山羊和黃牛源性成分同步檢測方法實(shí)時(shí)熒光PCR法編制說明

編制說明項(xiàng)目名稱： 山羊和黃牛源性成分同步檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法項(xiàng)目編號： 內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函〔2018〕307號編制單位： 錫林郭勒職業(yè)學(xué)院一、工作簡況本項(xiàng)目來源于2018年第3批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目（內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函〔2018〕307號）。起草單位為錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，協(xié)作單位為錫林郭勒食品檢驗(yàn)檢測和風(fēng)險(xiǎn)評估中心。主要起草人：郭梁、郭元晟、廖成松、雅梅、錢俊平、羅建興。二、制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義山羊奶深受消費(fèi)者的喜愛，是農(nóng)畜產(chǎn)品市場中重要組成部分。市場中存在用低價(jià)牛奶冒充山羊奶的欺詐違法行為，亟需制定針對肉乳制品的山羊和黃牛源性成分同步檢測方法。目前，已經(jīng)存在一項(xiàng)山羊源性檢測方法標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成分三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法（SN/T2980-2011）。在采用上述檢測標(biāo)準(zhǔn)后發(fā)現(xiàn)：目前缺乏基于同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的山羊和黃牛源性成分同步檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)是基于多重實(shí)時(shí)熒光 PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的山羊和黃牛源性成分同步檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，具有快速、高通量以及去除假陰性等特征。三、主要起草過程本標(biāo)準(zhǔn)制定工作從2018年10月開始，組織成立了標(biāo)準(zhǔn)起草團(tuán)隊(duì)。起草團(tuán)隊(duì)首先進(jìn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、專利以及論文的收集和整理工作，制定了基于多重實(shí)時(shí)熒光PCR法、同管質(zhì)量控制體系、針對肉乳制品的動(dòng)物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的研發(fā)目標(biāo)，計(jì)劃形成山羊Caprahircus）、黃牛（Bostaurus）、綿羊（Ovisaries）、馬Equuscaballus）、水牛（Bubalusbubalis）、牦牛（Bosgrunniens）、豬（Susscrofa）、驢（Equusasinus）、雙峰駝（Camelusbactrianus）、梅花鹿（Cervusnippon）、雞（Gallusgallus）、鴨Anasplatyrhynchos）及鵝（Anseranser）等13個(gè)物種、針對肉（鮮肉、肉干及香腸）和乳（鮮乳、發(fā)酵乳、乳酪及乳粉）的常見動(dòng)物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)體系。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：（一） 在NCBI中下載不同物種（山羊、黃牛、綿羊、馬、水牛、牦牛、豬、驢、雙峰駝、梅花鹿、雞、鴨及鵝等 13個(gè)物種）的線粒體序列。為了保證引物和探針的物種適用性，每個(gè)物種下載5-20個(gè)品種或品系的線粒體序列；利用生物信息學(xué)軟件（ClustalX或MAGE5）對所下載的線粒體序列進(jìn)行比對。篩選物種間特異品種間保守的序列為目標(biāo)靶向區(qū)域（5-10個(gè)），針對目標(biāo)靶向區(qū)域設(shè)計(jì)5組引物和探針組合。上游引物的3’端距離探針的5’端為1-20bp，探針的5’端避免出現(xiàn)G，探針Tm要高于引物Tm值10℃左右；不同物種的探針用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記FAM、HEX、ROX以及CY5）；如果探針Tm值和引物Tm值接近，探針3’端可以選擇MGB基團(tuán)；（二）收集各種來源于不同動(dòng)物的肉（鮮肉、肉干及香腸）和乳（鮮乳、發(fā)酵乳、乳酪及乳粉）。利用改良CTAB法提取樣品的DNA（A260nm/A280nm≈1，.8瓊脂糖凝膠電泳主帶無拖尾，Nanodrop和Qubit定量一致性較高）；（三） 特異性分析：利用實(shí)時(shí)熒光 PCR對5組引物和探針進(jìn)行檢測，有典型擴(kuò)增曲線且 Ct值≤35計(jì)為檢出。在陽性對照檢出、陰性對照未檢出、對 5組引物和探針進(jìn)行特異性的分析評價(jià)。反應(yīng)體系（20μL）：TransStartProbeqPCRSuperMix10 （μL北京全式金生物技術(shù)有限公司），引物各1μL，探針各0.5μL，模板DNA1μL，補(bǔ)水至20μL。反應(yīng)條件：94℃、30s，1個(gè)循環(huán)；94℃、5s，60℃、31s，40個(gè)循環(huán)；（四） 絕對靈敏度分析：以來源于不同肉乳制品的高質(zhì)量 DNA為模板母液，用滅菌 ddH2O稀釋模板母液，共稀釋 10個(gè)梯度，稀釋后質(zhì)量濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00001ng/。μL以不同稀釋濃度的DNA為模板對5組引物和探針進(jìn)行檢測，根據(jù)PCR反應(yīng)的Ct值分析此方法對于不同濃度模板DNA的檢測靈敏度。檢出限（LOD）統(tǒng)計(jì)分析參照Probitanalysis。比較5組引物和探針的絕對靈敏度，分析引物和探針的特異性和保守性與絕對靈敏度之間的相關(guān)性；（五） 摻假檢出限（相對靈敏度）分析：首先，制備模擬摻假混合樣品（0.1%、1%、10%、30%、70%、90%、99%、99.9%），以上述摻假組為模板對 5組引物和探針進(jìn)行檢測，根據(jù) PCR反應(yīng)的Ct值分析此方法對于不同濃度摻假的摻假檢出限。檢出限（LOD）統(tǒng)計(jì)分析參照 Probitanalysis。比較5組引物和探針的摻假檢出限（相對靈敏度），分析引物和探針的特異性和保守性與摻假檢出限之間的相關(guān)性；（六） 定量分析：以模板質(zhì)量濃度和摻假濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和摻假定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析引物和探針的特異性和保守性與擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)的相關(guān)性；利用已知濃度的盲樣驗(yàn)證定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的適用性，通過擴(kuò)增效率（90%-110%）、相關(guān)系數(shù)R2（≥0.99）以及回收率（90%-110%）評價(jià)5組引物和探針的定量分析能力，分析引物和探針的特異性和保守性與定量分析能力之間的關(guān)系；（七）相關(guān)數(shù)據(jù)已經(jīng)進(jìn)行論文投稿以及專利申請。目前發(fā)表SCI論文2篇，在投稿SCI論文3篇，中文核心論文8篇，申請國家發(fā)明專利8項(xiàng)（授權(quán)1項(xiàng)）。最終通過上述實(shí)驗(yàn)確定山羊和黃牛源性成分同步檢測的引物和探針以及絕對靈敏度（1pg）和相對靈敏度（0.1-1%）。此方法具有山羊和黃牛源性的特異性，來源于山羊和黃牛的肉乳樣品均出現(xiàn)相應(yīng)探針的典型擴(kuò)