第四章基因工程常規(guī)技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(tk)

ChapterFour

基因工程的基本技術(shù)(polymerasechainreaction,PCR)聚合酶鏈反應(yīng)SectionFour一、什么是PCR?是體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。1985年美國PE-Cetus公司的K.B.

Mullis等發(fā)明的。DNA是由四種堿基按互補配對原則組成的螺旋雙鏈。在細(xì)胞內(nèi)，DNA復(fù)制時，解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板，然后，RNA聚合酶合成一小段引物（primer）結(jié)合到DNA模板上，最后，DNA合成酶以這段引物為起點，合成與DNA模板配對的新鏈PCR就是在體外模擬DNA復(fù)制的過程，它用加熱的辦法讓DNA片段變性變成兩條單鏈，讓人工合成兩個引物結(jié)合到DNA模板兩端，DNA聚合酶即可以大量復(fù)制該模板。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點AGAACTTTCTTGAAAGAACTTTCTTGAATCTTGAAAGAACTT親代DNA子代DNA二、PCR的基本原理

DNA的復(fù)制(replication)

由親代DNA合成兩個相同的子代DNA的過程（一）原理在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)

PCR反應(yīng)擴(kuò)增的是一對引物之間的DNA片段（二）基本過程變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂溚嘶穑航禍厥挂锖突パa模板在局部形成雜交鏈延伸：耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點的延伸反應(yīng)（三）PCR基本反應(yīng)以DNA為模板的反應(yīng)反應(yīng)體積：50~100μLbuffer引物一對底物：4種dNTP模板：102~105拷貝耐熱DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）礦物油模板DNA的用量可根據(jù)其分子量的大小調(diào)整PCR緩沖液在PCR體系中Buffer通常采用10mmol/LTris-HCl（pH8.3-9.0），其中的二價陽離子（通常為Mg2+）可以激活DNA聚合酶的活性中心，Mg2+的濃度可影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。K+（50mmol/L）利于引物與模板的退火明膠或血清白蛋白及去污劑（Tween20）起到對TaqDNA聚合酶的穩(wěn)定作用循環(huán)參數(shù)變性溫度和時間：按模板DNA復(fù)雜程度來調(diào)整變性溫度和時間。94℃，1min；95℃，30s；97℃，15s；退火溫度和時間：45~55℃，30s~1min延伸溫度和時間：72℃，時間因擴(kuò)增片段的長度而異：1kb，1min；3~4kb,3~4min循環(huán)次數(shù)：25~35次，視最初靶分子濃度而定（一）PCR引物設(shè)計PCR效率和特異性取決于兩個方面：一是引物與模板的特異結(jié)合，二是聚合酶對引物的有效延伸。三、PCR相關(guān)知識PCR引物設(shè)計原則1.引物長度一般15~30個核苷酸。引物過短會使PCR的特異性降低，過長會提高相應(yīng)的退火溫度，并使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度74℃,亦會影響產(chǎn)物的生成，且合成引物成本增加2.引物中的堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶的堆積現(xiàn)象。尤其是引物的3′端不應(yīng)有連續(xù)3個G和C。否則會使引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯誤配對。引物中G+C的含量在45~55%左右。設(shè)計引物時要考慮3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物長度要確保解鏈溫度不低于54℃3.引物自身內(nèi)部不應(yīng)存在互補序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。一般引物自身存在的連續(xù)互補序列，不超過3bp4.兩引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其是3′端5.引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。尤其是引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。6.引物3′端堿基是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板DNA配對。引物3′端的最佳堿基選擇是G和C。因為它們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。7.引物的5′端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素，熒光物質(zhì)，地高辛標(biāo)記，加入其它短序列包括起始密碼子等。在PCR的起始反應(yīng)中，引物5′端游離的堿基并不影響引導(dǎo)新生鏈DNA合成的能力。但在后續(xù)的擴(kuò)增循環(huán)中，這些與初始模板不配對的序列被帶到PCR產(chǎn)物的雙鏈中去，所以如此引物參與的PCR產(chǎn)物，既含有目的擴(kuò)增片段又含有兩側(cè)引入的核苷酸序列（二）模板的取材病原體標(biāo)本：病毒、細(xì)菌、真菌、螺旋體、立克次體、支原體等病理生理標(biāo)本：細(xì)胞、血液、絨毛、尿液等法醫(yī)學(xué)標(biāo)本：血斑、精斑、毛發(fā)考古標(biāo)本（三）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶在75~80℃具有最高的聚合酶活性。75~80℃每個酶分子每秒可延伸約150個核苷酸，

70℃時60個核苷酸/秒以上。

55℃時22個核苷酸/秒；

37℃1.5個核苷酸/秒22℃時0.25個核苷酸/秒。溫度超過80℃時，合成速度明顯下降，可能與引物和模板結(jié)合穩(wěn)定性遭到破壞有關(guān)，72℃最適溫度。TaqDNA聚合酶沒有3′→5′外切酶活性。沒有校正功能。對于30次循環(huán)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。此酶的錯配率為0.1%～0.25%。TaqDNA聚合酶具有類似未端轉(zhuǎn)移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。但對4種dNTP聚合到3′-未端的能力不同，對dATP的聚合能力高于其他3種核苷酸，因此PCR產(chǎn)物的末端總是帶有兩個A附：PfuDNA聚合酶此酶來自激烈熱球菌（Pyrococcus

fariosus），耐熱性極好，在97.5℃半衰期大于3小時，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠實性比TaqDNA聚合酶高12倍，是目前使用最廣泛的具有35外切酶活性的耐高溫聚合酶上海閃晶分子生物科技有限公司

來自嗜熱細(xì)菌（Thermus

thermophilus）74℃溫度下進(jìn)行擴(kuò)增，在95℃的半衰期只有20min。在Mg2+存在下以DNA為模板合成DNA，而在Mn2+存在下以RNA為模板合成cDNA。催化RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄編號規(guī)格售價￥ZP00401100U400ZP00402500U1600ZP004031000U3000

TthDNA聚合酶VentDNA聚合酶VentDNA聚合酶來自嗜熱高溫球菌（Thermococcus

litoralis）是一種高保真的耐熱DNA聚合酶，其保真度比TaqDNA聚合酶高5倍。該酶具有高保真性的其中一個原因是自身具有3‘→5’核酸外切酶校讀活性。在95℃溫育1小時后，仍具有90%以上的聚合酶活性，耐熱。VentR?（exo-）DNA聚合酶是VentDNA聚合酶經(jīng)基因工程改造而得，去除了3‘→5’核酸外切酶校讀活性，它是應(yīng)用于高產(chǎn)量PCR

的首選酶，其保真度有所降低，大約比Taq

DNA聚合酶高2倍。增加退火溫度減少TaqDNA聚合酶的濃度減少退火及延伸時間減少引物濃度減少擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)（四）出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物時應(yīng)采取的措施根據(jù)上述說明PCR儀程序設(shè)置為：Step194℃2minStep294℃40secStep355℃45secStep472℃50secStep5tostep234cyclesStep67210m