四培養(yǎng)基配制與無菌技術(shù)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆瘴⑸锍Ｒ?guī)培養(yǎng)基的制備方法學(xué)習(xí)無菌技術(shù)

學(xué)習(xí)玻璃器皿的包扎實(shí)驗(yàn)四微生物培養(yǎng)基的配制與無菌技術(shù)

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、6種培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（細(xì)菌）高氏一號(hào)培養(yǎng)基（放線菌）馬丁氏培養(yǎng)基（真菌）淀粉培養(yǎng)基（淀粉水解試驗(yàn)）蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗(yàn)）葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（V.P試驗(yàn)）2、移液管、培養(yǎng)皿、三角瓶、試管等的包扎3、滅菌實(shí)驗(yàn)四微生物培養(yǎng)基的配制

無菌水的準(zhǔn)備三、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基medium:用人工的辦法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長代謝的需要配制成的營養(yǎng)基質(zhì)。水、C源、N源、礦物質(zhì)、生長因素/因子、微量元素培養(yǎng)基種類：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)四微生物培養(yǎng)基的配制

四、實(shí)驗(yàn)步驟配制培養(yǎng)基的流程：原料稱量、溶解調(diào)節(jié)pH值(加瓊脂熔化)(過濾)定容分裝塞棉塞/扎口滅菌

培養(yǎng)基分裝裝置

斜面擺放法

棉塞的做法a)棉塞的制作過程(b)正誤棉塞培養(yǎng)皿的包扎五、無菌技術(shù)在(利用微生物)進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)過程中，采用物理和化學(xué)的方法技術(shù)，保證培養(yǎng)物不受環(huán)境微生物的污染，同時(shí)也不允許操作的微生物擴(kuò)散到環(huán)境中去。如高溫滅菌、過濾、紫外線照射處理等。五、無菌技術(shù)滅菌與消毒滅菌Sterilization：用物理或化學(xué)的方法來殺死或除去材料上或環(huán)境中的所有微生物的處理。消毒Disinfection：用物理或化學(xué)的方法殺死物體上絕大部分微生物（主要是病原微生物和有害微生物）的處理。消毒實(shí)際上是部分滅菌。防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物質(zhì)上的生長化療(Chemotherapy)：殺死或抑制宿主體內(nèi)的病原微生物抑制(Inhibition)：生長停止，但不死亡死亡(Death)：生長能力不可逆喪失常用的滅菌方法干熱滅菌熱蒸汽滅菌常壓滅菌過濾除菌射線滅菌化學(xué)藥物滅菌1、火焰滅菌微生物接種工具如接種環(huán)、接種針或其它金屬用具等可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。這種方法滅菌迅速徹底。接種過程中，試管或三角瓶口等，也可通過火焰灼燒滅菌。2、干熱滅菌用干燥熱空氣（160℃,1~2h）殺死微生物培養(yǎng)皿、漏斗、吸管、玻璃器具、解剖刀，接種、鑷子、剪刀等能耐高溫的器皿晾干后用牛皮紙包好溫度升到100℃，開箱內(nèi)鼓風(fēng)機(jī)培養(yǎng)基、橡膠塑料制品不能用此方法注意安全干熱滅菌箱鼓風(fēng)鈕溫度調(diào)節(jié)器指示燈溫度調(diào)節(jié)旋扭溫度計(jì)與排氣孔3、濕熱滅菌常壓蒸汽間歇滅菌將待滅菌的培養(yǎng)基或物品裝入常壓滅菌器內(nèi)，加熱至100℃大量產(chǎn)生氣體時(shí),維持30—60min,每天滅菌一次,連續(xù)滅菌三天.每次蒸煮間隙里,培養(yǎng)基或物品應(yīng)放在室溫(20--30℃)條件下培養(yǎng),第一次蒸煮殺死微生物的營養(yǎng)體,芽孢則在培養(yǎng)過程中萌發(fā)成營養(yǎng)體;第二次蒸煮即可殺死.經(jīng)過二次培養(yǎng),三次反復(fù)蒸煮,即可達(dá)到完全滅菌。常壓蒸汽持續(xù)滅菌高壓蒸汽滅菌3、濕熱滅菌常壓蒸汽間歇滅菌常壓蒸汽持續(xù)滅菌常壓蒸汽持續(xù)滅菌中,從蒸汽大量產(chǎn)生開始,繼續(xù)加大火力保持充足蒸汽,持續(xù)加熱3—6h,殺死絕大部分芽孢和全部營養(yǎng)體,達(dá)到滅菌目的。高壓蒸汽滅菌3、濕熱滅菌高壓蒸汽滅菌原理：水的沸點(diǎn)隨壓力的增加而提高。水在密閉的加壓蒸汽滅菌器中煮沸，產(chǎn)生蒸汽驅(qū)除鍋內(nèi)冷空氣后，使蒸汽不能逸出，因而增加了鍋中的蒸汽壓力。蒸汽壓力提高，水的沸點(diǎn)隨著上升，因而能夠獲得比100℃更高的蒸汽溫度，用來進(jìn)行有效的滅菌。同一溫度下，濕熱滅菌法比干熱滅菌法效果好蒸汽穿透力強(qiáng)蛋白質(zhì)含水量高，易于凝固手提式滅菌鍋安全閥壓力表放氣閥軟管緊固螺栓滅菌桶篩架水臥式滅菌鍋

是指含菌液體或氣體通過細(xì)菌濾器，使雜菌留在濾器或?yàn)V板上，從而除去雜菌。常用于許多不宜用濕熱滅菌的液體物質(zhì)，如抗生素、血清、糖類溶液等。用于除菌的細(xì)菌過濾器，是由孔徑極小，能阻止擋的陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃粉等制成.為了加快過濾,一般多采用抽氣減壓的方法,進(jìn)行操作。4、過濾除菌過濾除菌

輻射滅菌(RadiationSterilization)是利用電磁輻射產(chǎn)生的電磁波殺死大多數(shù)物質(zhì)上的微生物的一種有效方法。用于滅菌的電磁波有微波，紫外線(UV)、X-射線和γ-射線等。5、射線滅菌酚類——損傷微生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、酶鈍化、蛋白質(zhì)變性

醇類——溶解膜中的類脂，破壞膜結(jié)構(gòu)，使蛋白變性（純的或高濃度酒精使菌體表面蛋白凝固，使乙醇不易滲進(jìn)細(xì)胞）

醛類——與蛋白質(zhì)中氨基酸的多種基團(tuán)共價(jià)結(jié)合而使其變性酸類——抑制微生物酶和代謝活性

表面活性劑——改變細(xì)胞的穩(wěn)定性和透性，細(xì)胞物質(zhì)逸出鹵化物——與細(xì)胞中的酶和蛋白質(zhì)中的酪氨酸結(jié)合，Cl2和漂白粉產(chǎn)生次氯酸和新生態(tài)氧（強(qiáng)氧化劑），破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)6、化學(xué)藥劑消毒或滅菌作用機(jī)理：重金屬——與酶或蛋白質(zhì)上的—SH結(jié)合

氧化劑——使細(xì)胞成份氧化

染色劑——堿性染料的陽離子基團(tuán)與蛋白質(zhì)氨基酸上的羧基或核酸上的磷酸基結(jié)合，阻礙正常代謝

抗生素——多種機(jī)理：作用于細(xì)胞壁、膜、蛋白質(zhì)、核酸等大分子合成抗代謝物——競爭抑制，如磺胺類藥物于對氨基苯甲酸類似，阻止葉酸的合成6、化學(xué)藥劑消毒或滅菌作用機(jī)理：墻壁光滑，地面平坦，避免積累灰塵，便于清洗消毒；不裝風(fēng)扇，通風(fēng)換氣通過空氣調(diào)節(jié)裝置使用前，用2%新潔爾敏擦洗再用75%酒精（或5%石炭酸）噴霧，使灰塵落下最后用紫外燈照射約20min定期熏蒸：一年二~四次（細(xì)菌、真菌培養(yǎng)基檢驗(yàn)）

用40%甲醛（6~10ml/m3)或加半量高錳酸鉀熏蒸，盛于鐵制容器，電爐或酒精燈加熱（應(yīng)能隨時(shí)終止熱源），熏蒸后密閉12h以上，使用前1~2h用氨水中和。其他熏蒸劑；乳酸（對細(xì)菌）、硫磺無菌室消毒升汞（0.1%

HgCl2）漂白粉10g/150mlNaClO（2-10%）酒精75%苯酚（1%）福爾馬林（5%）過氧化氫（3%）氰化汞（0.1%）高錳酸鉀（2%）硝酸銀(0.1%)常用表面消毒劑酸性培養(yǎng)基:如10ml培養(yǎng)基中加三滴25%的乳酸

孟加拉紅：0.035g/L培養(yǎng)基抗菌素:金霉素（30μg/ml）可抑制多數(shù)細(xì)菌;青霉素（20μg/ml）可抑制G+細(xì)菌;多粘霉素（5.0μg/ml）可抑制G-細(xì)菌;鏈霉素(40μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)可抑制大部細(xì)菌.

除氯霉素可滅菌前加入外，其它抗菌素都是在培養(yǎng)基滅菌后并冷卻到45℃左右時(shí)加入.