第四章 有機(jī)物定量分析

有機(jī)定量分析

有機(jī)定量分析是指對(duì)于混合物中某一已知組分或幾種組分的含量測(cè)定。在生產(chǎn)和科研中用于：

(1)食品或天然、產(chǎn)物中的糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等成分含量分析。(2)醫(yī)藥、獸藥飼料添加劑農(nóng)藥中的有效成分分析。(3)環(huán)境保護(hù)方面對(duì)于空氣、水體、土壤中的污染成分分析2023/2/51有機(jī)定量分析

pro是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，它的溶液是典型的膠體分散體系，由兩性氨基酸通過(guò)肽鍵結(jié)合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是C、H、O、N、S、P另外還有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。對(duì)于不同的pro，它的組成和結(jié)構(gòu)不同，但從分析數(shù)據(jù)可以得到近似的pro的元素組成百分比。元素組成百分比：元素

C

H

O

N

S

P

百分比50

7

23

16

0-3

0-3一般來(lái)說(shuō)，pro的平均含氮量為100/16，所以在用凱氏定氮法定量pro時(shí)，將測(cè)得的總氮%乘上pro的換稱(chēng)參數(shù)K=6.25即為該物質(zhì)的pro含量。但當(dāng)測(cè)定的樣品其含氮的系數(shù)與上面100/16相差較大時(shí)，采用6.25將會(huì)引起顯著的偏差。一蛋白質(zhì)的定量分析方法

2023/2/52有機(jī)定量分析

對(duì)于氮含量換算成pro含量的等數(shù)，歷來(lái)采用6.25，這個(gè)數(shù)值是以pro平均含氮而導(dǎo)出的數(shù)值，但是食品中含氮的比例，因食品種類(lèi)不同，差別是很大的，我們?cè)跍y(cè)定pro時(shí)，應(yīng)該是不同的食品采用不同的換算等數(shù)，一般手冊(cè)上列出了一部分換稱(chēng)等數(shù)：蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麥=5.83，玉米=6.25，小麥=5.83，麩皮=6.31，面粉=5.70。如果手冊(cè)上查不到的樣品則可用6.25，一般在寫(xiě)報(bào)告時(shí)要注明采用的換算等數(shù)以何物代替。近幾年，國(guó)際組織認(rèn)為6.25的換算等數(shù)太高，特別是對(duì)蛋品、肉品及魚(yú)類(lèi)，貝類(lèi)等動(dòng)物性食品，根據(jù)以氨基酸組成總量計(jì)算的比6.25要低的多。關(guān)于氮-pro換算等數(shù)2023/2/53有機(jī)定量分析pro的測(cè)定方法分為兩大類(lèi)：

一類(lèi)是利用pro的共性，即含氮量，肽鏈和折射率測(cè)定pro含量.另一類(lèi)是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定pro含量。但是食品種類(lèi)很多，食品中pro含量又不同，特別是其他成分，如碳水化合物，脂肪和維生素的干擾成分很多，因此pro的測(cè)定通常利用經(jīng)典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標(biāo)準(zhǔn)酸液吸收，用標(biāo)準(zhǔn)酸或堿液滴定，由樣品中含氮量計(jì)算出pro的含量。根據(jù)食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。2023/2/54有機(jī)定量分析

這種方法是1883年Kjeldahl發(fā)明，當(dāng)時(shí)凱氏只使用H2SO4來(lái)分解試樣，來(lái)定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解試樣，而不能闡明H2SO4分解有機(jī)氮化合物生成氨的反應(yīng)歷程，所以只使用H2SO4分解試樣，需要較長(zhǎng)時(shí)間，后來(lái)由Gunning加入改進(jìn)，他改進(jìn)的辦法是在消化時(shí)加入K2SO4使沸點(diǎn)上升，這樣加快分解速度，因?yàn)闇囟扔稍瓉?lái)硫酸沸點(diǎn)的330上升到400℃，所以速度也就加快了，凱氏定氮法至今仍在使用。我們?cè)跈z驗(yàn)食品中pro時(shí)，往往只限于測(cè)定總氮量，然后乘以pro核算等數(shù)，得到蛋白質(zhì)含量，實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類(lèi)脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱(chēng)為粗pro。(一)凱氏定氮法2023/2/55有機(jī)定量分析首先第一個(gè)步驟是消化：（1）消化：樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機(jī)物脫水。并破壞有機(jī)物，使有機(jī)物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而pro則分解氮，則與硫酸結(jié)合成硫酸銨，留在酸性溶液中。在消化過(guò)程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機(jī)物分解，它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸加熱沸點(diǎn)330℃，而添加硫酸鉀后，溫度可達(dá)400℃，加速了整個(gè)反應(yīng)過(guò)程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類(lèi)來(lái)提高沸點(diǎn)。其理由隨著消化過(guò)程硫酸的不斷地被分解，水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點(diǎn)增加。加速了有機(jī)的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會(huì)分解，放出氨而造成損失。為了加速反應(yīng)過(guò)程，還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過(guò)氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。

2023/2/56有機(jī)定量分析（2）蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過(guò)量，二是要防止樣液中氨氣逸出。

(3)吸收與滴定：蒸餾過(guò)程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行氨的吸收，然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過(guò)剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計(jì)算出總氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用。

2023/2/57有機(jī)定量分析MRMOMR(凱氏定氮法)NaOHHCl2023/2/58有機(jī)定量分析凱氏定氮裝置1.安全管2.導(dǎo)管3.汽水分離器4.塞子5.進(jìn)樣口6.冷凝管7.吸收瓶8.隔熱液套9.反應(yīng)管10.蒸汽發(fā)生器消化樣品濃H2SO4CuSO4·5H2OK2SO4樣品空白2.蒸NH32023/2/59有機(jī)定量分析計(jì)算：

N（V2-V1）14.01

總氮量%=

-----------------------------

×

100

W

pro%=總氮%×K

乳制品K=6.38（N=15.7%）

小麥粉K=5.79（N=17.6%）

動(dòng)物膠K=5.6（N=18.0%）

冰蛋K=6.7（N=14.8%）

大豆制品K=6.0（16.7%）

K=6.25則（N=16%）

K-換稱(chēng)等數(shù)2023/2/510有機(jī)定量分析

(1)消化時(shí)間一般約4小時(shí)左右即可，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起氨的損失。如樣品中含賴(lài)氨酸或組氨酸較多時(shí)，消化時(shí)間需延長(zhǎng)1—2倍。因?yàn)檫@兩種氨基酸中的氮在短時(shí)間內(nèi)不易消化完全，往往導(dǎo)致總氮量偏低。注意事項(xiàng)

(2)若樣品中脂肪或糖較多時(shí)，消化時(shí)間要長(zhǎng)些。還應(yīng)注意發(fā)生的大量泡沫，防止它溢出瓶外。須時(shí)時(shí)搖動(dòng)，并減小火焰，甚至停止加熱半小時(shí)底再用小火消化。2023/2/511有機(jī)定量分析

在消化過(guò)程中為了加速分解過(guò)程，縮短消化時(shí)間，常加入下列物質(zhì)：樣品的分解條件功用是提高溶液的沸點(diǎn)。K2SO4

在消化過(guò)程中，隨著硫酸的不斷分解，水分的不斷蒸發(fā)，K2SO4的濃度逐漸增大，則沸點(diǎn)升高，加速了對(duì)有機(jī)物的分解作用。

K2SO4與硫酸的用量比值不宜過(guò)大，因溫度過(guò)高，生成的硫酸氫銨也會(huì)分解，放出氨，使氮損失。2023/2/512有機(jī)定量分析

Cu2SO4為紅色沉淀，當(dāng)C完全消化后，反應(yīng)停止，紅色消失，變?yōu)樘m色，即為消化達(dá)到完全，蘭色為CuSO4的顏色催化劑CuSO4:氧化汞和汞:氧化汞和汞是良好的催化劑

氧化汞和汞都是劇毒物質(zhì)，使用時(shí)必須有安全可靠的通風(fēng)設(shè)備，還會(huì)污染環(huán)境，而且價(jià)格昂貴。2023/2/513有機(jī)定量分析硒粉催化效能可大大縮短消化時(shí)問(wèn)。2023/2/514有機(jī)定量分析

(1)次氯酸鉀和高錳酸鉀一般不宜使用這類(lèi)強(qiáng)氧化劑。次氯酸鉀的催化作用強(qiáng)，由于其氧化性強(qiáng)，可將一部分氨進(jìn)一步氧化成氮而損失。若試樣富含碳時(shí)，可使用高錳酸鉀。

(2)過(guò)氧化氫具有消化速度高，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，近常推薦采用這種氧化劑。但在使用時(shí)要特別注意，須待消化液完全冷卻后再加入數(shù)滴過(guò)氧化氫。氧化劑

添加氧化劑可幫助有機(jī)物消化，但要防止氨進(jìn)一少氧化為氮。一般說(shuō)來(lái)，若有足夠量的其他還原劑，如碳，則添加氧化則不致使測(cè)定結(jié)果偏低。2023/2/515有機(jī)定量分析一、原理

考馬斯亮藍(lán)G-250以?xún)煞N不同顏色存在即紅色與藍(lán)色，當(dāng)染色劑與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，紅色就轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色。這種蛋白質(zhì)染色劑復(fù)合物有較高的消光系數(shù)。因此，用這種方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量靈敏度比較高，染色劑和蛋白質(zhì)的結(jié)合過(guò)程迅速，大約2分鐘，而且蛋白質(zhì)—染色劑復(fù)合物能在溶液中保持穩(wěn)定1小時(shí)之久。(二)可溶性蛋白質(zhì)的測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)G-250法）2023/2/516有機(jī)定量分析CoomassieDye-Based蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+2023/2/517有機(jī)定量分析二、材料、儀器與試劑（一）材料：綠豆芽、馬鈴薯。（二）儀器：分光光度計(jì)，分析天平，容量瓶、移液管、具塞刻度試管。（三）試劑1．考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑：稱(chēng)取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入85%正磷酸100ml，最后加蒸餾水至1000ml，此溶液可在常溫下放置一個(gè)月。

試劑2．蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：稱(chēng)取100mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸餾水中，制成100μg·ml-1

貯備液。再按下表比例配制成每毫升分別含200μg，400μg，600μg，800μg，1000μg蛋白標(biāo)準(zhǔn)液及每毫升分別含20μg，40μg，60μg，80μg，100μg蛋白的標(biāo)準(zhǔn)液。表1高濃度蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的配制蛋白濃度(μg·ml-1)2004006008001000加貯備液(ml)0.40.81.21.62.0加蒸餾水(ml)1.61.20.80.40

2023/2/518有機(jī)定量分析表2低濃度蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的配制蛋白濃度(μg·mL-1)20406080100加貯備液(mL)0.20.40.60.81.0加蒸餾水(mL)9.89.69.49.29.0

三、操作步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1．100~1000μg·ml-1

蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取含有200μg，400μg，600μg，800μg，1000μg的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.1ml,分別放入10ml刻度試管中，加入5.0ml考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，將溶液混勻，2分鐘后在595nm處測(cè)其消光值，空白以蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)液，其它操作同上。2023/2/519有機(jī)定量分析2．0~100μg·ml-1

蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取0.5ml含20μg，40μg，60μg，80μg，100μg牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，分別放入10ml具塞刻度試管中，加入5.0ml考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，其它操作同上。以消光值為縱坐標(biāo)，蛋白含量為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）樣品中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定：樣品中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定除加入標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品液外，其余操作完全相同，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查得每毫升溶液中蛋白質(zhì)的含量。四、注意事項(xiàng)1在配制不同濃度蛋白質(zhì)溶液時(shí)，比色管一要事先干燥。

2在分別吸取蛋白質(zhì)溶液后應(yīng)立即蓋上塞子，避免水分蒸發(fā)影響測(cè)定的結(jié)果。

2023/2/520有機(jī)定量分析1原理：

pro及其降解產(chǎn)物的芳香環(huán)基，在紫外區(qū)內(nèi)對(duì)某一波長(zhǎng)具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與pro濃度（3~8mg/ml）成直線關(guān)系，因此，通過(guò)測(cè)定pro溶液的吸光度，并參照事先用K氏定氮法分析的標(biāo)準(zhǔn)樣品，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出蛋白質(zhì)的含量。(三)紫外分光光度法2023/2/521有機(jī)定量分析2

試劑：

（1）0.1mol/l檸檬酸水溶液。（2）8mol/l脲[（NH2）2CO]的2NNaOH溶液。脲的2N氫氧化物（3）

95%乙醇（4）無(wú)水乙醚3

儀器（1）

紫外分光光度計(jì)（2）

離心機(jī)4

操作方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品.2.00g，置于50ml燒瓶中，加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml，攪拌30分鐘使其充分溶解，用四層紗布過(guò)濾于玻璃離心管中。2023/2/522有機(jī)定量分析

以每秒鐘3000~5000轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘，分別吸出上清液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6個(gè)10ml容量瓶中，每個(gè)容量瓶，8mol/l脲的氫氧化鈉溶液充分搖2分鐘（如果渾濁再次離心），取透明液于比色皿中，在280nm下測(cè)定其吸光度。（做參比值）以事先用K氏定氮法測(cè)定的樣品中蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)上面的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣1.00g→于50ml燒杯中→加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml→攪拌10分鐘→四層紗布過(guò)濾到離心管中→用8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻后于280nm下測(cè)吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出pro的含量。說(shuō)明：a.此法運(yùn)用于糕點(diǎn)，牛乳和可溶性pro樣品，測(cè)定糕點(diǎn)時(shí)，應(yīng)把表皮顏色去掉。

b.溫度對(duì)pro水解有影響，操作溫度應(yīng)控制在20~30℃。2023/2/523有機(jī)定量分析

原理：

雙縮脲在堿性條件中，能與CuSO4結(jié)合成紅紫色的絡(luò)合物。pro分子中含有肽鏈與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，也呈此反應(yīng)。本法直接用于測(cè)定像小麥粉等固體試樣的pro含量。但作為銅的穩(wěn)定劑，酒石酸鉀鈉比甘油好些。(四)雙縮脲法-皮尼克法

準(zhǔn)確稱(chēng)樣→0.5g→于80ml離心管→加1mlCCl4→混合→加50ml酒石酸鉀鈉穩(wěn)定劑→蓋上蓋子離心10min（4000轉(zhuǎn)/分）→放置1小時(shí)→吸混合液15ml→于20ml離心管中→離心到完全透明→取上清夜5ml于→10ml容量瓶→加水定容→于550nm處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出pro含量。

計(jì)算：蛋白質(zhì)%=C/W×100C----從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得pro含量（mg）W----測(cè)定樣液時(shí)相當(dāng)于樣品重量（mg）2023/2/524有機(jī)定量分析

pro經(jīng)水解或酶解可由大分子變成小的pro成分，如水解后的產(chǎn)物經(jīng)胨，肽等最后成為氨基酸，氨基酸是構(gòu)成pro最基本的物質(zhì)。水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化學(xué)結(jié)構(gòu)以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差別與水解的程度有密切關(guān)系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。二氨基酸總量測(cè)定

氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測(cè)定出17種氨基酸（儀器價(jià)格昂貴，不能普遍使用），對(duì)于食品來(lái)說(shuō)有時(shí)有很多種氨基酸可以同時(shí)存在于一種食品中，所以需要測(cè)定總的氨基酸量，它們不能以氨基酸百分率來(lái)表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸態(tài)氮）的百分率表示，當(dāng)然，如果食品中只含有一種氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以從含氮量計(jì)算出氨基酸的含量。2023/2/525有機(jī)定量分析一、原理氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)色化合物（除脯氨酸外均有此反應(yīng)），可用吸光光度法測(cè)定。該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長(zhǎng)為570nm，故據(jù)此可以測(cè)定樣品中氨基酸含量。茚三酮法測(cè)定氨基酸總量二、主要儀器分光光度計(jì)三、試劑2%茚三酮溶液：稱(chēng)取茚三酮1g于盛有35mL熱水的燒杯中使其溶解，加入40mg氯化亞錫（SnCl2·H2O）,攪拌過(guò)濾（作防腐劑）。濾液置冷暗處過(guò)夜，加水至50mL，搖勻備用。

pH8.04磷酸緩沖溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取磷酸二氫鉀（KH2PO4）4.5350g于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)入500mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取磷酸氫二鈉（Na2HPO4）11.9380g于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)入500mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻備用。取上述配好的磷酸二氫鉀溶液10.0mL與190mL磷酸氫二鈉溶液混合均勻即為pH8.04的磷酸緩沖溶液。2023/2/526有機(jī)定量分析3.氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的氨基酸（如異亮氨酸）0.2000g于燒杯中，先用少量水溶解后，定量轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻。準(zhǔn)確吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻。此為200μg·mL-1氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。四、操作方法

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確吸取200μg·mL-1的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0mL，0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL，2.5mL，3.0mL（相當(dāng)于0μg，100μg，200μg，300μg，400μg，500μg，600μg氨基酸），分別置于25mL容量瓶或比色管中，各加水補(bǔ)充至容積為4.0mL，然后加入茚三酮和磷酸緩沖溶液各1mL，混合均勻，于水浴上加熱15分鐘，取出迅速冷至室溫，加水至標(biāo)線，搖勻。靜置15分鐘后，在5570nm波長(zhǎng)下，以試劑空白為參比液測(cè)定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2023/2/527有機(jī)定量分析2.樣品的測(cè)定吸取澄清的樣品溶液1~4mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟，在相同條件下測(cè)定吸光度A值，用測(cè)得的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得對(duì)應(yīng)的氨基酸微克數(shù)。

說(shuō)明及注意事項(xiàng)

1.通常采用樣品處理方法為：準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎樣品

5~10g或吸取液體樣品

5~10mL，置于燒杯中，加入50mL蒸餾水和5g左右活性炭，加熱煮沸，過(guò)濾，用30~40mL熱水洗滌活性炭，收集濾液于100mL容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻備測(cè)。2.茚三酮受陽(yáng)光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進(jìn)行純化，方法如下：取10g茚三酮溶于40mL熱水中，加入1g活性炭，搖動(dòng)1分鐘，靜置30分鐘，過(guò)濾。將濾液放入冰箱中過(guò)夜，即出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶，過(guò)濾，用2mL冷水洗滌結(jié)晶，置干燥器中干燥，裝瓶備用。

3.空氣中氧氣干擾顯色一步，抗壞血酸保護(hù)可以提高靈敏度。4.溫度超過(guò)80℃容易褪色；適當(dāng)延長(zhǎng)溫?zé)釙r(shí)間效果較好。2023/2/528有機(jī)定量分析碳水化合物的測(cè)定

碳水化合物是生物界三大物質(zhì)之一（Pro,Fat）,是自然界最豐富的有機(jī)物質(zhì)。碳水化合物主要存在于植物界，如谷類(lèi)食物和水果蔬菜的主要成分是(CH2O)n。碳水化合物統(tǒng)稱(chēng)為糖類(lèi)，它包含了單糖、低聚糖及多糖，是大多數(shù)食品中重要組成成分，也是人和動(dòng)物體的重要能源。單糖、雙糖、淀粉能為人體所消化吸收，提供熱能，果膠、纖維素維持人體健康具有重要作用。2023/2/529有機(jī)定量分析常用的混合糖的分離純化方法一.提取常用溶劑有：水和乙醇，在提取糖類(lèi)時(shí)，先將樣品磨碎浸泡成溶液，若有脂肪的樣品用石油醚提取，撤去其中的脂肪和葉綠素。1.

水作提取劑用水作提取劑，溫度控制在45-50℃，利用水作提取劑時(shí)，還有pro、氨基酸、多糖、色素干擾，影響過(guò)濾時(shí)間，所以用水作提取劑應(yīng)注意：1）溫度過(guò)高：是可溶性淀粉及糊精提取出來(lái)。2）酸性樣品：酸性使糖水解（轉(zhuǎn)化），所以酸性樣品用碳酸鈣中和，提取但應(yīng)控制在中性。3）萃取的液體：有酶活性時(shí)，同樣是使糖水解，加二氯化汞可防止（二氯化汞可抑制酶活性）2.乙醇（水溶液）作提取液乙醇作提取液適用于含酶多的樣品，這樣避免糖被水解。乙醇的濃度70-80％。濃度過(guò)高，糖溶在乙醇中，用乙醇的目的，降低酶的作用，避免糖被酶水解。2023/2/530有機(jī)定量分析二.澄清劑1.

作用：

沉淀一些干擾物質(zhì)，使提取液清亮透明，達(dá)到準(zhǔn)確的測(cè)量糖類(lèi)。（常用澄清劑來(lái)澄清）2.

對(duì)澄清劑的要求：1）除干擾物質(zhì)完全，不吸附被測(cè)物質(zhì)糖2）過(guò)量澄清劑不影響糖的測(cè)量3）沉淀顆粒要小，操作簡(jiǎn)便4）不改變糖類(lèi)的比旋光度及理化性質(zhì)3.

實(shí)驗(yàn)室常用的澄清劑1）中性醋酸鉛：適用于植物性的萃取液，它可除去蛋白質(zhì)、丹寧、有機(jī)酸、果膠。缺點(diǎn)：脫色力差，不能用于深色糖液的澄清，否則加活性炭處理。

2）堿性醋酸鉛適用深色的蔗糖溶液，可除色素，有機(jī)酸，蛋白質(zhì)缺點(diǎn)：沉淀顆粒大，可帶走果糖。（3）醋酸鋅和亞鐵氰化鉀

用于富含蛋白質(zhì)的提取液，常用于沉淀蛋白質(zhì)，對(duì)乳制品最理想。主要是生成的亞鐵氰酸鋅（白色沉淀）與蛋白質(zhì)共同沉淀。所以使動(dòng)物性樣品的沉淀劑。（4）Al(OH)3乳劑是輔助澄清劑。（5）CuSO4-NaOH這種澄清劑用于牛乳等樣品。314．澄清劑的用量在一般操作時(shí)，加澄清劑量多少一定要恰當(dāng)，用量太少，達(dá)不到澄清的目的，用量太多使分析結(jié)果產(chǎn)生誤差，不同的物質(zhì)，因干擾物質(zhì)種類(lèi)和含量的不同，所以添加量也不同。過(guò)量以后，糖液中有Zn2+,

Pb2+,等。過(guò)量的Pb2+還原糖生成鉛糖。這樣使測(cè)得糖量降低。所以要加除鉛劑，防止生成鉛糖，降低糖的濃度。三．常用的除鉛劑

K2CrO4(苯酸鉀)；Na2CrO4(苯酸鈉)；Na2HPO4(磷酸氫二鈉)；Na2SO4(硫酸鈉)；[使用時(shí)可加少量固體即可]2023/2/532有機(jī)定量分析糖的測(cè)定方法對(duì)于糖的測(cè)定方法有很多，大致可分為三類(lèi)1.物理法，（1.旋光法,

2.折光法,

3.比重法,）2.物理化學(xué)法,(1.點(diǎn)位法,2極普法,3.光度法,4.色譜法)3.化學(xué)方法,(1.斐林氏法.2.高錳酸鉀法.3.碘量法.4.鐵氰化鉀法.5.蒽銅比色法.6.咔唑比色法)共計(jì)三大種，在測(cè)定其他碳水化合物時(shí)，往往是使其水解為糖再進(jìn)行測(cè)定。2023/2/533有機(jī)定量分析

還原糖是指具有還原性的糖類(lèi)。葡萄糖分子中含有游離醛基、果糖分子中含有游離酮基，乳糖和麥芽糖分子中含有游離的潛醛基，它們都是還原糖。其他雙糖（如蔗糖）、三糖乃至多糖（如糊精、淀粉等），其本身不具還原性，屬于非還原性糖，但都可以通過(guò)水解而生成相應(yīng)的還原性單糖，測(cè)定水解液的還原糖含量就可以求得樣品中相應(yīng)糖類(lèi)的含量。因此，還原糖的測(cè)定是一般糖類(lèi)定量的基礎(chǔ)。還原糖的測(cè)定方法很多，其中最常用的有直接滴定法、高錳酸鉀滴定法、薩氏法、碘量法等。(一)還原糖的測(cè)定2023/2/534有機(jī)定量分析一．原理將一定量的堿性酒石酸銅甲、乙液等量混合，立即生成天藍(lán)色的氫氧化銅沉淀，這種沉淀很快與酒石酸鉀鈉反應(yīng)，生成深藍(lán)色的可溶性酒石酸鉀鈉銅絡(luò)合物。在加熱條件下，以次甲基藍(lán)作為指示劑，用樣液滴定，樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應(yīng)，生成紅色的氧化亞銅沉淀，待二價(jià)銅全部被還原后，稍過(guò)量的還原糖把次甲基藍(lán)還原，溶液由藍(lán)色變?yōu)闊o(wú)色，即為滴定終點(diǎn)。根據(jù)樣液消耗量可計(jì)算出還原糖含量。各步反應(yīng)式(以葡萄糖為例)如下：直接滴定法2023/2/535有機(jī)定量分析

從上述反應(yīng)式可知，1mol葡萄糖可以將6molCu(2+)還原為Cu(+1)。實(shí)際上兩者之間的反應(yīng)并非那么簡(jiǎn)單,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明．1mol葡萄糖只能還原5mol多點(diǎn)的Cu(2+)，且隨反應(yīng)條件而變化。因此，不能據(jù)上述反應(yīng)式直接計(jì)算出還原糖含量，而是用已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定的方法，或利用通過(guò)實(shí)驗(yàn)編制出的還原糖檢索表來(lái)計(jì)算。2023/2/536有機(jī)定量分析二、試劑

1.堿性酒石酸銅甲液：稱(chēng)取15g硫酸銅（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基藍(lán)，溶于水中并稀釋到1000mL。

2．堿性酒石酸銅乙液：稱(chēng)取50g酒石酸鉀鈉及75g氫氧化鈉，溶于水中，再加入4g亞鐵氰化鉀，完全溶解后，用水稀釋至1000mL，貯存于橡皮塞玻璃瓶中。

3.乙酸鋅溶液：稱(chēng)取21.9乙酸鋅（Zn(CH3COO)2·2H2O）,加3mL冰醋酸，加水溶解并稀釋到100mL。

4.10.6%亞鐵氰化鉀溶液：稱(chēng)取10.6g亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6·3H2O],溶于水中,稀釋至100mL。5.0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0000g經(jīng)過(guò)98-100℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖，加水溶解后移入1000mL容量瓶中，加入5mL鹽酸（防止微生物生長(zhǎng)），用水稀釋到1000mL。2023/2/537有機(jī)定量分析三、測(cè)定方法

1.樣品處理

取適量樣品研細(xì)，加水提取樣品中的還原糖，提取液轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，慢慢加入5ml乙酸鋅溶液和5ml亞鐵氰化鉀溶液，加水至刻度，搖勻后靜置30分鐘。用干燥濾紙過(guò)濾，棄去初濾液，收集濾液備用。

2.堿性酒石酸銅溶液的標(biāo)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取堿性酒石酸銅甲液和乙液各5ml，置于250ml錐形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3粒。加熱使溶液沸騰后，從滴定管滴加約9ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，趁熱以每2秒1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄消耗葡萄糖溶液的總體積。平行測(cè)定3次，取其平均值，按下式計(jì)算。

F=C×V式中：F——10ml堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量，mg；

C——葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/ml；

V——標(biāo)定時(shí)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積，ml。

2023/2/538有機(jī)定量分析3.樣品溶液預(yù)測(cè)

吸取堿性酒石酸銅甲液及乙液各5.00mL，置于250mL錐形瓶中，加水10mL，加玻璃珠3粒，加熱使其在2分鐘內(nèi)至沸，準(zhǔn)確沸騰30秒鐘，趁熱以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液，滴定時(shí)要始終保持溶液呈沸騰狀態(tài)。待溶液藍(lán)色變淺時(shí)，以每2秒1滴的速度滴定，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄樣品液消耗的體積。

4.樣品溶液測(cè)定

取堿性酒石酸銅甲液及乙液各5.00mL，置于250mL錐形瓶中，加玻璃珠3粒，加熱至溶液沸騰后，從滴定管中加入比預(yù)測(cè)時(shí)樣品溶液消耗總體積少1mL的樣品溶液，趁熱以每2秒1滴的速度繼續(xù)滴加樣液，直至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄消耗樣品溶液的總體積。同法平行測(cè)定3次，取平均值。2023/2/539有機(jī)定量分析四、結(jié)果計(jì)算還原糖（葡萄糖計(jì)%）=F×100/[m×(V/100)×1000]式中：m——樣品質(zhì)量，g;F——10ml堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量，mg;V——測(cè)定時(shí)平均消耗樣品溶液的體積，mL；100——樣品溶液的總體積，mL。適用范圍及特點(diǎn)本法又稱(chēng)快速法，它是在藍(lán)一愛(ài)農(nóng)容量法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其特點(diǎn)是試劑用量少，操作和計(jì)算都比較簡(jiǎn)便、快速，滴定終點(diǎn)明顯。適用于各類(lèi)食品中還原糖的測(cè)定。但測(cè)定醬油、深色果汁等樣品時(shí)，因色深干擾，滴定終點(diǎn)常常模糊不清，影響準(zhǔn)確性。本法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分析方法。2023/2/540有機(jī)定量分析

高錳酸鉀滴定法

1．原理將一定量的樣液與一定量過(guò)量的堿性酒石酸銅溶液反應(yīng)，還原糖將二價(jià)銅還原為氧化亞銅，經(jīng)過(guò)濾，得到氧化亞銅沉淀，加入過(guò)量的酸性硫酸鐵溶液將其氧化溶解，而三價(jià)鐵鹽被定量地還原為亞鐵鹽，用高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定所生成的亞鐵鹽，根據(jù)高錳酸鉀溶液消耗量可計(jì)算出氧化亞銅的量，再?gòu)臋z索表中查出與氧化亞銅量相當(dāng)?shù)倪€原糖量，即可計(jì)算出樣品中還原糖含量。各步反應(yīng)式如下：

由反應(yīng)式可見(jiàn)，5molCuSO4相當(dāng)于2摩爾KMnO4故根據(jù)高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量可計(jì)算出氧化亞銅量。再由氧化亞銅量查檢索表得出相當(dāng)?shù)倪€原糖量。2023/2/541有機(jī)定量分析

2．測(cè)定方法

(1)樣品處理取適量樣品，根據(jù)樣品的組成、性狀按前述原則進(jìn)行提取，提取液移入250ml容量瓶中，慢慢加入10ml堿性酒石酸銅甲液和4m11mol氫氧化鈉溶液，加水至刻度，混勻，靜置30分鐘、用干燥濾紙過(guò)濾，棄去初濾液．濾液供測(cè)定用。（此步驟目的是沉淀蛋白）

(2)測(cè)定吸取50m1處理后的樣品溶液于400m1燒杯中，加堿性灑石酸銅甲、乙液各25m1，蓋上表面皿，置電爐上加熱，使其在4分鐘內(nèi)沸騰，再準(zhǔn)確沸騰2分鐘，趁熱用鋪好石棉的坩堝抽濾，并用60℃熱水洗滌燒杯及沉淀，至洗液不呈堿性反應(yīng)為止。將坩堝放回原400mI燒杯中，加25ml硫酸鐵溶液及25m1水，用玻璃棒攪拌使氧化亞銅完全溶解，以高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。記錄高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量。同時(shí)吸取50m1水代替樣液，按上述方法做試劑空白試驗(yàn)。記錄空白試驗(yàn)消耗高錳酸鉀溶液的量。2023/2/542有機(jī)定量分析結(jié)果計(jì)算

3．適用范圍及特點(diǎn)本法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分析方法，適用于各類(lèi)食品中還原糖的測(cè)定，有色樣液也不受限制。方法的準(zhǔn)確度高，準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都優(yōu)于直接滴定法。但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，需使用特制的高錳酸鉀法糖類(lèi)檢索表。2023/2/543有機(jī)定量分析一、原理淀粉是食品中主要的組成部分，也是植物種子中重要的貯藏性多糖。由于淀粉顆?？膳c碘生成深藍(lán)色的絡(luò)合物，故可根據(jù)生成絡(luò)合物顏色的深淺，用分光光度計(jì)測(cè)定消光度而計(jì)算出淀粉的含量。

二、材料、儀器與試劑

材料：馬鈴薯、栗子、山藥等。儀器：分光光度計(jì)、小臺(tái)秤、分析天平、燒杯（100mL）、研缽、容量瓶（100mL）、洗瓶、漏斗、濾紙、具塞刻度試管（15mL）、恒溫水浴、移液管（1mL,2mL）。

試劑:1．碘液：稱(chēng)取20.00g碘化鉀，加50mL蒸餾水溶解，再用小臺(tái)秤迅速稱(chēng)取碘2.0g，置燒杯中，將溶解的KI溶液倒入其中，用玻棒攪拌，直到碘完全溶解，若碘不能完全溶解時(shí)，可再加少許固體碘化鉀即能溶解，碘液貯存在棕色小滴瓶中待用，用時(shí)稀釋50倍。

2．乙醚A.R。

3．10%乙醇A.R。淀粉含量的測(cè)定（碘量法）2023/2/544有機(jī)定量分析三、操作步驟

（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g精制馬鈴薯淀粉，加入5.0mL蒸餾水制成勻漿，逐漸倒入90mL左右沸騰的蒸餾水中，邊倒邊攪拌，即得澄清透明的糊化淀粉溶液，置100mL容量瓶中，用少量蒸餾水沖洗燒杯。定容，此淀粉溶液濃度為10mg/mL（A液）。吸取A液2.0mL置100mL容量瓶，定容，此時(shí)淀粉濃度為200μg/mL（B液）。取具塞刻度試管8支，按下表加入淀粉及碘液，再加蒸餾水使每支試管溶液補(bǔ)足到10mL，搖勻，待藍(lán)色溶液穩(wěn)定10min后，用分光光度計(jì)于660nm波長(zhǎng)處測(cè)其消光值。以消光值為縱坐標(biāo)，已知淀粉溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試管編號(hào)12345678

標(biāo)準(zhǔn)淀粉溶液

(μg·mL-1)/mL

00.51.01.52.02.53.04.0

碘液/mL0.20.20.20.20.20.20.20.2蒸餾水/mL9.89.38.88.37.87.36.85.8

淀粉含量

/μg·mL-101002003004005006008002023/2/545有機(jī)定量分析（二）樣品處理：馬鈴薯洗凈，去皮，用擦子擦成碎絲，迅速稱(chēng)取馬鈴薯碎絲300g，置研缽中磨成勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移到漏斗中，用乙醚50mL分5次洗滌，再用10%乙醇洗滌3次，以除去樣品中的色素，可溶性糖及其它非淀粉物質(zhì)，然后將濾紙上的殘留物轉(zhuǎn)移到100mL燒杯中，用蒸餾水分次將濾紙上的殘留物全部洗入燒杯，將燒杯置沸水浴中邊攪拌邊加熱，直到淀粉全部糊化成澄清透明。將此糊化淀粉轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，定容，混勻（C液）。

（三）測(cè)定：吸取C液2.0mL，置1，000mL容量瓶中，用蒸餾水定容，混勻。準(zhǔn)確吸取2mL樣品溶液（吸取量依樣品中淀粉濃度而變），置15mL具塞刻度試管，加入碘液0.2mL，直至溶液呈現(xiàn)透明藍(lán)色，用蒸餾水補(bǔ)足到10mL，混勻，靜置10min，于660nm波長(zhǎng)處測(cè)定消光值。由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品中淀粉含量（g/100g鮮重）。2023/2/546有機(jī)定量分析淀粉含量的測(cè)定一、原理

淀粉測(cè)定可先除去樣品中的脂肪及其中的可溶性糖、再在一定酸度下，將淀粉水解為具有還原性的葡萄糖。通過(guò)對(duì)還原糖含量的測(cè)定，乘上一換算系數(shù)0.9，即為淀粉含量，反應(yīng)式如下：(C6H10O5)n+nH2O→nC6H12O6

n×162.1n×180.2根據(jù)反應(yīng)公式，淀粉與葡萄糖之比為：162.1∶180.12=0.9∶1，即0.9g淀粉水解后可得1g葡萄糖。

二、材料、儀器與試劑

材料：馬鈴薯、蘋(píng)果、葡萄等。儀器：滴定管(15mL)、移液管（5mL）、燒杯、三角瓶（150mL）、容量瓶（500mL,250mL,100mL）漏斗、研缽、酒精燈、鐵架臺(tái)、滴定管夾、水浴鍋、分析天平。2023/2/547有機(jī)定量分析試劑：硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉A.R、鹽酸A.R、次甲基藍(lán)A.R、醋酸鉛A.R、硫酸鈉A.R、酚酞A.R。1．菲林試劑甲A.R：稱(chēng)取硫酸銅34.639g加入蒸餾水溶解后，置于500mL容量瓶中，加水稀釋到刻度，混勻。

2．菲林試劑乙A.R：稱(chēng)取酒石酸鉀鈉173g及氫氧化鈉50g，加蒸餾水溶解后置于500mL容量瓶中，加水稀釋到刻度，混勻，過(guò)濾后待用。

3．蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制A.R：用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取1g蔗糖，溶解后移入250mL容量瓶中定容，混勻后吸取50mL放入100mL容量瓶中，加2.5mL12mol/LHCL，在沸水中煮10min，取出迅速用冷水沖洗冷卻至室溫，加1%酚酞2-3滴，加6mol/LNaOH中和至微紅，定容，混勻，用此標(biāo)準(zhǔn)液滴定菲林試劑，求出標(biāo)準(zhǔn)蔗糖液1mL中糖含量。2023/2/548有機(jī)定量分析三、操作步驟

（一）樣品處理：稱(chēng)去皮切碎的蘋(píng)果肉2g，置研缽中磨成勻漿，用蒸餾水沖洗轉(zhuǎn)移入100mL容量瓶中，加2.5mL12mol/LHCl在沸水浴中煮10min，取出2冷卻，此時(shí)樣品中的蔗糖水解成還原糖。對(duì)含蛋白質(zhì)較多的樣品，可滴加10%Pb(Ac)2到溶液不再產(chǎn)生白色絮狀沉淀時(shí)為止，加飽和Na2SO4除去多余的鉛離子，然后加1%酚酞2-3滴，加6mol/LNaOH中和至微紅，定容到100mL，搖勻后過(guò)濾待測(cè)。（二）測(cè)定：吸取5mL菲林試劑甲和5ml菲林試劑乙，放入150mL的三角瓶中。加入1-2滴次甲基藍(lán)，置酒精燈上加熱至沸騰，用竹制試管夾夾住三角瓶，邊搖動(dòng)邊滴定，真至樣品提取液將菲林試劑滴定至上清液變?yōu)闊o(wú)色（同時(shí)出現(xiàn)紅棕色的氧化亞銅沉淀）記錄下樣品滴定用量的毫升數(shù)，重復(fù)一次，求兩次讀數(shù)的平均值為樣品滴定用量四、計(jì)算

淀粉（%）=

標(biāo)準(zhǔn)蔗糖1mL中含糖量×滴定用量———————————×稀釋倍數(shù)×100×0.9

樣品重量×1000

2023/2/549有機(jī)定量分析五、注意事項(xiàng)

（一）如樣品含糖量高時(shí)需適當(dāng)加大稀釋倍數(shù)。（二）掌握滴定終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需用白色做背景，便于觀察溶液從藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色，且必須在沸騰時(shí)觀察，否則易氧化成藍(lán)色不易判別終點(diǎn)。（三）總糖的測(cè)定亦可用此法，但需用HCl將多糖水解，轉(zhuǎn)化成還原糖并適當(dāng)稀釋后測(cè)定。（四）樣品中含有可溶性糖時(shí)，可先用乙醇溶解除去可溶性糖再測(cè)淀粉含量。2023/2/550有機(jī)定量分析四植物葉子葉綠素含量的測(cè)定原理：綠色植物色素主要是葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素。在用丙酮提取的植物色素中選擇葉綠素a、b單色光波長(zhǎng)的最大吸收峰633nm和645nm的波長(zhǎng)測(cè)吸光度。又知葉綠素a、葉綠素b分別在633nm的吸收系數(shù)為82.04和9.27在645nm波長(zhǎng)下的吸收系數(shù)為16.75和45.60。根據(jù)吸光度加和性原理有：A663=82.04Ca+9.27

CbA645=16.75Ca+45.60Cb求出葉綠素a、b的含量就可以求出葉綠素總量CT。

CT=Ca+Cb。注意：不同溶劑的提取物最大吸收波長(zhǎng)和吸收系數(shù)不同。

2023/2/551有機(jī)定量分析材料、儀器設(shè)備儀器：分光光度計(jì)，電子天平，研缽、小漏斗、棕色容量瓶，定量濾紙，吸水紙，檫鏡紙，滴管。試劑：80%的丙酮，石英沙，碳酸鈣粉末。取新鮮綠色葉片，檫凈葉片表面污物，（去掉中脈）剪碎，混均勻。試驗(yàn)步驟稱(chēng)取碎葉片3份，每份0.2克。分別放入研缽中，加入少量石英沙和碳酸鈣粉末及2.5毫升80%丙酮，研成勻漿，再加10毫升丙酮繼續(xù)研磨直至組織變白。靜置3—5分鐘。過(guò)濾，用少量丙酮淋洗殘?jiān)筒ＡО魯?shù)次，直至殘?jiān)鼰o(wú)色為止。洗液一起轉(zhuǎn)入25毫升棕色容量瓶，搖勻，定容。用1cm比色皿，80%丙酮為空白，在663nm和645nm處測(cè)吸光度。注意：為了避免葉綠素在強(qiáng)光下分解，試驗(yàn)應(yīng)該在弱光下操作。葉綠素提取液不能渾濁，可在710或750nm處測(cè)量其吸光度，其值應(yīng)小于波長(zhǎng)為葉綠素a吸收峰處的5%，否則應(yīng)該重新過(guò)濾。對(duì)波長(zhǎng)要求精確度高，否則誤差大。2023/2/552有機(jī)定量分析一、原理

β-胡蘿卜素為脂溶性維生素A的前體，存在各種動(dòng)植物體中，所以可直接用有機(jī)溶劑提取后進(jìn)行檢測(cè)。利用反相色譜法分析。

二、材料、儀器與試劑

（一）材料：胡蘿卜、綠色蔬菜等。（二）儀器：高效液相色譜儀、記錄儀或積分儀、分析天平、組織搗碎機(jī)、研缽、抽濾瓶、布氏漏斗、分液漏斗（250mL2個(gè)）、容量瓶(100mL)、漏斗、移液管（2mL）小試管、濾紙等。（三）試劑：正已烷、甲醇、無(wú)水硫酸鈉、乙酸乙酯、BHT（叔丁基羥基甲苯）（以上均為分析純?cè)噭⒌獨(dú)狻?/p>

20%氫氧化鉀的甲醇溶液：稱(chēng)20g氫氧化鉀溶于100mL甲醇溶液中。

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱(chēng)取標(biāo)樣5.000mg，乙酸乙酯溶解并定容50mL。冰箱中保存，上機(jī)前再稀釋50倍。五β-胡蘿卜素含量的測(cè)定（HPLC法）2023/2/553有機(jī)定量分析三、操作步驟

（一）樣品處理：取樣品的可食部分洗凈切碎，置組織搗碎機(jī)中搗碎成漿狀，于天平上稱(chēng)5-10g樣品，放入研缽中，同時(shí)加少量甲醇、已烷研磨.然后倒入布氏漏斗抽濾，并不斷用甲醇、已烷沖洗研缽及殘?jiān)?，直至殘?jiān)鼮榘咨⒑袠悠返娜芤旱谷胧孪妊b有50mL已烷的分液漏斗中，用蒸餾水沖洗抽濾瓶2-3次，洗液并入分液漏斗，振搖分液漏斗后靜止分層，將下層溶液放入裝有30mL正已烷的另一分液漏斗中，向第一分液漏斗中加10mL20%氫氧化鉀的甲醇溶液，振搖后分層，上層為黃色溶液。將下層放入另一分液漏斗中，處理同上。合并二次正已烷提取液，用蒸餾水洗至中性，pH試紙測(cè)試為6左右，然后用無(wú)水硫酸鈉脫水，提取液轉(zhuǎn)移到100mL棕色容量瓶中，加0.1gBHT，并用正已烷沖洗分液漏斗數(shù)次，最后定容至刻度。上機(jī)前取1-2mL提取液于小試管中，氮?dú)獯蹈桑?.0mL乙酸乙酯溶解后上機(jī)。2023/2/554有機(jī)定量分析（二）色譜條件：色譜柱：μ-BondapakC-18(300×3.9mm)；流動(dòng)相：100%甲醇；流速：1.2mL/min；檢測(cè)器：可見(jiàn)光450nm；衰減：0.08AT；紙速：0.4cm/min；柱溫：室溫：進(jìn)樣量：20μL。四、計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間定性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰高或峰面積與樣品峰的比較而定量。五、注意事項(xiàng)

β-胡蘿卜素遇光和氧都會(huì)迅速破壞，所以樣品應(yīng)避光保存，所有標(biāo)準(zhǔn)β-胡蘿卜素必須臨時(shí)配制。2023/2/555有機(jī)定量分析一、原理

脂肪的測(cè)定可用有機(jī)溶劑提取樣品中的脂肪，蒸發(fā)溶劑后得到的剩余物稱(chēng)為脂肪，除脂肪外，還含有色素、蠟質(zhì)、揮發(fā)油、磷脂等，所以又稱(chēng)粗脂肪，在大多數(shù)食品中，這些雜質(zhì)含量極少，可以忽略。二、材料、儀器與試劑（一）材料：谷物、豆類(lèi)等。（二）儀器：索氏提取器（如圖）、燒瓶（150mL）、恒溫水?。ㄈ┰噭海?）無(wú)水乙醚；（2）海砂。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。六粗脂肪的測(cè)定（索氏抽提法）2023/2/556有機(jī)定量分析三、操作步驟精確稱(chēng)取充分研碎的干燥樣品2.00-5.00g，在105℃烘箱中烘干，置于已稱(chēng)重的濾紙筒內(nèi)（半固體或液體樣品取5.0-10.0g于蒸發(fā)皿中，加入海砂20g，于水浴上蒸干，在100-150℃烘干，研細(xì)，全部移入濾紙筒內(nèi)，蒸發(fā)皿及附有樣品的玻璃棒用蘸有乙醚的棉花擦凈，棉花也放進(jìn)濾紙筒內(nèi)。將濾紙筒封好后小心放入索氏提取器的提取筒內(nèi)，應(yīng)使濾紙筒高度低于虹吸管上端彎曲部位。連接已恒重的蒸發(fā)燒瓶。加入無(wú)水乙醚至燒瓶中，乙醚量為瓶的2/3體積，于水浴上加熱，乙醚開(kāi)始回流后，仔細(xì)調(diào)整水浴溫度，使虹吸回流速度控制在8-12次/h，一般抽提6-12h。（如乙醚揮發(fā)過(guò)多，可從冷凝管上端補(bǔ)充）。取下接收瓶?；厥找颐阎疗?jī)?nèi)剩1-2ml時(shí)，在水浴上蒸干，再于100-105℃干燥40-60min，取出于干燥器中冷卻30min，稱(chēng)提取瓶及內(nèi)容物的重量，所增加的重量即脂肪的重量。四、計(jì)算粗脂肪%=

W1—W0×100

W式中：W——樣品重（g）

W0——接收瓶重（g）

W1——接收瓶和脂肪重（g）2023/2/557有機(jī)定量分析

二氮氧喹喔啉類(lèi)化合物是研究較早的具有抗菌活性的物質(zhì)。二氮氧喹喔啉甲醛—酰腙類(lèi)化合物不但具有抗菌活性，而且可以作為除草劑使用。但是由于腙類(lèi)化合物極難溶于一般溶劑，故未見(jiàn)有關(guān)該類(lèi)酰腙化合物定量分析的報(bào)道。二氮氧喹喔啉甲醛—水楊酰腙是黃色固體，但由于極難溶解，其DMSO的飽和溶液只顯淡黃色，且隨著濃度降低迅速趨于無(wú)色；用KOH與之反應(yīng)后顯出鮮明的橙黃色。利用這一性質(zhì)建立了該化合物的分光光度測(cè)定法。七二氮氧喹喔啉甲醛—水楊酰腙定量分析2023/2/558有機(jī)定量分析水楊酰腙鈉鹽酰基氮原子上的氫原子有酸性，可以與烯醇式形成平衡。KOH在非水溶劑DMSO中的堿性比在水溶液中大約強(qiáng)104倍，而且濃度比酰腙的烯醇式大得多，故可以將酰腙全部轉(zhuǎn)變成烯醇式負(fù)離子而顯色。二氮氧喹噁啉甲醛—水楊酰腙是二元酸，首先酚羥基與氫氧化鉀反應(yīng)生成鈉鹽。顯色機(jī)理如下:2023/2/559有機(jī)定量分析儀器與試劑722分光光度計(jì)；

高效液相色譜儀檢測(cè)純度為99.5%）；恒溫油浴鍋；所用玻璃儀器均需無(wú)水；1，4—二氮氧喹喔啉甲醛—水楊酰腙（自合成，DMSO中三次重結(jié)晶至熔點(diǎn)不變；KOH的DMSO溶液（將分析純的KOH溶于DMSO中配稱(chēng)成飽和溶液,濃度約4%）。

2023/2/560有機(jī)定量分析分析方法二氮氧喹喔啉甲醛—水楊酰腙的標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的測(cè)定稱(chēng)取純度為99.5%的二氮氧喹喔啉甲醛—水楊酰腙20mg置于150mL具塞瓶中，加入約90mL的DMSO，塞好塞子（注意，DMSO極易吸潮！）50℃恒溫油浴溶解。然后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶，用8mLDMSO分兩次洗滌具塞瓶，洗液轉(zhuǎn)入容量瓶，搖勻，DMSO定容后作為標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液(0.2mg/mL)。取8個(gè)10mL容量瓶，每個(gè)容量瓶中用移液管分別加入5mL飽和KOH的DMSO溶液,再依次加入0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、1.2、1.5mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，DMSO定容。5min顯色，用試劑空白對(duì)照，1cm比色皿在波長(zhǎng)440nm處測(cè)其吸光度。平行實(shí)驗(yàn)三次，取其平均值作定量分析。2023/2/561有機(jī)定量分析結(jié)果與討論用最小二乘法處理表1的數(shù)據(jù)得如下回歸方程：A=0.0563C－0.019，r=0.999；在1.00—30.0×10-4mg/mL的濃度范圍內(nèi)符合朗伯—比耳定律。顯色劑濃度

用氫氧化鉀顯色,由于KOH在DMSO中溶解度有限，濃度選擇范圍不大。在顯色液中氫氧化鉀濃度為0.5%時(shí)，較高濃度的酰腙（20—40×10-4mg/mL）能夠較好的服朗伯—比耳定律；KOH濃度接近于4%時(shí)，較低濃度的酰腙（0.5—20×10-4mg/mL）能夠較好的服從朗伯—比耳定律。取KOH濃度為1~2%時(shí)比較適宜。顯色溫度和時(shí)間

用氫氧化鉀顯色,溫度越高色度越深,顯色越快,但是吸光度波動(dòng)性也越大。在室溫下化合物可以5min內(nèi)充分顯色，故無(wú)須升溫。但是DMSO的凝固點(diǎn)較高（19℃）故分析溫度不能低于20℃。顯色液在室溫時(shí)4h內(nèi)吸光度穩(wěn)定

用1~2%氫氧化鉀溶液顯色，在1.00—30.0×10-4

mg/mL濃度范圍內(nèi)服從朗伯—比耳定律，濃度太高或太低都會(huì)偏離朗伯—比耳定律。本試驗(yàn)必須在無(wú)水的條件下操作，如大量水分進(jìn)入DMSO溶液，會(huì)大大降低樣品的溶解性和KOH的堿性，使樣品析出或不能很好的轉(zhuǎn)變成烯醇式負(fù)離子。2023/2/562有機(jī)定量分析八:藥物普馬嗪、氯丙嗪、異丙嗪

分離與鑒定原理：普馬嗪、氯丙嗪、異丙嗪都屬于吩噻嗪類(lèi)藥物，與氯化鈀反應(yīng)生成藍(lán)色絡(luò)合物。三者混合液用乙酸乙酯萃取，普馬嗪不轉(zhuǎn)入乙酸乙酯中。故可用分光光度法測(cè)定普馬嗪、氯丙嗪和異丙嗪。又異丙嗪與硫酸汞生成紅色物質(zhì)，普馬嗪和氯丙嗪呈負(fù)反應(yīng)，故可以測(cè)定異丙嗪。試劑PH=2的緩沖溶液，10g三水合醋酸鈉溶于50mL水，加入80mL1N的鹽酸，加水至200毫升。氯化鈀溶液：5克氯化鈀溶解于50毫升1N的鹽酸中；硫酸汞溶液：5克氧化汞溶于80毫升和20毫升水中。2023/2/563有機(jī)定量分析普馬嗪、氯丙嗪、異丙嗪的測(cè)定操作：取含有樣品50—150ug的水溶液1毫升，加入5毫升緩沖溶液和0.5毫升氯化鈀溶液，加水成7毫升混勻，顯色15分鐘。以試劑為空白，在500nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。用同樣方法測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。折算樣品含量。氯丙嗪和異丙嗪的測(cè)定與50毫升漏斗中加入5毫升緩沖溶液，0.5毫升氯化鈀溶液，加入含有500微克/毫升氯丙嗪和異丙嗪的樣品，加水1毫升混勻。加入10毫升乙酸乙酯，萃取。用1N的鹽酸5毫升洗滌乙酸乙酯，5分鐘后在440nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度用同樣方法測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。折算樣品含量2023/2/564有機(jī)定量分析異丙嗪的測(cè)定取含50—100毫克的樣品1毫升加入1毫升硫酸汞溶液，水浴加熱10分鐘，冷卻；加水至50毫升，10分鐘后顯色。以1毫升試劑加4毫升水為空白對(duì)照，在500nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。用同樣方法測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。折算樣品含量。吩噻嗪基本結(jié)構(gòu)式：2023/2/565有機(jī)定量分析農(nóng)藥有效成分含量分析農(nóng)藥有效成分含量分析一般用氣相色譜或液相色譜分析法。如殺蟲(chóng)劑久效磷的含量分析用液相色譜法。如右旋反式烯丙菊酯的含量用氣相色譜法。2023/2/566有機(jī)定量分析久效磷分析方法提要：試樣用甲醇溶解。以甲醇/水為流動(dòng)相，在LichrosorbRP18柱上對(duì)式樣中的久效磷進(jìn)行分析。紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。分析條件色譜柱：250mm×4.6mm不銹鋼柱，填充LichrosorbRP18；保護(hù)柱20mm×2.0mm不銹鋼柱，PellicularODS；流動(dòng)相：甲醇+乙腈+水=80+10+10（V/V）；已脫氣。流速：1.5mL/

min監(jiān)測(cè)器靈敏度：0.1AUFS；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm

溫度：室溫；進(jìn)樣體積：10uL；保留時(shí)間：5.8nim。2023/2/567有機(jī)定量分析右旋反式烯丙菊酯的含量分析方法提要試樣用丙酮溶解，一鄰苯二甲酸二丁酯為內(nèi)標(biāo)物；在OV—101/chromosorbW-HP色譜柱上分離。用帶有氫火焰離子化檢測(cè)器的氣象色譜儀對(duì)試樣中的右旋反式烯丙菊酯進(jìn)行測(cè)定。分析條件色譜柱：1.2m×4mm，內(nèi)填5%OV—101/chromosorbW-HP(150—200um)；溫度：柱室160，氣化室230，檢測(cè)室230；載氣（氮?dú)猓┝魉伲?25mL/min；進(jìn)樣體積：3uL右旋反式烯丙菊酯保留時(shí)間7min,內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間4min。2023/2/568有機(jī)定量分析九：有機(jī)物中水分的檢驗(yàn)和測(cè)定

水分雖然不是有機(jī)化合物，但是在分析有機(jī)物時(shí)，經(jīng)常要檢測(cè)有機(jī)物中的水分。這是因?yàn)樗质怯袡C(jī)物中經(jīng)常存在的雜質(zhì)之一。由于水的存在:一，影響有機(jī)物的純度、品質(zhì)及性質(zhì)；二，影響有機(jī)反應(yīng)的正常進(jìn)行。有機(jī)合成反應(yīng)中的F—C烷基化反應(yīng)，要在無(wú)水的條件下．以三氯化鋁作催化劑，才能使烷基化順利進(jìn)行。又如，格氏試劑的制備，必須在無(wú)水乙醚介質(zhì)中進(jìn)行。水分的存在，將直接影響反應(yīng)的效率，甚至使反應(yīng)失??；三，影響有機(jī)分析結(jié)果的正確性和靈敏度。例如，在非水溶劑中，測(cè)定弱酸或弱堿的含量時(shí)，水分的存在，將使測(cè)定終點(diǎn)不夠敏銳。又如，在有機(jī)功能團(tuán)的測(cè)定中，有時(shí)是根據(jù)測(cè)定反應(yīng)中所消耗的水分或生成的水分的含量來(lái)進(jìn)行定量分析的，有機(jī)物中水分的存在必然影響分析結(jié)果。綜上所述，有必要檢驗(yàn)有機(jī)物中的水分。2023/2/569有機(jī)定量分析水分的檢驗(yàn)

在有機(jī)化合物中檢出水分，目前還沒(méi)有一種簡(jiǎn)便通用的方法，應(yīng)根據(jù)試樣的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

水分的檢出:化學(xué)方法:氯化鈷、四乙酸鉛、二苦胺、硫化鋁、乙醇鎂、碳化鈣等物理方法:層析法和儀器法等。2023/2/570有機(jī)定量分析氯化鈷或溴化鈷是檢出水分應(yīng)用得最廣泛的試劑。無(wú)水氯化鈷呈淺藍(lán)色，與水生成二、三、四和六水合物而分別呈紫色(CoCl2·2H20)、紅紫色(CoCl2·3H20)、洋紅色(CoCl2·4H20)紅棕色(CoCl2·5H20)

無(wú)水溴化鈷呈鮮綠色，而其六水合物呈紅色紅色(CoBr2·6H20)。檢驗(yàn)水分時(shí)，可取數(shù)滴5％無(wú)水氯化鈷的丙酮溶液，加于試樣的丙酮溶液中，觀察其變色情況?；诼然捇蜾寤挼淖兩?，可確定被測(cè)物中水分是否存在，并可大概估計(jì)水分含量的多少。本法不適宜于含氮、含氧等有機(jī)物中水分的檢出。氯化鈷法2023/2/571有機(jī)定量分析

許多液體有機(jī)化合物，可以用3％四乙酸鉛的苯溶液來(lái)檢驗(yàn)。即使少至(5PPm)的水分，也可由苯溶液呈棕色而檢出。若有較多的水分時(shí)，則將有二氧化鉛棕色沉淀產(chǎn)生：四乙酸鉛法在對(duì)水分檢驗(yàn)的要求不高時(shí)，可以用比較簡(jiǎn)單的方法檢驗(yàn)。

(1)取約50mg無(wú)水硫酸銅，置于表面皿上，加l滴試樣、如硫酸銅顯藍(lán)色．表示有微量水分存在?！?/p>

(2)取少量乙醇鋁．置于表面皿上，加3—4滴試樣，如有膠狀的氫氧化鋁沉淀生成時(shí)，表示有少量水分存在。

(3)取約0.5mL試樣，適于試管中，加1