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ChapterFour

基因工程的基本技術(shù)(polymerasechainreaction,PCR)聚合酶鏈反應(yīng)SectionFour一、什么是PCR?是體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。1985年美國(guó)PE-Cetus公司的K.B.

Mullis等發(fā)明的。DNA是由四種堿基按互補(bǔ)配對(duì)原則組成的螺旋雙鏈。在細(xì)胞內(nèi),DNA復(fù)制時(shí),解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板,然后,RNA聚合酶合成一小段引物(primer)結(jié)合到DNA模板上,最后,DNA合成酶以這段引物為起點(diǎn),合成與DNA模板配對(duì)的新鏈PCR就是在體外模擬DNA復(fù)制的過程,它用加熱的辦法讓DNA片段變性變成兩條單鏈,讓人工合成兩個(gè)引物結(jié)合到DNA模板兩端,DNA聚合酶即可以大量復(fù)制該模板。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)AGAACTTTCTTGAAAGAACTTTCTTGAATCTTGAAAGAACTT親代DNA子代DNA二、PCR的基本原理

DNA的復(fù)制(replication)

由親代DNA合成兩個(gè)相同的子代DNA的過程(一)原理在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下,特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)

PCR反應(yīng)擴(kuò)增的是一對(duì)引物之間的DNA片段(二)基本過程變性:加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂溚嘶穑航禍厥挂锖突パa(bǔ)模板在局部形成雜交鏈延伸:耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點(diǎn)的延伸反應(yīng)(三)PCR基本反應(yīng)以DNA為模板的反應(yīng)反應(yīng)體積:50~100μLbuffer引物一對(duì)底物:4種dNTP模板:102~105拷貝耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)礦物油模板DNA的用量可根據(jù)其分子量的大小調(diào)整PCR緩沖液在PCR體系中Buffer通常采用10mmol/LTris-HCl(pH8.3-9.0),其中的二價(jià)陽(yáng)離子(通常為Mg2+)可以激活DNA聚合酶的活性中心,Mg2+的濃度可影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。K+(50mmol/L)利于引物與模板的退火明膠或血清白蛋白及去污劑(Tween20)起到對(duì)TaqDNA聚合酶的穩(wěn)定作用循環(huán)參數(shù)變性溫度和時(shí)間:按模板DNA復(fù)雜程度來調(diào)整變性溫度和時(shí)間。94℃,1min;95℃,30s;97℃,15s;退火溫度和時(shí)間:45~55℃,30s~1min延伸溫度和時(shí)間:72℃,時(shí)間因擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而異:1kb,1min;3~4kb,3~4min循環(huán)次數(shù):25~35次,視最初靶分子濃度而定(一)PCR引物設(shè)計(jì)PCR效率和特異性取決于兩個(gè)方面:一是引物與模板的特異結(jié)合,二是聚合酶對(duì)引物的有效延伸。三、PCR相關(guān)知識(shí)PCR引物設(shè)計(jì)原則1.引物長(zhǎng)度一般15~30個(gè)核苷酸。引物過短會(huì)使PCR的特異性降低,過長(zhǎng)會(huì)提高相應(yīng)的退火溫度,并使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度74℃,亦會(huì)影響產(chǎn)物的生成,且合成引物成本增加2.引物中的堿基盡可能隨機(jī)分布,避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶的堆積現(xiàn)象。尤其是引物的3′端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G和C。否則會(huì)使引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤配對(duì)。引物中G+C的含量在45~55%左右。設(shè)計(jì)引物時(shí)要考慮3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4(G+C)+2(A+T)。引物長(zhǎng)度要確保解鏈溫度不低于54℃3.引物自身內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。一般引物自身存在的連續(xù)互補(bǔ)序列,不超過3bp4.兩引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,尤其是3′端5.引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。尤其是引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列,否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。6.引物3′端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn),因此一定要與模板DNA配對(duì)。引物3′端的最佳堿基選擇是G和C。因?yàn)樗鼈冃纬傻膲A基配對(duì)比較穩(wěn)定。7.引物的5′端可以修飾,如附加限制酶位點(diǎn),引入突變位點(diǎn),用生物素,熒光物質(zhì),地高辛標(biāo)記,加入其它短序列包括起始密碼子等。在PCR的起始反應(yīng)中,引物5′端游離的堿基并不影響引導(dǎo)新生鏈DNA合成的能力。但在后續(xù)的擴(kuò)增循環(huán)中,這些與初始模板不配對(duì)的序列被帶到PCR產(chǎn)物的雙鏈中去,所以如此引物參與的PCR產(chǎn)物,既含有目的擴(kuò)增片段又含有兩側(cè)引入的核苷酸序列(二)模板的取材病原體標(biāo)本:病毒、細(xì)菌、真菌、螺旋體、立克次體、支原體等病理生理標(biāo)本:細(xì)胞、血液、絨毛、尿液等法醫(yī)學(xué)標(biāo)本:血斑、精斑、毛發(fā)考古標(biāo)本(三)TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶在75~80℃具有最高的聚合酶活性。75~80℃每個(gè)酶分子每秒可延伸約150個(gè)核苷酸,

70℃時(shí)60個(gè)核苷酸/秒以上。

55℃時(shí)22個(gè)核苷酸/秒;

37℃1.5個(gè)核苷酸/秒22℃時(shí)0.25個(gè)核苷酸/秒。溫度超過80℃時(shí),合成速度明顯下降,可能與引物和模板結(jié)合穩(wěn)定性遭到破壞有關(guān),72℃最適溫度。TaqDNA聚合酶沒有3′→5′外切酶活性。沒有校正功能。對(duì)于30次循環(huán)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。此酶的錯(cuò)配率為0.1%~0.25%。TaqDNA聚合酶具有類似未端轉(zhuǎn)移酶的功能,能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。但對(duì)4種dNTP聚合到3′-未端的能力不同,對(duì)dATP的聚合能力高于其他3種核苷酸,因此PCR產(chǎn)物的末端總是帶有兩個(gè)A附:PfuDNA聚合酶此酶來自激烈熱球菌(Pyrococcus

fariosus),耐熱性極好,在97.5℃半衰期大于3小時(shí),具有35外切酶活性,催化DNA合成的忠實(shí)性比TaqDNA聚合酶高12倍,是目前使用最廣泛的具有35外切酶活性的耐高溫聚合酶上海閃晶分子生物科技有限公司

來自嗜熱細(xì)菌(Thermus

thermophilus)74℃溫度下進(jìn)行擴(kuò)增,在95℃的半衰期只有20min。在Mg2+存在下以DNA為模板合成DNA,而在Mn2+存在下以RNA為模板合成cDNA。催化RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄編號(hào)規(guī)格售價(jià)¥ZP00401100U400ZP00402500U1600ZP004031000U3000

TthDNA聚合酶VentDNA聚合酶VentDNA聚合酶來自嗜熱高溫球菌(Thermococcus

litoralis)是一種高保真的耐熱DNA聚合酶,其保真度比TaqDNA聚合酶高5倍。該酶具有高保真性的其中一個(gè)原因是自身具有3‘→5’核酸外切酶校讀活性。在95℃溫育1小時(shí)后,仍具有90%以上的聚合酶活性,耐熱。VentR?(exo-)DNA聚合酶是VentDNA聚合酶經(jīng)基因工程改造而得,去除了3‘→5’核酸外切酶校讀活性,它是應(yīng)用于高產(chǎn)量PCR

的首選酶,其保真度有所降低,大約比Taq

DNA聚合酶高2倍。增加退火溫度減少TaqDNA聚合酶的濃度減少退火及延伸時(shí)間減少引物濃度減少擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)(四)出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物時(shí)應(yīng)采取的措施根據(jù)上述說明PCR儀程序設(shè)置為:Step194℃2minStep294℃40secStep355℃45secStep472℃50secStep5tostep234cyclesStep67210m

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