心管自行緩慢停下，不要用力強迫離心停車。丟棄血漿，用細尖長吸管吸出含有單個核細胞的淡黃色層，置另一個離心管內。

（4）加10mlPBS600g離心10min，洗兩次。把細胞在懸浮在2ml的PBS中備用。

四、石蠟標本制備單細胞懸液

（1）修塊：切去多余的壞死組織和基質組織。切5片50μm厚蠟片標本放在一個10ml的試管里。

（2）脫蠟：加入5ml二甲苯，10min×3次。

（3）水化：100%乙醇5~10min×2次；95%乙醇5~l0min×2次；70%乙醇5~10min×2次；50%乙醇5~10min×2次；蒸流水洗5min×3次，丟棄蒸流水。（6）消化：加入5ml0.5%胃蛋白酶消化液（生理鹽水配制）37℃保溫30~50min，每隔10min振蕩一次。用鑷子或玻璃棒取出未消化完的組織，并加等量生理鹽水終止酶的作用。經50μm尼龍網過濾。

五、細胞固定

固定的目的是使細胞或組織硬化足以承受包埋和切片的處理。固定也使得細胞膜變得通透，使染料能夠進入，獲得最佳染色效果、并通過抑制微生物作用和自溶保護細胞樣品。作為流式細胞術，細胞以懸浮狀態(tài)使用，常用的固定劑有乙醇、甲醇、甲醛和戊二醛等。DNA定量分析細胞多用乙醇固定，免疫表型分析常用甲醛和多聚甲醛等固定以保護細胞膜表面的特異標志物。

1．乙醇固定

常用75%乙醇。用無鈣鎂的PBS配制，4℃冰箱中保存。將洗過的細胞用0.5mlPBS懸浮起來，用加樣器或吸管把細胞懸液噴射入5ml75%冷乙醇中。將容器口密封，4℃冰箱貯存，時間不少30min。2．免疫染色后的固定

對細胞表面抗原進行免疫標記染色后，如果不能立即進行FCM分析，可用下列方法固定保存：

（1）在細胞免疫標記染色完成細胞洗滌后，加入3%的甲醛，細胞搖勻后4℃冰箱保存。24h之內分析，其熒光強度不變。（2）用0.5%的多聚甲醛搖勻固定，4℃冰箱保存，一周內熒光強度基本不變。第三節(jié)

細胞的熒光標記

流式細胞術對細胞的分析一是分析細胞產生的散射光信號；二是分析細胞所產生的熒光信號。細胞的熒光是由一些能夠定量的熒光染料與細胞內的特有成分結合，或經抗原抗體反應使熒光染料與細胞間接結合，經激光照射產生的。本節(jié)主要介紹熒光染料直接與細胞內部特有成分結合定量分析的熒光標記方法，如DNA、RNA、蛋白等。

一、常用熒光染料在流式細胞術中使用的熒光染料可分兩大類：一類是染料生物大分子基團，如免疫球蛋白，再與細胞發(fā)生免疫反應，使染料分子間接地連接到細胞上（表13-1）；另一類是直接與細胞內特異成分相結合的染料，它們之間有非常好的線性關系（表13-2）。在實驗過程中，應根據儀器的實際情況，例如激發(fā)光源的種類、濾光片的配置以及本實驗室所具有的條件，來選擇適合于自己使用的熒光染料。表13-1對抗體和其他配體分子共價標記的熒光染料----------------------------------------------------------------------熒光染料分子量吸收峰值發(fā)射峰量子產額----------------------------------------------------------------------FTTC3904955250.5TexasRed6255966150.51PE240K490~5805700.8----------------------------------------------------------------------表13-2檢測細胞內特異成分常用的熒光染料--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------熒光染料分子量結合方式結合位點激發(fā)波長nm熒光發(fā)射峰值nm用途--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------PI668嵌入無493630DNAEB394嵌入無482616DNAMI1069嵌入G-C320,445575DNACA31183非嵌入G-C320,445575DNAHo33258624非嵌入A-T343480DNAHo33342615非嵌入A-T343483DNADAPI350非嵌入G-C345