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公告附件1《允許保健食品聲稱的保健功能目錄非營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑(2020年版(征求意見稿》序號(hào)序號(hào)保健功能備注1234567891011121314有助于增強(qiáng)免疫力功能有助于抗氧化功能輔助改善記憶功能緩解視覺(jué)疲勞功能清咽潤(rùn)喉功能有助于改善睡眠功能緩解體力疲勞功能耐缺氧功能后有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪功能有助于改善骨密度功能改善缺鐵性貧血功能有助于改善痤瘡功能有助于改善皮膚水份狀況功能1515161718192021222324有助于調(diào)節(jié)腸道菌群功能有助于消化功能有助于潤(rùn)腸通便功能輔助保護(hù)胃粘膜功能有助于維持血脂健康水平(膽固醇/甘油三酯)功能有助于維持血糖健康水平功能后有助于維持血壓健康水平功能對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能對(duì)電離輻射危害有輔助保護(hù)功能有助于排鉛功能《保健食品功能評(píng)價(jià)方法(2020年版)(征求意見稿》目錄第一部分、保健食品評(píng)價(jià)試驗(yàn)項(xiàng)目、試驗(yàn)原則及結(jié)果判1一、有助于增強(qiáng)免疫力功能 1二、有助于抗氧化功能 1三、輔助改善記憶功能 2四、緩解視覺(jué)疲勞功能 3五、清咽潤(rùn)喉功能 3六、有助于改善睡眠功能 4七、緩解體力疲勞功能 4八、耐缺氧功能 5九、有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪功能 5十、有助于改善骨密度功能 6十一、改善缺鐵性貧血功能 7十二、有助于改善痤瘡功能 7十三、有助于改善黃褐斑功能 8十四、有助于改善皮膚水份狀況功8十五、有助于調(diào)節(jié)腸道菌群功8十六、有助于消化功能 9十七、有助于潤(rùn)腸通便功能 10十八、輔助保護(hù)胃粘膜功能 11十九、有助于維持血脂健康水平(膽固甘油三酯)功能 11二十、有助于維持血糖健康水平功13二十一、有助于維持血壓健康水平功14二十二、對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功14二十三、對(duì)電離輻射危害有輔助保護(hù)功15二十四、有助于排鉛功能 16第二部分功能學(xué)檢驗(yàn)方法 17一、有助于增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)方17二、有助于抗氧化功能檢驗(yàn)方30三、輔助改善記憶功能檢驗(yàn)方51四、緩解視覺(jué)疲勞功能檢驗(yàn)方62五、清咽潤(rùn)喉功能檢驗(yàn)方法 65六、有助于改善睡眠功能檢驗(yàn)方71七、緩解體力疲勞功能檢驗(yàn)方74八、耐缺氧功能檢驗(yàn)方法 80九、有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪功能檢驗(yàn)方82十、有助于改善骨密度功能檢驗(yàn)方86十一、改善缺鐵性貧血功能檢驗(yàn)方93十二、有助于改善痤瘡功能檢驗(yàn)方104十三、有助于改善黃褐斑功能檢驗(yàn)方106十四、有助于改善皮膚水份狀況功能檢驗(yàn)方108十五、有助于調(diào)節(jié)腸道菌群功能檢驗(yàn)方110十六、有助于消化功能檢驗(yàn)方115十七、有助于潤(rùn)腸通便功能檢驗(yàn)方十八、輔助保護(hù)胃粘膜功能檢驗(yàn)方124十九、有助于維持血脂健康水平(膽固甘油三酯)功能檢驗(yàn)方法 128二十、有助于維持血糖健康水平功能檢驗(yàn)方134二十一、有助于維持血壓健康水平功能檢驗(yàn)方144二十二、對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能檢驗(yàn)方147二十三、對(duì)電離輻射危害有輔助保護(hù)功能檢驗(yàn)方154二十四、有助于排鉛功能檢驗(yàn)方162PAGEPAGE26第一部分、保健食品評(píng)價(jià)試驗(yàn)項(xiàng)目、試驗(yàn)原則及結(jié)果判定有助于增強(qiáng)免疫力功能試驗(yàn)項(xiàng)目體重臟器//體重比值細(xì)胞免疫功能測(cè)定:小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)體液免疫功能測(cè)定:抗體生成細(xì)胞檢測(cè),血清溶血素測(cè)定—巨噬細(xì)胞功能測(cè)定:小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn),小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)NK細(xì)胞活性測(cè)定試驗(yàn)原則所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。采用正?;蛎庖吖δ艿拖碌哪P蛣?dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果判定有助于增強(qiáng)免疫力功能判定:在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核—巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性四個(gè)方面任兩個(gè)方面結(jié)果陽(yáng)性,可判定該受試樣品具有有助于增強(qiáng)免疫力功能作用。其中細(xì)胞免疫功能測(cè)定項(xiàng)目中的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性,或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽(yáng)性,可判定細(xì)胞免疫功能測(cè)定結(jié)果陽(yáng)性。體液免疫功能測(cè)定項(xiàng)目中的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性,或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量—NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的一個(gè)以上劑量組結(jié)果陽(yáng)性,可判定NK細(xì)胞活性結(jié)果陽(yáng)性。有助于抗氧化功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重脂質(zhì)氧化產(chǎn)物:丙二醛或血清表氫氧異前列腺素(8-Isoprostane)蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物:蛋白質(zhì)羰基抗氧化酶:超氧化物歧化酶或谷胱甘肽過(guò)氧化物酶抗氧化物質(zhì):還原型谷胱甘肽人體試食試驗(yàn)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物:丙二醛或血清表氫氧異前列腺素(8-Isoprostane)超氧化物歧化酶谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列的指標(biāo)均為必測(cè)項(xiàng)目。脂質(zhì)氧化產(chǎn)物指標(biāo)中丙二醛和血清標(biāo)中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶任選其一進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。氧化損傷模型動(dòng)物和老齡動(dòng)物任選其一進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定受試樣品有助于抗氧化功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。體健康無(wú)影響,可判定該受試樣品具有有助于抗氧化功能的作用。輔助改善記憶功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)避暗實(shí)驗(yàn)穿梭箱實(shí)驗(yàn)水迷宮實(shí)驗(yàn)人體試食試驗(yàn)指向記憶聯(lián)想學(xué)習(xí)圖象自由回憶無(wú)意義圖形再認(rèn)人像特點(diǎn)聯(lián)系回憶記憶商試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)為必做項(xiàng)目??啃?。正常動(dòng)物與記憶障礙模型動(dòng)物任選其一。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)重復(fù)一次(重新飼養(yǎng)動(dòng)物,重復(fù)所做實(shí)驗(yàn)。人體試食試驗(yàn)統(tǒng)一使用臨床記憶量表。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定動(dòng)物實(shí)驗(yàn):跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)四項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中任二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。且重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(所重復(fù)的同一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)兩次結(jié)果均為陽(yáng)性結(jié)果陽(yáng)性。人體試食試驗(yàn):記憶商結(jié)果陽(yáng)性,可判定該受試樣品具有輔助改善記憶功能的作用。緩解視覺(jué)疲勞功能人體試食試驗(yàn)項(xiàng)目調(diào)查;于試驗(yàn)前進(jìn)行一次胸片、心電圖、腹部B超檢查。明視持久度視力試驗(yàn)原則60天。所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定試驗(yàn)組自身比較或試驗(yàn)組與對(duì)照組組間比較,癥狀改善且癥狀總積分差異有顯著性P<0.0。試驗(yàn)組自身比較或試驗(yàn)組與對(duì)照組組間比較,明視持久度差異有顯著性<0.0510%。具備4.3.1及4.3.2可判定該受試物具有緩解視覺(jué)疲勞功能。清咽潤(rùn)喉功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重大鼠棉球植入實(shí)驗(yàn)大鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)人體試食試驗(yàn):咽部癥狀、體征試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。應(yīng)對(duì)臨床癥狀、體征進(jìn)行觀察。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定可判定該受試樣品清咽功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。征的改善率明顯增加,可判定該受試樣品具有清咽潤(rùn)喉功能。有助于改善睡眠功能試驗(yàn)項(xiàng)目體重延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)戊巴比妥鈉(或巴比妥鈉)閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)原則所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。需觀察受試樣品對(duì)動(dòng)物直接睡眠的作用。結(jié)果判定延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉(或巴比妥鈉)期實(shí)驗(yàn)三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中任二項(xiàng)陽(yáng)性,且無(wú)明顯直接睡眠作用,可判定該受試樣品具有有助于改善睡眠功能的作用。緩解體力疲勞功能實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物體重負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)血乳酸血清尿素肝糖原或肌糖原試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。實(shí)驗(yàn)前必須對(duì)同批受試樣品進(jìn)行違禁藥物的檢測(cè)。運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)與生化指標(biāo)檢測(cè)相結(jié)合。結(jié)果判定/受試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用。耐缺氧功能試驗(yàn)項(xiàng)目體重常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)原則所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。結(jié)果判定判定該受試樣品具有耐缺氧功能的作用。有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重、體重增重?cái)z食量、攝入總熱量體內(nèi)脂肪重量(睪丸及腎周圍脂肪墊)脂/體比人體試食試驗(yàn)體重腰圍、臀圍體內(nèi)脂肪含量試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中大鼠肥胖模型法和預(yù)防大鼠肥胖模型法任選其一。減少體內(nèi)多余脂肪,不單純以減輕體重為目標(biāo)。引起腹瀉或抑制食欲的受試樣品不能作為有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪功能食品。每日營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量應(yīng)基本保證機(jī)體正常生命活動(dòng)的需要。對(duì)機(jī)體健康無(wú)明顯損害。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對(duì)同批受試樣品進(jìn)行違禁藥物的檢測(cè)。試食試驗(yàn)。不替代主食的有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪功能試驗(yàn),應(yīng)對(duì)試食前后的受試者膳食和運(yùn)動(dòng)狀況進(jìn)行觀察。每日膳食進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)估。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定/體比低于模型對(duì)照組,差異人體試食試驗(yàn):有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪功能的作用。脂肪四個(gè)點(diǎn)中至少有兩個(gè)點(diǎn)減少,腰圍與臀圍之一減少,且差異有顯著性P<0.0,微量元素、維生素營(yíng)養(yǎng)學(xué)影響,可判定該受試樣品具有有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪功能的作用。有助于改善骨密度功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn):分為方案一(補(bǔ)鈣為主的受試物)和方案二(不含鈣或不以補(bǔ)鈣為主的受試物)兩種。體重骨鈣含量骨密度試驗(yàn)原則根據(jù)受試樣品作用原理的不同,方案一和方案二任選其一進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。范圍內(nèi)的鈣源及來(lái)自普通食品的鈣源(如可食動(dòng)物的骨、奶等,可以不進(jìn)行鈣的吸收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果判定方案一照組,可判定該受試樣品具有有助于改善骨密度功能的作用。方案二助于改善骨密度功能的作用。不以補(bǔ)鈣為主(可少量含鈣)低于相應(yīng)劑量的碳酸鈣對(duì)照組,鈣的吸收率不低于碳酸鈣對(duì)照組,可判定該受試樣品具有有助于改善骨密度功能的作用。改善缺鐵性貧血功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重血紅蛋白/紅細(xì)胞游離原卟啉人體試食試驗(yàn)血紅蛋白血清鐵蛋白/血清運(yùn)鐵蛋白飽和度試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。針對(duì)兒童的人體試食試驗(yàn),只測(cè)血紅蛋白和紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定/試樣品改善缺鐵性貧血功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。人體試食試驗(yàn)品具有改善缺鐵性貧血功能作用。/蛋白飽和度二項(xiàng)指標(biāo)一項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性,可判定該受試樣品具有改善缺鐵性貧血功能作用。有助于改善痤瘡功能人體試食試驗(yàn)項(xiàng)目痤瘡數(shù)量皮損狀況皮膚油份試驗(yàn)原則所列的指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。試驗(yàn)前后應(yīng)針對(duì)固定皮膚范圍內(nèi)的痤瘡數(shù)量及皮損狀況進(jìn)行分析。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定試食組痤瘡數(shù)量明顯減少且大于等于20%,皮損程度積分明顯減少,差異均有顯著性,皮膚油份不顯著增加,可判定該受試樣品具有有助于改善痤瘡功能的作用。有助于改善黃褐斑功能人體試食試驗(yàn)項(xiàng)目黃褐斑面積黃褐斑顏色試驗(yàn)原則所列的指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。試驗(yàn)前后應(yīng)針對(duì)固定皮膚范圍內(nèi)的黃褐斑面積及顏色進(jìn)行分析。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定試食組黃褐斑面積明顯減少且大于等于斑,可判定該受試樣品具有有助于改善黃褐斑功能的作用。有助于改善皮膚水份狀況功能人體試食試驗(yàn)項(xiàng)目:皮膚水份試驗(yàn)原則皮膚水份值的測(cè)定點(diǎn)試驗(yàn)前后應(yīng)保持一致。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定功能的作用。有助于調(diào)節(jié)腸道菌群功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重雙歧桿菌乳桿菌腸球菌腸桿菌產(chǎn)氣莢膜梭菌人體試食試驗(yàn)雙歧桿菌乳桿菌腸球菌腸桿菌擬桿菌產(chǎn)氣莢膜梭菌試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。正常動(dòng)物或腸道菌群紊亂模型動(dòng)物任選其一。受試樣品中含雙歧桿菌、乳桿菌以外的其它益生菌時(shí),應(yīng)在動(dòng)物和人體試驗(yàn)中加測(cè)該益生菌。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定動(dòng)物實(shí)驗(yàn):符合以下任一項(xiàng),可判定該受試樣品有助于調(diào)節(jié)腸道菌群功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。/或乳桿菌(或其它益生菌)變化。/或乳桿菌(或其它益生菌)/增加,但增加的幅度低于雙歧桿菌、乳桿菌(或其它益生菌)增加的幅度。人體試食試驗(yàn):符合以下任一項(xiàng),可判定該受試樣品具有有助于調(diào)節(jié)腸道菌群功能的作用。/或乳桿菌(或其它益生菌)菌無(wú)明顯變化。/或乳桿菌(或其它益生菌)/桿菌明顯增加,但增加的幅度低于雙歧桿菌、乳桿菌(或其它益生菌)增加的幅度。有助于消化功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重、體重增重、攝食量和食物利用率小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)消化酶測(cè)定人體試食試驗(yàn)兒童方案食欲食量偏食狀況體重血紅蛋白含量成人方案臨床癥狀觀察胃/腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。根據(jù)受試樣品的適用人群特點(diǎn)在人體試食試驗(yàn)方案中任選其一。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定面實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性,可判定該受試樣品有助于消化功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。人體試食試驗(yàn)指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性,可判定該受試樣品具有有助于消化功能的作用。助于消化功能的作用。有助于潤(rùn)腸通便功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)排便時(shí)間糞便重量糞便粒數(shù)糞便性狀人體試食試驗(yàn)癥狀體征糞便性狀排便次數(shù)排便狀況試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。除對(duì)便秘模型動(dòng)物各項(xiàng)必測(cè)指標(biāo)進(jìn)行觀察外,還應(yīng)對(duì)正常動(dòng)物進(jìn)行觀察,不得引起動(dòng)物明顯腹瀉。排便次數(shù)的觀察時(shí)間試驗(yàn)前后應(yīng)保持一致。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定定該受試樣品有助于通便功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。具有有助于潤(rùn)腸通便功能的作用。輔助保護(hù)胃粘膜功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重胃粘膜損傷大體觀察胃粘膜組織病理學(xué)檢查人體試食試驗(yàn)臨床癥狀體征胃鏡觀察試驗(yàn)原則驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。無(wú)水乙醇、消炎痛致急性胃粘膜損傷模型或冰醋酸致慢性胃潰瘍模型任選其一進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定可判定該受試樣品具有輔助保護(hù)胃粘膜功能的作用。有助于維持血脂健康水平(/甘油三酯)功能根據(jù)血脂異常的類型,有助于維持血脂健康水平(甘油三酯)分類的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)。試驗(yàn)項(xiàng)目根據(jù)受試樣品的作用機(jī)制,分成三種情況有助于維持血脂健康水平功能:同時(shí)維持血總膽固醇和血甘油三酯健康水平有助于維持血膽固醇健康水平功能:?jiǎn)渭兙S持血膽固醇健康水平有助于維持血甘油三酯健康水平功能:?jiǎn)渭兙S持血甘油三酯健康水平觀察指標(biāo)體重血清總膽固醇血清甘油三酯血清高密度脂蛋白膽固醇血清低密度脂蛋白膽固醇人體試食試驗(yàn)血清總膽固醇血清甘油三酯血清高密度脂蛋白膽固醇血清低密度脂蛋白膽固醇試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列指標(biāo)均為必測(cè)項(xiàng)目。根據(jù)受試樣品的作用機(jī)制,可在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)動(dòng)物模型中任選一項(xiàng)。根據(jù)受試樣品的作用機(jī)制,可在人體試食試驗(yàn)的三個(gè)方案中任選一項(xiàng)。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定動(dòng)物實(shí)驗(yàn):混合型高脂血癥動(dòng)物模型有助于維持血脂健康水平(甘油三酯)三酯升高,血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇升高,差異均有顯著性,判定模型成立。各劑量組與模型對(duì)照組比較,任一劑量組血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低,且任一劑量組血清甘油三酯降低,差異均有顯著性,同時(shí)各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對(duì)照組,可判定該受試樣品有助于維持血脂健康水平動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。各劑量組與模型對(duì)照組比較,任一劑量組血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低,差異均有顯著性,同時(shí)各劑量組血清甘油三酯不顯著高于模型對(duì)照組,各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對(duì)照組,可判定該受試樣品有助于維持血膽固醇健康水平功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。各劑量組與模型對(duì)照組比較,任一劑量組血清甘油三酯降低,差異均有顯著性,同時(shí)各劑量組血清總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇不顯著高于模型對(duì)照組,血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對(duì)照組,可判定該受試樣品有助于維持血甘油三酯健康水平功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。高膽固醇血癥動(dòng)物模型模型對(duì)照組和空白對(duì)照組比較,血清總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇升高,差異有顯著性,血清甘油三酯總膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇降低,差異有顯著性,并且各劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇不顯著低于模型對(duì)照組,血清甘油三酯不顯著高于模型對(duì)照組,可判定該受試樣品有助于維持血膽固醇健康水平功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。人體試食試驗(yàn)指標(biāo)判定標(biāo)準(zhǔn):有效:TC降低>10%或降至正常;TG降低>15%或降至正常;HDL-C上升>0.104mmol/L。無(wú)效:未達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)者。有助于維持血脂健康水平(甘油三酯)功能結(jié)果判定可判定該受試樣品有助于維持血脂健康水平(/甘油三酯)人體試食試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。有助于維持血膽固醇健康水平功能結(jié)果判定膽固醇有效率顯著高于對(duì)照組,可判定該受試樣品有助于維持血膽固醇健康水平功能人體試食試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。有助于維持血甘油三酯健康水平功能結(jié)果判定性。有助于維持血糖健康水平功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為方案一(胰島損傷高血糖模型)和方案二(胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型)兩種方案一(胰島損傷高血糖模型)體重空腹血糖糖耐量方案二(脂代謝紊亂模型)體重空腹血糖糖耐量胰島素總膽固醇甘油三酯人體試食試驗(yàn)空腹血糖2小時(shí)血糖糖化血紅蛋白或糖化血清蛋白總膽固醇甘油三酯試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。根據(jù)受試樣品作用原理不同,方案一和方案二動(dòng)物模型任選其一進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。除對(duì)高血糖模型動(dòng)物進(jìn)行所列指標(biāo)的檢測(cè)外,應(yīng)進(jìn)行受試樣品對(duì)正常動(dòng)物空腹血糖影響的觀察。人體試食試驗(yàn)可在臨床治療的基礎(chǔ)上進(jìn)行。應(yīng)對(duì)臨床癥狀和體征進(jìn)行觀察。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定動(dòng)物實(shí)驗(yàn):樣品有助于維持血糖健康水平動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。方案二:空腹血糖和糖耐量二項(xiàng)指標(biāo)中一項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性,血脂(總膽固醇、甘油三酯)正常動(dòng)物空腹血糖無(wú)影響,即可判定該受試樣品有助于維持血糖健康水平功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。人體試食試驗(yàn):空腹血糖、餐后2小時(shí)血糖、糖化血紅蛋白(或糖化血清蛋白、血脂四項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著升高,且空腹血糖、餐后2樣品具有有助于維持血糖健康水平功能的作用。有助于維持血壓健康水平功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重血壓心率人體試食試驗(yàn)臨床癥狀與體征血壓心率試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇高血壓模型動(dòng)物和正常動(dòng)物進(jìn)行所列指標(biāo)的觀察。人體試食試驗(yàn)可在臨床治療的基礎(chǔ)上進(jìn)行。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定判定該受試樣品有助于維持血壓健康水平功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。壓健康水平功能的作用。對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為方案一(四氯化碳肝損傷模型)和方案二(酒精肝損傷模型)兩種。方案一(四氯化碳肝損傷模型)體重谷丙轉(zhuǎn)氨酶谷草轉(zhuǎn)氨酶肝組織病理學(xué)檢查方案二(酒精肝損傷模型)體重丙二醛還原型谷胱甘肽甘油三酯肝組織病理學(xué)檢查試驗(yàn)原則所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。根據(jù)受試樣品作用原理的不同,方案一和方案二任選其一進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。結(jié)果判定方案一(四氯化碳肝損傷模型可判定該受試樣品具有對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能作用。方案二(酒精肝損傷模型:①肝臟MD、GSTG三項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性,可判定該受試樣品對(duì)乙醇引起的肝損傷有輔助保護(hù)功能,②肝臟MDAGSHTG判定該受試樣品具有對(duì)乙醇引起的肝損傷有輔助保護(hù)功能作用。對(duì)電離輻射危害有輔助保護(hù)功能實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目體重外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)骨髓細(xì)胞DNA含量或骨髓有核細(xì)胞數(shù)小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)血/組織中超氧化物歧化酶活性實(shí)驗(yàn)血清溶血素含量實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原則外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓細(xì)胞DNA含量或骨髓有核細(xì)胞數(shù)、小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、血/組織中超氧化物歧化酶活性實(shí)驗(yàn)、血清溶血素含量實(shí)驗(yàn)中任選擇三項(xiàng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果判定在外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓細(xì)胞DNA含量或骨髓有核細(xì)胞數(shù)、小鼠骨髓細(xì)胞微核、血/組織中超氧化物歧化酶活性、血清溶血素含量五項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中任何二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性,可判定該受試樣品具有對(duì)電離輻射危害有輔助保護(hù)功能的作用。有助于排鉛功能試驗(yàn)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重血鉛骨鉛肝組織鉛人體試食試驗(yàn)血鉛尿鉛尿鈣尿鋅試驗(yàn)原則動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。應(yīng)對(duì)臨床癥狀、體征進(jìn)行觀察。對(duì)尿鉛進(jìn)行多次測(cè)定,以了解體內(nèi)鉛的排出情況。在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí),應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。結(jié)果判定受試樣品動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。于總尿鉛排出增加的幅度,可判定該受試樣品具有有助于排鉛功能的作用。第二部分功能學(xué)檢驗(yàn)方法一、有助于增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物推薦用近交系小鼠,18-22g,單一性別,每組10-15只。劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)陰性對(duì)照組,以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組,另設(shè)二個(gè)劑量組,必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。受試樣品給予時(shí)間30天,必要時(shí)可延長(zhǎng)至45天。免疫模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)方法ConA可任選下列方法之一MTT法原理當(dāng)T淋巴細(xì)胞受ConA刺激后發(fā)生母細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng),活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞中的線粒體水解酶可將MTT(一種淡黃色的唑氮鹽)分解為蘭紫色結(jié)晶,其光密度值能反映細(xì)胞的增殖情況。儀器和材料RPMI16402巰基乙醇2-MConHank'sPBS緩沖液(pH7.2-7.4)紗布或2002496孔培養(yǎng)板(平底721光光度計(jì)、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌器、無(wú)菌濾器。實(shí)驗(yàn)步驟試劑配制完全培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)液過(guò)濾除菌,用前加入101谷氨酰胺200mmol/,青霉素(100U/m100μg/及5×105mol/L的21mol/L的HCl或1mol/L的NaOH調(diào)pH至7.0-7.2,即完全培養(yǎng)液。ConA液用雙蒸水配制成100μg/mL的溶液,過(guò)濾除菌,在低溫冰箱無(wú)菌Hank's3.5%的無(wú)菌NaHCO3pH7.2-7.4。MTT5mgMTT1mLpH7.2的PBS中,現(xiàn)配現(xiàn)用。酸性異丙醇溶液96mL4mL1mol/LHCl,臨用前配制。脾細(xì)胞懸液制備無(wú)菌取脾,置于盛有適量無(wú)菌Hank's液平皿中,用鑷子輕輕將脾磨碎,制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩4Hank's液洗210mi1000r/mi1mL的完全培養(yǎng)液中,用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95以上,調(diào)整細(xì)胞濃度為×16個(gè)/m。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)將每一份脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中,每孔1m,一孔加75μLA液(相當(dāng)于7.5μg/m,5%CO2,37℃CO272h4h,每孔輕輕吸去上清液0.7mL,加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,同時(shí)加入MTT(5mg/mL)50μL4h1mL酸性異丙醇,吹打混勻,使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到963個(gè)平570nm2mL分光光度計(jì)上在570nm測(cè)定OD值。數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定F值,F(xiàn)<F0.05,結(jié)值≥F0.05,P≤0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力,受試樣品組的光密度差值顯著高于對(duì)照組的光密度差值,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。注意事項(xiàng)本實(shí)驗(yàn)中ConA的濃度很重要,過(guò)低不能刺激足夠的細(xì)胞增殖,過(guò)高會(huì)抑制細(xì)胞增殖,不同批號(hào)的ConA在實(shí)驗(yàn)前要進(jìn)行預(yù)試,以找到最佳濃度。同位素?fù)饺敕ㄔ鞹淋巴細(xì)胞在有絲分裂原PHAConARNA合成明顯增加,如在培養(yǎng)液中加入H-胸腺嘧啶核苷H-Td映淋巴細(xì)胞增殖的程度。儀器和材料RPMI-164022-MConHank'sPBS(pH7.2-7.3H-Td[2,5PP0.51,4-5苯基惡唑基POPO)0.25g500mL混勻]20096孔培養(yǎng)板(平底49型玻璃纖維濾紙。實(shí)驗(yàn)步驟脾細(xì)胞懸液制備無(wú)菌取脾,置于盛有適量無(wú)菌Hank's液的小平皿中,用鑷子輕輕將脾撕碎,制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾,用Hank's液洗3次,每次離心10mi(1000r/mi。然后將細(xì)胞懸浮于2mL用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95以上,最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)成×16個(gè)/m。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)2將脾細(xì)胞懸液加入到96200μL63孔加3個(gè)孔不加ConA作為對(duì)照。置5%CO72h,培養(yǎng)結(jié)束前6h,每孔加入3H-TdR20μL,使其終濃度為(3.7-18.5)×104Bq/mL。用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測(cè)量瓶中,加入7mL閃爍液,用液閃儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)cp。2數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定0.05F值,F(xiàn)<F0.05,結(jié)值≥F,P≤0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。0.05以每分鐘脈沖數(shù)(cpm)表示增殖程度,用刺激指數(shù)(SI)來(lái)表示SI=實(shí)驗(yàn)孔cpm對(duì)照孔cpm受試樣品組的SI值顯著高于對(duì)照組的SI值,即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)可任選下列方法之一二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH(耳腫脹法)原理二硝基氟苯T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴4~724~48h程度可以反應(yīng)映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。材料DNFB、丙酮、麻油、硫化鋇、打孔器。實(shí)驗(yàn)步驟試劑配制DNFB溶液DNFB5mL丙酮麻油溶液(=:,倒入小瓶,蓋好瓶塞并用膠布密封?;靹蚝螅?50μL,用DNFB50μL均勻涂抹致敏。DTH的產(chǎn)生與測(cè)定5DNFB10μL(兩面24h頸椎脫臼處死小鼠,剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8mm的耳片,稱重。數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定F值,F(xiàn)<F0.05,結(jié)值≥F0.05,P≤0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用左右耳重量之差表示DTH的程度。受試樣品組的重量差值顯著高于與對(duì)照組的重量差值,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。注意事項(xiàng)操作時(shí)應(yīng)避免DNFB與皮膚接觸。綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠DTH(足跖增厚法)原理SRBCTSRBC腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。材料游標(biāo)卡尺(精密度0.02mSRB、微量注射器50μ。實(shí)驗(yàn)步驟致敏小鼠用2(v/SRBC腹腔或靜脈免疫,每只鼠注射0.2m(約×18個(gè)SRB。DTH的產(chǎn)生與測(cè)定免疫后4每只鼠20μ(約×108個(gè)SRB,注射后于24h測(cè)量左后足跖部厚度,同一部位測(cè)量三次,取平均值。數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定0.05一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊,計(jì)算F值,F(xiàn)<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性值≥F,P≤ ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法0.050.05行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以攻擊前后足跖厚度的差值來(lái)表示DTH的程度。受試樣品組的差值顯著高于對(duì)照組的差值,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。注意事項(xiàng)攻擊時(shí)所用的SRBC要新鮮1周??贵w生成細(xì)胞檢測(cè)(Jerne改良玻片法)原理經(jīng)過(guò)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫的小鼠脾細(xì)胞懸液與一定量的SRBC混合,在補(bǔ)體參與下,使分泌抗體的脾細(xì)胞周圍的SRBC溶解,形成肉眼可見的空斑。溶血空斑數(shù)可反映抗體生成細(xì)胞數(shù)。儀器和材料200SRBC(豚鼠血清RPMI1640SA緩沖液、瓊脂糖。實(shí)驗(yàn)步驟SRBC 2周。制備補(bǔ)體采集豚鼠血,分離出血清(至少5只豚鼠的混合血清,將1mL壓積SRBC加入到5mL豚鼠血清中,4℃冰箱放置30min,經(jīng)常振蕩,離心取上清,分裝,-70℃保存。用時(shí)以SA緩沖液按1:8-15稀釋。玻片涂膜在清潔玻片上刷上一薄層瓊脂糖0.5g瓊脂糖加雙蒸水至100m,加熱溶解,干后可長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?。免疫?dòng)物取脫纖維的羊血,用生理鹽水洗滌3次,每次離心(2000r/min)10min,計(jì)數(shù)細(xì)胞,每只鼠經(jīng)腹腔或靜脈注射SRBC5×107~2×108個(gè)。也可將壓積SRBC2%(v/v)的細(xì)胞懸液,。脾細(xì)胞懸液制備SRBC4~5天后的小鼠頸椎脫臼處死,取出脾臟,放在盛有Hank's2004層紗布將脾磨碎,離心Hank's液洗2遍,最后將細(xì)胞懸浮在5mLRPMI1640培養(yǎng)液中,計(jì)數(shù)細(xì)胞,并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5x106個(gè)8mLHank's液。空斑的測(cè)定將表層培養(yǎng)基瓊脂糖加雙蒸水至100mL)加熱溶解后,放45~50℃水浴保溫,與等量pH7.2~7.42倍濃度的Hank's0.5m50μL10%(v/SA緩沖液配制,20μL脾細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/mL)或25μL脾細(xì)胞懸液,迅速混勻,傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上,做平行片,待瓊脂凝固后,將玻片水平扣放在片架上,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1~1.5h,然后用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體(1:8)加入到玻片架凹槽內(nèi),繼續(xù)溫育1~1.5h后,計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定0.05F值,F(xiàn)<F0.05,結(jié)值≥F,P0.050.05行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。/105/該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。血清溶血素的測(cè)定可任選下列方法之一。血凝法原理用SRBC免疫動(dòng)物后,產(chǎn)生抗SRBC抗體(溶血素,利用其凝集SRBC的程度來(lái)檢測(cè)溶血素的水平。儀器和材料SRBC、生理鹽水、微量血凝實(shí)驗(yàn)板、離心機(jī)實(shí)驗(yàn)步驟SRBC綿羊頸靜脈取血,將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中,朝一個(gè)方向搖動(dòng),以脫纖維,放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?,可保?周。3次,每次離心。將壓積SRBC用生理鹽水配成的細(xì)胞懸液,每只鼠腹腔注射0.2mL4~51h10min,收集血清。凝集反應(yīng)用生理鹽水將血清倍比稀釋,將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi),每孔100μL100μL0.5%(v/v)SRBC懸液,混勻,裝入濕潤(rùn)的平盤內(nèi)加蓋,于37數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定F值,F(xiàn)<F0.05,結(jié)值≥F0.05,P≤0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。血清凝集程度一般分為5級(jí)(0-IV)照組的抗體水平,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。抗體水平=(S1+2S2+3S3……nSn)式中1、2、3……n代表對(duì)倍稀釋的指數(shù),S代表凝集程度的級(jí)別,抗體積數(shù)越大,表示血清抗體越高。0級(jí)紅細(xì)胞全部下沉,集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀,四周液體清晰。級(jí)紅細(xì)胞大部分沉集在孔底成園點(diǎn)狀,四周有少量凝集的紅細(xì)胞。級(jí)凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層,中心可以明顯見到一個(gè)疏松的紅點(diǎn)。IIIIV級(jí)凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層,凝塊有時(shí)成卷折狀。注意事項(xiàng)血清稀釋時(shí)要充分混勻。最后一個(gè)稀釋度應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。半數(shù)溶血值的測(cè)定原理用SRBC免疫動(dòng)物后,血清中出現(xiàn)SRBC抗體(溶血素,在補(bǔ)體參與下,與SRBC溶血反應(yīng),釋放血紅蛋白,通過(guò)測(cè)定血紅蛋白含量反映動(dòng)物血清中溶血素的含量。儀器和材料721SRBC、補(bǔ)體(豚鼠血清SA緩沖液、都氏試劑(1.0g0.2g0.05g實(shí)驗(yàn)步驟SRBC2周。制備補(bǔ)體采集豚鼠血,分離出血清(至少5只豚鼠的混合血清,將1mL壓積SRBC加入到5mL豚鼠血清中,放4℃冰箱30min,經(jīng)常振蕩,離心取上清,分裝,-70℃保存。用時(shí)以SA液按1:8稀釋。3次,每次離心。將壓積SRBC用生理鹽水配成的細(xì)胞懸液,每只鼠腹腔注射0.2mL4~51h,使血清充分析出,2000r/min10min6000r/min,4min,收集血清。溶血反應(yīng)分光光度計(jì)法取血清用SA緩沖液稀釋(200~500倍1mL10%(v/v)SRBC0.5mLSA1:8稀釋。另設(shè)不加血清的對(duì)照管(SA緩沖液代替3715~30min2000r/min10%(v/v)SRBC0.25mL4mL10min處以對(duì)照管作空白,分別測(cè)定各管光密度值。酶標(biāo)儀法設(shè)樣品孔和空白對(duì)照孔,樣品孔:取血清用SA緩沖液稀釋(一般20~500倍;每孔10%(v/v)SRBC25μL,補(bǔ)體50(用SA溶液按1:8稀釋3℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫30mi1500r/min水平離心10mi,然后樣品孔和空白對(duì)照孔各取上清液50μL96孔培養(yǎng)板內(nèi),加都氏試劑。同時(shí)設(shè)半數(shù)溶血孔10%(v/v)SRBC12.5μL200μL10min540nm處用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度值。3.4.2.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定0.05一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊,計(jì)算F值,F(xiàn)<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性值≥F ,P≤ ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法0.050.05行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。HC HC 溶血素的量以半數(shù)溶血( 表示按下列公式計(jì)算HC HC 50 50 50可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。HC= 樣品光密度值HC50 SRBC

×稀釋倍數(shù)小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)原理在一定范圍內(nèi),體內(nèi)碳顆粒被清除速率與血碳濃度呈指函數(shù)關(guān)系。以血碳濃度對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo),兩者呈直線關(guān)系。此直線斜率(K)物肝、脾重量影響吞噬速率,一般以校正吞噬指數(shù)a表示。儀器和試劑721分光光度計(jì)、計(jì)時(shí)器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO3實(shí)驗(yàn)步驟溶液配制注射用墨汁將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋3~4倍。Na2CO3溶液取0.1gNa2CO3,加蒸餾水至100mL。注射墨汁按體重從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁10ml/k,待墨汁注入,立即計(jì)時(shí)。測(cè)定2,并立即將其加到2mL721分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值O,以Na2C3溶液作空白對(duì)照,也可用酶標(biāo)儀在600nm測(cè)光密度值O。將小鼠處死,取肝臟和脾臟,用濾紙吸干臟器表面血污,分別稱重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)a。受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對(duì)照組的吞噬指數(shù),可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。lgOD-lgOD1 2K=───────t-t2 1吞噬指數(shù)a=

體重 k肝重+脾重k數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定0.05F值,F(xiàn)<F0.05,結(jié)值≥F,P0.050.05行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。注意事項(xiàng)靜脈注入碳粒的量、取血時(shí)間、取血量一定要準(zhǔn)確。墨汁放置中,碳粒可沉于瓶底,臨用前應(yīng)搖勻。使用新的墨汁時(shí),應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前摸索一個(gè)最適墨汁注入量,即正常小鼠在20min內(nèi)不易廓清??扇芜x下列方法之一。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(滴片法)原理噬率和吞噬指數(shù),據(jù)此判定巨噬細(xì)胞的吞噬能力。儀器和材料:顯微鏡、37℃孵箱、計(jì)數(shù)器、手術(shù)器械一套、注射器、滴管、膠頭吸管、吸耳球、載玻片、染色槽、試管玻片處理巨噬細(xì)胞粘附和鏡檢。在玻片上標(biāo)號(hào),用3%瓊脂(配方見試劑部分)每個(gè)玻片上劃兩個(gè)圓圈(圓圈必須全封閉,否則液體會(huì)流出,晾干備用。搪瓷或塑料盒:內(nèi)墊半濕紗布(用溫水濕透,置于孵箱內(nèi)備用,紗布一定要平整。試劑配制方法3.6.1.2.3.1取瓊脂3g,加水100mL,加熱煮沸至透明,加入1%的溴甲酚紫指示劑1-2滴。3.6.1.2.3.2PBS緩沖液的配制方法:KH2PO46.66g,Na2HPO4·12H2O6.38g,將上述試劑溶于1000mL蒸餾水中調(diào)pH值至7.2即成。3.6.1.2.3.31%雞紅細(xì)胞懸液:實(shí)驗(yàn)前取雞頸靜脈或動(dòng)脈血,置于盛有玻璃珠個(gè)左右)的三角瓶?jī)?nèi),連續(xù)順一個(gè)方向充分搖動(dòng)5~10min3次,1500r/min,離心10min按血球壓積用Hank’液配制成1的紅細(xì)胞懸液。Giemsa染液:取Giemsa染料0.5g,中性甘油,甲醇。先將Giemsa55~602小時(shí),不斷搖勻,再加入甲醇搖勻,保存?zhèn)溆?。稀釋姬姆薩氏染色液:使用時(shí),用pH6.881份,即成應(yīng)用液。Giemsa2NHCl2滴即成。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)前42%。用頸椎脫臼法處死小鼠,腹腔注射加小牛血清的Hank's液4mL/20次,以充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞,然后將腹壁剪開一個(gè)小口,用膠頭吸管吸取腹腔洗液2mL于試管內(nèi)(或用注射器1mL0.5mL0.5mL1%雞血紅細(xì)胞懸液的試管內(nèi),混勻。用注射器(裝大針頭)0.5mL混合液,加入玻片的瓊脂圈內(nèi)。放置孵箱內(nèi)37℃孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后迅速用生理鹽水將未貼壁細(xì)胞沖掉,于甲醇液1分鐘,Giemsa15分鐘。用蒸餾水沖洗干凈,晾干,用40×顯微鏡計(jì)數(shù)吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率為每100雞紅細(xì)胞的個(gè)數(shù)。3.6.2.4.注意事項(xiàng)頸椎脫臼處死小鼠勿用力過(guò)大,防止腹腔內(nèi)血管和內(nèi)臟破裂出血影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。放滴片的搪瓷盤內(nèi)應(yīng)保持一定的濕度,以防液體干燥。孵育后的標(biāo)本沖洗次數(shù)的差別不宜太大,更不要直接沖在有細(xì)胞的部分。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格掌握時(shí)間。在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)要數(shù)完一個(gè)視野后再換另一個(gè)視野。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(半體內(nèi)法)原理在體內(nèi)腹腔巨噬細(xì)胞能吞噬雞紅細(xì)胞。據(jù)此判斷巨噬細(xì)胞的吞噬功能。儀器和材料顯微鏡、雞紅細(xì)胞、丙酮、甲醇、生理鹽水、Giemsa染液。實(shí)驗(yàn)步驟水洗滌23次,離心2000r/mi,10mi,去上清,用生理鹽水配成20v/)的雞紅細(xì)胞懸液。20%30min-1.5h,頸椎脫臼處死動(dòng)物,將其仰位固定于鼠板上,正中剪開腹壁皮膚,經(jīng)腹腔注入生理鹽水,轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1min。然后吸出腹腔洗液2片載玻片上,放入墊有濕沙布的搪瓷盒內(nèi),移置3730min。孵畢,于生理鹽水中漂洗,以除去未貼片細(xì)胞。晾干,以1:1再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞,每張片計(jì)數(shù)100個(gè),按下式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率(%)=

吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)×100計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)吞噬指數(shù)=

被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)在計(jì)數(shù)時(shí),應(yīng)同時(shí)觀察雞紅細(xì)胞被消化的程度。借以判定巨噬細(xì)胞吞噬與消化功能,通常分為4級(jí):I級(jí):未消化。被吞噬的雞紅細(xì)胞完整,胞質(zhì)淺紅或淺黃帶綠色,胞核淺紫色。II級(jí):輕度消化。胞質(zhì)淺黃綠色、胞核固縮呈紫藍(lán)色。級(jí):重度消化。胞質(zhì)淡染,胞核淡淺灰色??梢?。數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定p以吞噬百分率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。吞噬百分率需進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,p式中PF

,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性;F值≥F

,P≤0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組0.05 0.05求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試樣品組的吞噬百分率或吞噬指數(shù)與對(duì)照組比較,差異均有顯著性,方可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。NK細(xì)胞活性測(cè)定可任選下列方法之一乳酸脫氫酶測(cè)定法原理正常情況下,活細(xì)胞胞漿內(nèi)的含有LDH不能透過(guò)細(xì)胞膜,當(dāng)細(xì)胞受到NK細(xì)胞的殺傷后,LDH釋放到LDH可使乳酸鋰脫氫,進(jìn)而使NAD還原成NADH,后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽還原碘硝基氯化四氮唑藍(lán)ININT接受H490nm儀器和材料YAC-1Hank's液(pH7.~7.4、RPMI1640完全培養(yǎng)液、乳酸鋰或乳酸鈉、碘硝基氯化受試樣品組的NK受試樣品組的NK細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組的NK細(xì)胞活性,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。PAGE27INPMNA0.2mol/L的Tris-HClpH8.1%NP40或2.5%Triton實(shí)驗(yàn)步驟LDH乳酸鋰5×10-2mol/L碘硝基氯化四氮唑藍(lán)吩嗪二甲酯硫酸鹽2.8×10-4mol/L1.3×10-3mol/L將上述試劑溶于0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液中(pH8.2)靶細(xì)胞的傳代細(xì)胞)實(shí)驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用前以Hank's液洗3次,用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。脾細(xì)胞懸液的制備(效應(yīng)細(xì)胞)無(wú)菌取脾,置于盛有適量無(wú)菌Hank's液的小平皿中,用鑷子輕輕將脾磨碎,制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾,或用4層紗布將脾磨碎,或用Hank's液洗2次,每次離心10mi(1000r/mi。棄上清將細(xì)胞0.5mL200.5mL2Hank’s8mLHank’s液,1000r/min,10min離心;或采用N4Cl-Tris紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,離心10mi1000r/mi,棄紅色上清。用1mL含10小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸,用1冰醋酸稀釋后計(jì)數(shù)(活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95以上蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95以上,最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為×17個(gè)/m。NK細(xì)胞活性檢測(cè)取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100μ(效靶比50:,加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中;靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和1%NP402.5%Triton375%CO2961500r/min100μL置平底96孔培養(yǎng)板中,同時(shí)加入LDH100μL3~10min1mol/LHCl30μL,在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定光密度值O。NK細(xì)胞活性,受試樣品組的NK細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組的NK實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。NK細(xì)胞活(%)=反應(yīng)孔自然釋放孔OD 最大釋放孔OD-自然釋放孔OD數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定NK細(xì)胞活性需進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,X=Sin-1

pPNK細(xì)胞活性,用小數(shù)表示,然后再進(jìn)行方差pF值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無(wú)值≥F0.05,P≤0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì);對(duì)非正態(tài)或方仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試樣品組的NK細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組的受試樣品組的NK細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組的NK細(xì)胞活性,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。PAGE28注意事項(xiàng)靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞必須新鮮,細(xì)胞存活率應(yīng)大于95%。反應(yīng)時(shí)環(huán)境溫度應(yīng)保持恒定。LDH基質(zhì)液應(yīng)臨用前配制。在一定范圍內(nèi),NK細(xì)胞活性與效靶比值成正比。一般效靶比值不應(yīng)超過(guò)100。3H-TdR測(cè)定法1.3.7.2.1原理將用同位素3H-TdR標(biāo)記的靶細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí),靶細(xì)胞可被NKNK3H-TdR的釋放率即可反應(yīng)NK細(xì)胞的活性。3.7.2.2儀器和材料3H-TdRRPMI1640Hank's液7.4AC-1TritonX-100實(shí)驗(yàn)步驟靶細(xì)胞的標(biāo)記24h生長(zhǎng)良好的YAC-1細(xì)胞(>95%)1×106/mLYAC-13H-TdR10uCi進(jìn)375%CO22h30min131×105個(gè)。脾細(xì)胞懸液的制備(效應(yīng)細(xì)胞)無(wú)菌取脾,置于盛有適量無(wú)菌Hank's200目篩網(wǎng)過(guò)濾,用Hank's液洗3次,每次離心10mi(1000r/mi。然后將細(xì)胞懸浮于2mL臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95以上,最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1107個(gè)/m。NK細(xì)胞活性測(cè)定96100μL100μL100μL100μL2.5%Triton。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔,置5%CO2374h,用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集在玻璃纖維濾紙上,用液體閃爍儀進(jìn)行測(cè)量。按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性:實(shí)驗(yàn)孔cpmNK細(xì)胞活性(%)=(1-──────────────────)×100%空白對(duì)照孔cpm-最大釋放孔cpm3.7.2.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定NKXSi-1pP為NKFF值≥F0.05,P≤0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì);對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。PAGEPAGE57有助于增強(qiáng)免疫力功能結(jié)果判定有助于增強(qiáng)免疫力功能判定:在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核—巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性四個(gè)方面任兩個(gè)方面結(jié)果陽(yáng)性,可判定該受試樣品具有有助于增強(qiáng)免疫力功能作用。其中細(xì)胞免疫功能測(cè)定項(xiàng)目中的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性,或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽(yáng)性,可判定細(xì)胞免疫功能測(cè)定結(jié)果陽(yáng)性。體液免疫功能測(cè)定項(xiàng)目中的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性,或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量—NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的一個(gè)以上劑量組結(jié)果陽(yáng)性,可判定NK細(xì)胞活性結(jié)果陽(yáng)性。二、有助于抗氧化功能檢驗(yàn)方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用10月齡以上老齡大鼠或8月齡以上老齡小鼠,也可用氧化損傷模型鼠。單一性別,小鼠每組10-15只,大鼠8-12只。劑量分組及受試樣品給予時(shí)間10倍(小鼠)或5倍(大鼠)為其中的一個(gè)劑量組,另設(shè)兩個(gè)劑量組,高劑量一般不超過(guò)3030天,必要時(shí)可延長(zhǎng)至45天。實(shí)驗(yàn)方法老齡動(dòng)物108MDA13個(gè)受試3產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。D-半乳糖氧化損傷模型原理D-氧化效應(yīng)。造模方法25-30gD-40mg-1.2g/kgBW頸背部皮下注射或腹腔注射造模,注射量為0.1mL/10g16周,取血測(cè),按MDA水平分組。隨機(jī)分13個(gè)劑量組經(jīng)口給予不同濃度受試樣品,模型對(duì)照組給予同體積D-驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物測(cè)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。乙醇氧化損傷模型原理乙醇大量攝入,激活氧分子產(chǎn)生自由基,導(dǎo)致組織細(xì)胞過(guò)氧化效應(yīng)及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭。造模方法25-30g(180-220g大鼠43必要時(shí)可增設(shè)13個(gè)劑量組給予不同濃度受試樣品,模型對(duì)照組給予同體積溶劑,連續(xù)灌胃30316(過(guò)夜150%12mL/kgB,6小時(shí)后取材(空白對(duì)照組不作處理,不禁食取材含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。脂質(zhì)氧化產(chǎn)物測(cè)定血中過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛含量測(cè)定血中過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量可采用熒光法和比色法測(cè)定,方法任選其一。熒光法熒光法原理1個(gè)丙二醛2個(gè)硫代巴比妥酸分子在酸性條件下共熱,形成粉紅色復(fù)合物。以波長(zhǎng)536nm為激發(fā)光,在550nm有最強(qiáng)熒光強(qiáng)度??捎脽晒夥ㄟM(jìn)行微量測(cè)定。儀器與試劑儀器:熒光分光光度計(jì)、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機(jī)、混旋器、具塞離心管試劑:10mmol/L四乙氧基丙烷(貯備液,棕色瓶4℃保存12個(gè)月,臨用前用純水稀釋成1nmol/mL29mmol/L硫代巴比妥酸工作液硫代巴比妥酸EDTA2H2O谷胱甘肽(還原型)

0.209g25mg1mg用0.02mol/L NaOH 50mL溶解(微溫助溶,棕色瓶4℃保存2周)酸水解液0.1mol/LH2SO4mol/L

125mL125mL加水150mL用H2SO4調(diào)pH1.5,加水稀釋至500mL正丁醇50%24h后,再經(jīng)蒸餾水、雙蒸水淋洗干燥,試劑(選AR級(jí))用雙蒸水配制。實(shí)驗(yàn)步驟樣品制備全血上清液:取血50μL加入0.5mL生理鹽水,2000r/min離心10min,取上清液待測(cè)。血清樣品:取血0.5mL室溫靜置10min,2000r/min離心10min,取上清液待測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作10nmol/mL0.00.250.51.0、1.5、2、5、10nmol/mL分別取0.1mL2mLTBA0.5mL→混勻,避光、沸水浴60min正丁醇振蕩抽提1min→3000r/min離心5min→取上清液(正丁醇層)測(cè)熒光強(qiáng)度(1.5nm,出射狹縫激發(fā)波長(zhǎng)536nm,發(fā)射波長(zhǎng)550nm)以四乙氧基丙烷濃度為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖。樣品測(cè)定試劑空白管樣本管標(biāo)準(zhǔn)管10mL具塞離心管0.1mL蒸餾水0.1mL血清*0.1mL標(biāo)準(zhǔn)#酸水解液2mL2mL2mLTBA工作液0.5mL0.5mL0.5mL混勻,避光沸水浴60min,流水冷卻正丁醇

3mL

3mL

3mL1min,3000r/min5min*全血上清液0.5mL(空白管加蒸餾水0.5mL,標(biāo)準(zhǔn)管加標(biāo)準(zhǔn)0.1mL、蒸餾水0.4mL)#1nmol/mL四乙氧基丙烷(標(biāo)準(zhǔn))血清0.1mL(或全血上清液0.5mL)→加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL→混勻,避光、沸水浴60min→流水冷卻至室溫→3mL正丁醇振蕩抽提1min→3000r/min離心5min→取上清液(正丁醇層)測(cè)熒光強(qiáng)度(入射狹縫1.5nm,出射狹縫5nm,激發(fā)波長(zhǎng)536nm,發(fā)射波長(zhǎng)550nm)計(jì)算公式:B-A B-A過(guò)氧化脂質(zhì)含量(nmol/mL血清)=———×C×K=————×1×1F-A F-AB-A B-A 1過(guò)氧化脂質(zhì)含量(nmol/mL血液)=———×C×K=———×1×————F-A F-A 0.05A:空白管熒光度B:樣品熒光度C:四乙氧基丙烷濃度(1nmol/mL)K:稀釋倍數(shù)比色法1.3.4.1.2.11個(gè)丙二醛2個(gè)硫代巴比妥酸分子在酸性條件下共熱,形成粉紅色復(fù)合物。該物質(zhì)532nm有極大吸收峰??捎梅止夤夥ㄟM(jìn)行測(cè)定。儀器與試劑試劑:0.2MpH3.5M乙酸溶液 185mL0.2M乙酸鈉溶液15mL1mmol/L四乙氧基丙烷(℃保存3個(gè)月,臨用前用水稀釋成40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸鈉SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA0.2M磷酸鹽緩沖液pH7.40.2M磷酸氫二鈉 1920mL0.2M磷酸二氫鉀 480mL實(shí)驗(yàn)步驟樣品制備20μL0.98mL1.3.4.1.2.3.2樣品測(cè)定試劑空白管樣品管標(biāo)準(zhǔn)管2%溶血液*0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸鹽緩沖液1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.6mL0.6mL混勻,避光沸水浴60min,流水冷卻,于532nm比色注:如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。*若用血清,樣品管0.15mL,標(biāo)準(zhǔn)管0.15mL。1.3.4.1.2.3.3計(jì)算B–A B–A過(guò)氧化脂質(zhì)含量(nmol/mL2%溶血液)=————×C×K=—————×40×1F–A F–AB–A B–A過(guò)氧化脂質(zhì)含量(nmol/mL血清)=————×C×K=—————×40×1F–A F–AA:空白管吸光度B:樣品吸光度F:四乙氧基丙烷吸光度C:四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL)K:稀釋倍數(shù)組織中過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛含量測(cè)定原理見1.3.4.1.2.1儀器與試劑織勻漿器試劑:見1.3.4.1.2.2實(shí)驗(yàn)步驟樣品制備組織勻漿樣品:取一定量的所需臟器,生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎,置勻漿器中,加入0.2M酸鹽緩沖液,以20000r/min勻漿10,間歇30,反復(fù)進(jìn)行3次,制成10組織勻漿W/3000r/min5-10min,取上清液待測(cè)。樣品測(cè)定試劑空白管樣品管標(biāo)準(zhǔn)管10%組織勻漿0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸鹽緩沖液1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.7mL0.7mL混勻,避光沸水浴60min,流水冷卻,于532nm比色注:如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進(jìn)行計(jì)算B-A B-A 1過(guò)氧化脂質(zhì)含量=————×C×K=———×40×—————————(nmol/mg組織) F-A F-A 0.2×10%×1000A:空白管吸光度B:樣品管吸光度C:四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL)K:稀釋倍數(shù)異前列腺素(8-Isoprostane)測(cè)定原理8-表氫氧-異前列腺素(8-Isoprostane)間接反應(yīng)因機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生而導(dǎo)致組織細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度。儀器與試劑儀器:酶標(biāo)儀、生化培養(yǎng)箱、微量振蕩器、微量加樣器、洗板機(jī)試劑:8-IsoprostaneKIAKit(酶聯(lián)免疫試劑盒)8-IsoprostaneEIA抗體血清、8-IsoprostaneAChE示蹤物、8-IsoprostaneEIA標(biāo)準(zhǔn)品、EIA緩沖液、洗滌緩沖液、吐溫20、鼠抗-兔IgG抗體、EIA示蹤染色劑、EIA抗體血清染色劑、Ellman’s試劑實(shí)驗(yàn)步驟1.3.4.3.3.1小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血,3000r/min10min。取上清液,用EIA151.3.4.3.3.2樣品測(cè)定按試劑盒說(shuō)明操作。培養(yǎng)清洗418清洗所有反應(yīng)孔五次培養(yǎng)讀數(shù)用封板膜蓋好酶標(biāo)板,并在常溫避光條件下培養(yǎng)45-90分鐘412nm處測(cè)量各孔吸光度0.3-1.0A.U培養(yǎng)清洗418清洗所有反應(yīng)孔五次培養(yǎng)讀數(shù)用封板膜蓋好酶標(biāo)板,并在常溫避光條件下培養(yǎng)45-90分鐘412nm處測(cè)量各孔吸光度0.3-1.0A.U范圍)步驟試劑空白TANSBB0標(biāo)準(zhǔn)/樣品1.加試劑EIA緩沖液--100μL50μL-標(biāo)準(zhǔn)/樣品50μLAChE示蹤物--50μL50μL50μL抗體血清50μL50μL4.加試劑AChE示蹤物-5μLEllman’s200μL200μL200μL200μL200μL標(biāo)準(zhǔn)或樣品孔吸光度—NSB孔吸光度%B/B0= ——————————————————×100B0孔吸光度—NSB孔吸光度以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,亦可將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成logit(B/B0)或ln[B/B0/(1-B/B0)]%B/B0的濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品中的表氫氧異前列腺素濃度。蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物測(cè)定H2O2或O2·ˉ自由基對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的氧化可導(dǎo)致羰基產(chǎn)物的積累使肽鏈斷裂,引起蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞,在斷裂處產(chǎn)生羰基。羰基化蛋白極易相互交聯(lián)、聚集為大分子從而降低或失去原有蛋白質(zhì)的功能,蛋白質(zhì)羰基含量可直接反映蛋白質(zhì)損傷的程度。蛋白質(zhì)羰基形成是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過(guò)程中的早期標(biāo)志,它隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。血清中蛋白質(zhì)羰基測(cè)定原理被氧化后的蛋白質(zhì)羰基含量增多,羰基可與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2,4-二硝基苯腙,2,4-二硝基苯腙為370nm羰基含量。儀器與試劑儀器:紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微量加樣器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、低溫高速離心機(jī)、混旋器、2mL離心管。試劑:10mmol/L 2,4-二硝基苯(DNPH)99mg50ml2mol/LHCL溶解,4℃避光保存。2mol/LHCL200g/L三氯乙酸(TCA)6mol/L鹽酸胍無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液將無(wú)水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1:1的比例配置成混合溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。操作步驟試劑試劑血清(血漿)10mmol/L 2,4-二硝基苯肼測(cè)定管0.1mL0.4mL對(duì)照管0.1mL2mol/LHCL 0.4mL渦旋混勻1分鐘,37℃準(zhǔn)確避光反應(yīng)30分鐘200g/L三氯乙酸 0.5mL 0.5mL渦旋混分鐘,4℃下,12000r/min離心10min,棄上清,留沉淀無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液 1.0mL 渦旋混分鐘,4℃下,12000r/min離心10min,棄上清,留沉淀無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液 1.0mL 渦旋混分鐘,4℃下,12000r/min離心10min,棄上清,留沉淀無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液 1.0mL 渦旋混分鐘,4℃下,12000r/min離心10min,棄上清,留沉淀無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液 1.0mL 渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉淀6mol/L鹽酸胍1.25mL混勻后,37℃準(zhǔn)確水浴15分鐘1.25mL12000r/min離心15min370nmmol/LOD值。用雙縮脲法測(cè)定血清(或血漿)蛋白質(zhì)含量。注:如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。計(jì)算公式測(cè)定管OD-對(duì)照管OD蛋白質(zhì)羰基含量=——————————————————————×125×105(nmol/mgprot) 22×比色光徑樣本蛋白濃度組織中蛋白質(zhì)羰基測(cè)定原理見1.3.5.1.1儀器與試劑2mL離心管。試劑:10mmol/LHEPES緩沖液pH7.42.38gN-22HEPE1000mlNNaOH調(diào)p至7.4℃保存。100g/L硫酸鏈霉素1g硫酸鏈霉素,溶入10mL雙蒸餾水,4℃避光保存。10mmol/L 2,4-(DNPH)99mg50mL2mol/LHCL溶解,4℃避光保存。2mol/LHCL200g/L三氯乙酸(TCA)6mol/L鹽酸胍無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液將無(wú)水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1:1的比例配置成混合溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理0.1g組織,在冰的生理鹽水中漂洗,以去掉表面的血跡。加入0.9mL10mmol/LHEPES液pH7.,制成10的勻漿。將勻漿液以3000r/min的轉(zhuǎn)速,離心10mi,保留上清。取100g/L的硫酸鏈霉素溶液50μ,加入上清液450μv/v,1:,室溫放置10min后,以11000r/min的轉(zhuǎn)速,離心10mi,取上清液待測(cè)。操作步驟試劑試劑組織勻漿上清液測(cè)定管對(duì)照管2,4-二硝基苯肼0.1mL0.4mL0.1mL10mmol/L2mol/LHCL0.4mL渦旋混勻1分鐘,37℃準(zhǔn)確避光反應(yīng)30分鐘200g/L三氯乙酸 0.5mL 0.5mL渦旋混分鐘,4℃下,12000r/min離心10min,棄上清,留沉無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液 1.0mL 1.0mL渦旋混分鐘,4℃下,12000r/min離心10min,棄上清,留沉無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液 1.0mL 1.0mL渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉淀無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液 1.0mL 1.0mL渦旋混勻渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉淀無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液 1.0mL 1.0mL渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉淀6mol/L鹽酸胍1.25mL混勻后,37℃準(zhǔn)確水浴15分鐘1.25mL12000r/min離心15min370nmmol/LOD值。用雙縮脲法測(cè)定勻漿上清液蛋白質(zhì)含量。注:如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。計(jì)算公式測(cè)定管OD-對(duì)照管OD蛋白質(zhì)羰基含量=——————————————————————×125×105(nmol/mgprot) 22×比色光徑樣本蛋白濃度注意事項(xiàng)DNPH結(jié)合,并反應(yīng)生成的溶解:DNPH2mol/LDNPHHC1與反應(yīng)液中一些物質(zhì)反應(yīng)生成對(duì)比色有影響的物質(zhì)。DNPHDNPH分解,體系中會(huì)有剩余的沒(méi)有變成蛋白質(zhì)腙衍生物,對(duì)反應(yīng)比色有影響。DNPH在370nmDNPH,否則,會(huì)增加吸光值??寡趸富盍y(cè)定SOD催化超氧陰離子自由基(O2·ˉ)生成H2O2,再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和過(guò)氧化氫酶作用生成水,這樣可以清除O2·ˉ對(duì)細(xì)胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在動(dòng)物某些器官和人體血紅細(xì)胞中的含量均有明顯的增齡變化,酶活性與生物年齡的增長(zhǎng)成反比。消除自由基的能力與酶活性成正比。血或組織中超氧化物歧化酶活力測(cè)定原理O2·ˉ氧化羥胺的最終產(chǎn)物為亞硝酸鹽,后者在對(duì)氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現(xiàn)紫紅色,在波長(zhǎng)530nm處有極大吸收峰,可用分光光度法進(jìn)行測(cè)定,當(dāng)SOD消除O2·ˉ后形成的亞硝酸鹽減少。儀器與試劑儀器可見光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、離心機(jī)、恒溫水浴、勻漿器試劑65mM磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7.810mmol/L鹽酸羥胺鹽酸羥胺6.95mg,加PBS至10mL7.5mmol/L黃嘌呤黃嘌呤11.41mg,加0.1MNaOH2.5mL溶解,加PBS至10mL0.2g/L黃嘌呤氧化酶取10g/L黃嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS9.8mL至10mL0.1%甲萘胺0.2g40mL50mL110mL0.33%對(duì)氨基苯磺酸0.66g150mL50mLSOD標(biāo)準(zhǔn)品三氯甲烷95%乙醇(v/v)0.9%生理鹽水實(shí)驗(yàn)步驟全血沖入0.5mL生理鹽水,2000r/min離心3min0.2mL95%0.1mL30s0.1mL1min,4000r/min離3min,分層,上層為SOD抽提液,中層為血紅蛋白沉淀物,下層為三氯甲烷,記錄上清液體積待測(cè)。組織勻漿的制備:剪取一定量的所需臟器,生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎,至玻璃勻漿器中加入冷生理鹽水20000r/min勻漿10s301組織勻漿(最好用超聲波發(fā)生器處理使線粒體振破,以中性紅-詹鈉氏綠B4000r/min5min20μL待測(cè)。SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線將SOD750U/mL50量為15U/m(1.5μg/mSODSOD活力單位U/mL為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)照管OD-測(cè)定管ODSOD百分抑制率=─────────────────×100%對(duì)照管OD計(jì)算每mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)單位。(對(duì)照管OD-測(cè)定管OD)×100%對(duì)照管OD 反應(yīng)液總量SOD活力(U/mL)=────────────────── ×────────────×樣品稀釋倍數(shù)50% 取液量也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從SOD標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的SODU/mL,乘以稀釋倍數(shù)(1mL/取樣量。若樣品為組織勻漿液,根據(jù)勻漿濃度或組織蛋白質(zhì)含量,將單位換算為U/g組織或U/mg蛋白。若樣品為紅細(xì)胞抽提液,根據(jù)血紅蛋白含量,可換算為U/gHb。樣品測(cè)定步驟:試劑 測(cè)定管 對(duì)照管1/15mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.8(mL)1.01.0樣品A*10mmol/L鹽酸羥胺(mL)0.10.17.5mmol/L黃嘌呤(mL)0.20.20.2mg/mL黃嘌呤氧化酶(mL)0.20.2雙蒸水(mL)0.490.490.33%對(duì)氨基苯磺酸(mL)0.1%甲萘胺(mL)

混勻,372.02.0

2.02.0混勻15min后,倒入1cm光徑比色杯,以蒸餾水調(diào)零,530nm處比色測(cè)定OD值。*A所用樣品的量紅細(xì)胞抽提液血清(或血漿1%組織勻漿

10μL20-30μL(溶血樣品剔除)10-40μL注:如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。血或組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力測(cè)定原理內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化特別重要,其活力以催化GSH氧化的反應(yīng)速度,及單位時(shí)間內(nèi)GSH5,5’-二硫?qū)ο趸郊姿岱磻?yīng)在GSH-Px離子,于423nmGSH減少的量,由于GSH應(yīng)氧化,所以最后計(jì)算酶活力時(shí),必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH減少。試劑和儀器儀器:可見光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、低溫高速離心機(jī)、勻漿器、恒溫水浴鍋、微量加樣器試劑:疊氮鈉磷酸緩沖液pH7.0NaN316.25mg終濃度2.5mmol/LEDTA-Na27.44mg終濃度0.2mmol/LNa2HPO41.732g終濃度0.2mol/LNaH2PO41.076g終濃度0.2mol/L加蒸餾水至100mL,用少量HCl、NaOH調(diào)pH7.0,4℃保存。1mmol/L谷胱甘肽(還原型GSH)溶液GSH30.7mg加疊氮鈉磷酸緩沖液至100mL,臨用前配制,冰凍保存1-2日。1.25-1.5mmol/LH2O2溶液取30%H2O20.15-0.17mL,用雙蒸水稀釋至100mL,作為貯備液,4℃避光保存,臨用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍即可。偏磷酸沉淀液HPO3EDTANaCl

16.7g(先用蒸餾水溶解)0.5g280g

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