酵母細(xì)胞的固定化

課題3

酵母細(xì)胞的固定化429572439gao一、基礎(chǔ)知識(shí)1、酶制劑的概念和種類（一）酶制劑含有酶的制品①定義：多酶片、加酶洗衣粉中的蛋白酶和脂肪酶②種類：A、液體酶制劑治療某些胃病的胃蛋白酶液B、固體酶制劑429572439gao2、酶的生產(chǎn)①提取法定義：采用一定的技術(shù)直接從動(dòng)植物或微生物的組織、細(xì)胞中將酶提取出來優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，在動(dòng)植物或微生物資源豐富的地區(qū)具有應(yīng)用價(jià)值實(shí)例：在屠宰廠，可以從家畜胰臟中提取出胰酶；在水果加工廠，可以從菠蘿皮中提取出菠蘿蛋白酶缺點(diǎn)：要有充足的原材料，廣泛應(yīng)用受到限制429572439gao②發(fā)酵法定義：通過微生物發(fā)酵獲得所需要的酶如果是胞外酶，可以從發(fā)酵液中直接提??；如果是細(xì)胞內(nèi)酶，則可將細(xì)胞弄碎再經(jīng)過提取純化而得到易培養(yǎng)、繁殖速度快、便于大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)點(diǎn)：提取方式：429572439gao③化學(xué)合成法缺點(diǎn)：成本高、已知分子結(jié)構(gòu)的酶提取出來的酶還要經(jīng)過分離、純化，再加入適量的穩(wěn)定劑和填充劑，制成相應(yīng)的酶制劑后才能用于催化化學(xué)反應(yīng)3、酶的提取和分離純化429572439gao①酶的提取鹽溶液提取法、堿溶液提取法、有機(jī)溶劑提取法適宜的溫度和pH和保護(hù)劑方法：條件：②酶的分離提純沉淀技術(shù)（密度梯度離心法）層析技術(shù)方法：429572439gao4、酶制劑特點(diǎn)(看課本P49面）①天然酶通常對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和有機(jī)溶劑等條件非常敏感，容易失活②溶液中酶很難回收，不能再次利用，提高了生產(chǎn)成本③反應(yīng)后，酶會(huì)混在產(chǎn)物中，影響產(chǎn)品質(zhì)量，難以在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用（1）優(yōu)點(diǎn)（2）實(shí)際問題催化效率高、低耗能、低污染，大規(guī)模地應(yīng)用于食品、化工等各個(gè)領(lǐng)域如何解決這些問題？429572439gao（二）固定化酶固定化酶是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動(dòng)受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑（三）固定化細(xì)胞將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定化技術(shù)被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞固定化技術(shù)：固定化細(xì)胞：429572439gao類型優(yōu)點(diǎn)不足直接使用酶催化效率高，低耗能、低污染等對(duì)環(huán)境條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；反應(yīng)后酶會(huì)混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量固定化酶酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離，同時(shí)，固定在載體上的酶還可以被反復(fù)利用一種酶只能催化一種化學(xué)反應(yīng)，而在生產(chǎn)實(shí)踐中，很多產(chǎn)物的形成都通過一系列的酶促反應(yīng)才能得到的固定化細(xì)胞成本低、操作容易、對(duì)酶活性的影響更小、可以催化一系列的反應(yīng)、容易回收固定后的酶或細(xì)胞與反應(yīng)物不容易接近，可能導(dǎo)致反應(yīng)效果下降由于大分子物質(zhì)難以自由通過細(xì)胞膜，因此固定化細(xì)胞的應(yīng)用也受到限制（四）直接使用酶、固定化酶和固定化細(xì)胞催化的優(yōu)缺點(diǎn)429572439gao（五）酶和細(xì)胞固定化方法思考：固定化酶或固定化細(xì)胞可以采取哪些方法？各有什么利弊？1、物理吸附法2、包埋法3、化學(xué)結(jié)合法429572439gao方法原理適用對(duì)象包埋法將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)劑(包括交聯(lián)劑)的作用進(jìn)行聚合，酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化酶或細(xì)胞429572439gao方法原理適用對(duì)象化學(xué)結(jié)合法酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載休表面上的功能基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵而固定的方法酶物理吸附法通過氫鍵、疏水作用和π電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上。從而制成固定化酶酶429572439gao429572439gao429572439gao（六）酶和細(xì)胞固定方法的選擇①酶適合采用化學(xué)結(jié)合和物理吸附法固定②細(xì)胞適合采用包埋法固定1、方法2、原因①細(xì)胞個(gè)大，酶分子很?、趥€(gè)體大的細(xì)胞難以被吸附或結(jié)合而個(gè)小的酶容易從包埋的材料中漏出429572439gao（七）固定化酶的應(yīng)用實(shí)例1、高果糖漿①生產(chǎn)原料葡萄糖，葡萄糖是由淀粉轉(zhuǎn)化而來是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)作用，將其中一部分葡萄糖異構(gòu)成果糖，由葡萄糖和果糖而組成的一種混合糖糖漿②生產(chǎn)機(jī)理429572439gao③生產(chǎn)流程含淀粉的漿液α-淀粉酶糊精糖化酶葡萄糖葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖的異構(gòu)化42%～45%轉(zhuǎn)化成果糖果葡糖漿果糖和葡萄糖分離葡萄糖再次異構(gòu)化反復(fù)多次果糖含量70%～90%高果糖漿429572439gao④生產(chǎn)優(yōu)點(diǎn)反應(yīng)柱能連續(xù)使用半年，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了果糖的產(chǎn)量和質(zhì)量429572439gao二、實(shí)驗(yàn)操作（一）方法1、包埋法固定化細(xì)胞2、海藻酸鈉作載體包埋酵母細(xì)胞（二）制備固定化酵母細(xì)胞429572439gao1、酵母細(xì)胞的活化①過程稱取1g干酵母，放入50ml的小燒杯中，加入蒸餾水10ml。用玻璃棒攪拌，使酵母細(xì)胞混合均勻，成糊狀，放置1h左右，使其活化②注意事項(xiàng)A、選用的干酵母要具有較強(qiáng)的活性，而且物種單一B、在缺水狀態(tài)下，微生物處于休眠狀態(tài)?；罨褪亲屘幱?)的微生物重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài)休眠狀態(tài)429572439gao429572439gao2、配置物質(zhì)的量濃度為0.05mol/L的CaCl2溶液①過程稱取無水CaCl20.83g，放入200ml的燒杯中，加入150ml的蒸餾水，使其充分溶解，待用②注意事項(xiàng)溶解物質(zhì)要徹底，勿用自來水溶解，以防自來水中各種離子影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果429572439gao3、配制海藻酸鈉溶液稱取0.7g海藻酸鈉，放入50ml小燒杯中，加入10ml水，用酒精燈加熱，邊加熱邊攪拌，將海藻酸鈉調(diào)成糊狀，直至完全溶化，用蒸餾水定容至10ml①過程②注意事項(xiàng)加熱時(shí)要用()，或者()，反復(fù)幾次，直到海藻酸鈉溶化為止小火間斷加熱429572439gao海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細(xì)胞的質(zhì)量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少429572439gao429572439gao4、海藻酸鈉溶液和酵母細(xì)胞混合將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入以活化的酵母細(xì)胞，進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，再轉(zhuǎn)移至注射器中①過程②注意事項(xiàng)A、溶化好的海藻酸鈉溶液必須冷卻至室溫，否則會(huì)因溫度過高殺死酵母菌429572439gao429572439gaoB、攪拌要徹底充分，使兩者混合均勻，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察（5）固定化酵母細(xì)胞以恒定的速度緩慢的將注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，將形成的凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右①過程429572439gao429572439gao②注意事項(xiàng)A、可利用海藻酸鈉制成不含酵母菌的凝膠珠，用作對(duì)照B、海藻酸鈉膠體在CaCl2這種電解質(zhì)的作用下，發(fā)生聚沉，形成凝膠珠，需穩(wěn)定30min左右（三）用固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵①將固定化酵母細(xì)胞（凝膠珠）用蒸餾水沖洗2－3次，洗去凝膠珠表面多余的電解質(zhì)溶液1、過程429572439gao剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCl2溶液中浸泡一段時(shí)間，以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。檢驗(yàn)?zāi)z珠的質(zhì)量是否合格，可以使用下列方法。一是用鑷子夾起一個(gè)凝膠珠放在實(shí)驗(yàn)桌上用手?jǐn)D壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。二是在實(shí)驗(yàn)桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的429572439gao②將150ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的葡萄糖溶液轉(zhuǎn)移至200ml的錐形瓶中，再加入固定好的酵母細(xì)胞，置于25°C下發(fā)酵24h2、注意事項(xiàng)①控制好發(fā)酵溫度，一般是室溫25°C②發(fā)酵時(shí)間可視具體情況而定，一般時(shí)間稍長(zhǎng)一些，效果明顯③可用不含酵母的凝膠珠做相同的處理，對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果429572439gao4295724