果樹遺傳育種

姓名：王俊學(xué)號：2013308812分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展生化標(biāo)記分子標(biāo)記細(xì)胞學(xué)標(biāo)記形態(tài)學(xué)標(biāo)記遺傳標(biāo)記RFLPRAPDAFLPSSRISSRSNP常見分子標(biāo)記什么是遺傳標(biāo)記（GeneticMarker）?

遺傳標(biāo)記指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段、某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它具有兩個基本特征，即可遺傳性和可識別性，因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標(biāo)記。

遺傳標(biāo)記的類型主要有四大類：

1.形態(tài)標(biāo)記(morphologicalmarker

)2.細(xì)胞學(xué)標(biāo)記(

cytologicalmarker

)

3.生化標(biāo)記

(

biochemicalmarker

)

4.分子標(biāo)記

(

molecularmarker

)

主要包括肉眼可見的能明顯顯示遺傳多態(tài)性的外部形態(tài)特征，如：矮稈、紫鞘、卷葉等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病蟲性等有關(guān)的一些特性。

優(yōu)點(diǎn):形態(tài)學(xué)標(biāo)記簡單直觀、易于觀察。

缺點(diǎn):(1)形態(tài)標(biāo)記的數(shù)量在多數(shù)植物中是很有限的;(2)遺傳表達(dá)不穩(wěn)定，表現(xiàn)易受環(huán)境影響;(3)有一些標(biāo)記與不良性狀連鎖;(4)形態(tài)標(biāo)記的獲得需要通過誘變、分離純合的過程，周期較長。形態(tài)學(xué)標(biāo)記形態(tài)標(biāo)記（Morphologicalmarker）形態(tài)學(xué)上如何區(qū)分

能夠明確顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征。染色體的結(jié)構(gòu)特征，形態(tài)特征及數(shù)量特征是常見的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，它們反映里染色體結(jié)構(gòu)上，形態(tài)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。其中染色體的結(jié)構(gòu)特征包括染色體的核型和帶型。

優(yōu)點(diǎn):

能進(jìn)行一些重要基因的染色體或染色體區(qū)域定位。

缺點(diǎn):(1)材料需要花費(fèi)較大的人力和較長時間來培育，難度很大。

(2)有些變異難以用細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行檢測。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記人類22對常染色體細(xì)胞分裂中期（Metaphase）染色體組karyotype(Chromosomephenotype)

analysis細(xì)胞學(xué)標(biāo)記概念：主要包括貯藏蛋白、同工酶等標(biāo)記，也指以基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物為主的一類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。種類：可分為酶蛋白質(zhì)和非酶蛋白質(zhì)兩類。在非酶蛋白質(zhì)中用得最多的是種子貯藏蛋白（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白）。同工酶（isoenzyes)：催化功能相同，但結(jié)構(gòu)和生理性質(zhì)不同的一類酶。生化標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量更豐富，受環(huán)境影響更小。生化標(biāo)記的缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)受生物體發(fā)育的時空影響很大。生化標(biāo)記（BiochemicalMarker）主要內(nèi)容：

一、分子標(biāo)記的相關(guān)概念及分類

二、幾種常見分子標(biāo)記的原理及方法

三、分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記來源于DNA水平的突變突變(Mutation)：是指DNA水平的可遺傳的變異，不管這種DNA變異能不能導(dǎo)致可檢測的表型或生化改變。突變產(chǎn)生的變異是自然選擇的基礎(chǔ)?？蛇z傳的突變在群體中擴(kuò)散從而產(chǎn)生多態(tài)性。多態(tài)性(Polymorphism)：－群體內(nèi)同一DNA序列的兩種或多種變異形式，統(tǒng)計(jì)表明：群體內(nèi)任何兩個生物個體平均每1000～10000個堿基對有一對有差別，這種差別就是多態(tài)性。

1.廣義的分子標(biāo)記(molecularmarker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。eg:蛋白質(zhì)標(biāo)記如種子貯藏蛋白同工酶（指由一個以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）

2.狹義的分子標(biāo)記（DNAmarker)概念只是指DNA標(biāo)記

能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。一.分子標(biāo)記相關(guān)概念

分子標(biāo)記的概念：是以直接檢測DNA核苷酸序列的差異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，又叫DNA分子標(biāo)記。分子標(biāo)記（DNAmarker）

分子標(biāo)記的特點(diǎn)：

(相對形態(tài)，細(xì)胞，生化標(biāo)記具有的優(yōu)點(diǎn))

（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題；

（2）數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；

（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；

（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；

（5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。

在遺傳學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的DNA分子標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展了很多種，一般依其所用的分子生物學(xué)技術(shù)大致可以分為三大類：第一類：是以分子雜交為核心的分子標(biāo)記，包括RFLP、DNA指紋技術(shù)等，這類分子標(biāo)記被稱為第一代分子標(biāo)記；第二類：是以PCR為核心的分子標(biāo)記，包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性RAPD、簡單序列重復(fù)SSR、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性AFLP、序列標(biāo)簽位點(diǎn)STS等，為第二代分子標(biāo)記；第三類：是一些新型的分子標(biāo)記，如：SNP標(biāo)記、表達(dá)序列標(biāo)簽EST標(biāo)記等，也以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，為第三代分子標(biāo)記。分子標(biāo)記的分類英文縮寫英文名稱中文名稱RFLPRestrictionfragmentIength

polymorphism限制性片段長度多態(tài)性STSSequencetaggedsite序列標(biāo)簽位點(diǎn)RAPDRandomamplifiedpolymor-phicDNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNAAFLPAmplifiedfrangmentlengthPolymorphism擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性SSRSimplesequencerepeat簡單序列重復(fù)SNPSimplemucleotide

polymor-phism單核苷酸多態(tài)性幾種主要的ＤＮＡ分子標(biāo)記1.RFLP2.RAPD3.AFLP

4.SSR5.ISSR6.SNP二、幾種常見分子標(biāo)記的原理及方法RFLP-限制性長度多態(tài)性利用限制性內(nèi)切酶切割不同個體基因組DNA后，含同源序列的酶切片段在長度性的差異RFLP不同個體DNA的提取酶切凝膠電泳分開DNA片段轉(zhuǎn)膜Southern雜交數(shù)據(jù)分析PCR擴(kuò)增目的片段原理優(yōu)點(diǎn)：1可靠性高2來源自然變異3多樣性4共顯性5數(shù)量性缺點(diǎn)：1費(fèi)時2具有種屬特異性3多態(tài)信息含量低RAPD隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性建立在ＰＣＲ技術(shù)上，使用一系列１０個堿基左右的單鏈隨機(jī)引物，對基因組的ＤＮＡ全部進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，以檢測多態(tài)性。正?；驂A基發(fā)生改變后技術(shù)原理福建古荔枝樹RAPD部分引物分析

AFLP—擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記

(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)

起源：1992年由荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的新方法。

定義:由于單核甘酸突變或插入及缺失突變導(dǎo)致增加或減少限制性酶切位點(diǎn)，這種差異可通過選擇性的PCR擴(kuò)增而檢測。AFLP是在RFLP的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，差別在于檢測手段。核心技術(shù)：AFLP的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)選擇性擴(kuò)增引物以及不同引物組合。

AFLP的原理

PrincipleofAFLP基本原理：對基因組DNA用兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，連上相應(yīng)的雙鏈人工接頭，根據(jù)接頭的核苷酸序列和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，并在3’端添加1-2個隨機(jī)堿基對酶切連接后的DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。此后再進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，所用的引物是在第一次PCR中使用的選擇性引物的3’端又附加了1-3個隨機(jī)堿基。擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠檢測，銀染顯色。多態(tài)性源自限制性酶切位點(diǎn)的變異。AFLP的實(shí)驗(yàn)操作

ProceduresforAFLPAFLP技術(shù)主要包括模板DNA制備、引物設(shè)計(jì)、酶切片段擴(kuò)增及凝膠電泳分析4個步驟。各步驟具體的過程有：

1.DNA模板酶切和接頭連接（EcoRI/MseI）

2.在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴(kuò)增。

3.PCR產(chǎn)物變性后在含尿素的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。

4.多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析?；静襟EAFLPDNA提取兩種限制性內(nèi)切酶酶切DNA寡聚核苷酸接頭的連接對限制性酶切片段的選擇性擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析AFLP技術(shù)路線1.基因組DNA被酶切成小片段：通常用一個四個堿基識別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶如MseI和一個六個堿基識別位點(diǎn)的酶如EcoRI，其中MseI確保產(chǎn)生合適大小的DNA片段，這些片段能在序列膠上進(jìn)行有效的分離；而六堿基識別位點(diǎn)酶EcoRI能夠限制擴(kuò)增片段數(shù)目，確保DNA多態(tài)性的正常檢測；2.接頭與酶切片段的連接：接頭序列包括：一個核心序列和酶切位點(diǎn)特異序列，MSE接頭和ECORI接頭，核心序列是一段已知的20核甘酸的DNA序列；3.預(yù)擴(kuò)增：應(yīng)用一對引物對酶切片段進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，目的是富聚目標(biāo)片段，減少本底，擴(kuò)增引物序列為接頭序列加一個選擇核甘酸。只有一端為EcoRI切點(diǎn)，一端為MseI切點(diǎn)的DNA酶切片段，同時也與選擇核甘酸配對的DNA序列才能被擴(kuò)增。1～3步的產(chǎn)物可以通過Agarose膠檢測。4.選擇擴(kuò)增：應(yīng)用含有接頭序列和三個選擇核甘酸序列的引物進(jìn)行選擇擴(kuò)增。通過這一輪擴(kuò)增，進(jìn)一步降低擴(kuò)增片段數(shù)量，同時一個引物被同位素或熒光染料標(biāo)記（也可用銀染），電泳后壓片檢測。

AFLP的原理

PrincipleofAFLPDNA提取兩種限制性內(nèi)切酶酶切DNA寡聚核苷酸接頭的連接對限制性酶切片段的選擇性擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析

AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1、具有分辨率高2、穩(wěn)定性好3、效率高的優(yōu)點(diǎn)AFLP特點(diǎn)1、試驗(yàn)成本高2、對DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：兩對引物對39個荔枝品種進(jìn)行AFLP品分析SimpleSequenceRepeat基本原理：微衛(wèi)星DNA是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀簡單重復(fù)序列，每個重復(fù)單元的長度在1—10bp之間，常見的微衛(wèi)星如TGTG……TG=(TG)n或AATAAT……AAT=(AAT)n等，不同數(shù)目的核心序列呈串聯(lián)重復(fù)排列，而呈現(xiàn)出長度多態(tài)性。在基因組中，因每個SSR序列的基本單元重復(fù)次數(shù)在不同基因型間差異很大，從而形成其座位的多態(tài)性。而且每個SSR座位兩側(cè)一般是相對保守的單拷貝序列，據(jù)此可設(shè)計(jì)引物，其關(guān)鍵是首先要了解SSR座位的側(cè)翼序列(FlankingRegion)，尋找其中的特異保守區(qū)。

SSR分子基礎(chǔ)SSR基本步驟SSRDNA酶切收集酶切片段連接載體合成末端標(biāo)記的SSR探針篩選含SSR的陽性克隆用于測序根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增SSR優(yōu)點(diǎn):

數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠所需DNA量少，對DNA質(zhì)量要求不高缺點(diǎn)：由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，對于許多物種需構(gòu)建文庫，因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。SSRInterSimpleSequenceRepeatbyZietkiewiczetal.(1994)基本原理：在SSR的5’或3’端加錨l～4個嘌呤或嘧啶堿基，然后以此為引物，對兩側(cè)具有反向排列SSR的一段基因組DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。在SSR的3’端或5’端錨定1-4個簡并堿基的優(yōu)點(diǎn)是在基因組上只有那些與錨定的核苷酸匹配的位點(diǎn)才能被靶定，因而避免了SSR在基因組上的滑動大大提高了PCR擴(kuò)增的專一性。ISSR分子基礎(chǔ)ISSR銀杏5個群體66個個體進(jìn)行擴(kuò)增的13種有效ISSR引物的特點(diǎn)

ISSR圖引物UBC845擴(kuò)增ＴＭ群體15棵植株基因組DNA的ISSR電泳圖

ISSRSNPSNP主要是指在基因組水平上由于單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。也即SNP是同一物種不同個體間染色體