第二章 酶促反應(yīng)動力學(xué)

第二章均相酶促反應(yīng)動力學(xué)2.1酶促反應(yīng)動力學(xué)的特點2.2單底物均相酶促反應(yīng)動力學(xué)2.3固定化酶促反應(yīng)動力學(xué)2.4酶的失活動力學(xué)2.1酶促反應(yīng)動力學(xué)的特點2.1.1酶的基本概念酶是一種催化劑具備催化劑的特性降低反應(yīng)的活化能；不影響反應(yīng)的平衡常數(shù)；加速反應(yīng)的進(jìn)行。酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)酶催化的特性酶有很強的專一型；酶的催化效率很高。2.1.2酶促反應(yīng)的特征優(yōu)點在常溫、常壓、中性范圍條件下進(jìn)行；由于酶促反應(yīng)的專一性，副產(chǎn)物較少；與微生物相反應(yīng)相比，體系簡單，易控制最適條件不足酶促反應(yīng)多限于一步或幾步較簡單的生化反應(yīng)，與微生物體系相比，在經(jīng)濟(jì)上有時并不理想；酶促反應(yīng)條件溫和，但一般周期較長，有發(fā)生染菌可能；固定化酶反應(yīng)體系有許多優(yōu)于有利酶反應(yīng)體系的優(yōu)點，但并非是最佳的生物催化劑。2.2單底物均相酶促反應(yīng)動力學(xué)2.2.1酶促反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ)1.零級反應(yīng)：酶促反應(yīng)速率與底物濃度無關(guān)式中：[S]---底物濃度；rmax—最大反應(yīng)速率。2.一級反應(yīng)：反應(yīng)速率與底物濃度的一次方成正比，即酶催化A→B的反應(yīng)過程。式中：K1—一級反應(yīng)速率常數(shù)；a0—底物A的初始濃度；b—t時產(chǎn)物B的濃度。3.二級反應(yīng)：反應(yīng)速率與底物濃度的一次方成正比，即酶催化A+B→C的反應(yīng)過程。式中：K2—二級反應(yīng)速率常數(shù)；a0—底物A的初始濃度；b0—底物B的初始濃度；c—t時產(chǎn)物c的濃度。4.連鎖酶促反應(yīng)式中：k1,k2—各步驟反應(yīng)速率常數(shù)；a,b,c—底物A,B,C的初始濃度；t＝0時,b＝0，代入上式求得C5.舉例葡萄糖G

葡萄糖內(nèi)酯L葡萄糖酸Pk2k11.米氏方程[快速平衡說]AnEnzymaticReactionEenzymeSsubstrateESenzyme-substratecomplexPproduct4個假設(shè)：在反應(yīng)過程中，酶的濃度保持恒定，即[E]tot=[E]free+[ES]與底物濃度[S]相比，酶的濃度是很小的，因而可以忽略由于生成中間復(fù)合物而消耗的底物。產(chǎn)物的濃度是很低的，因而產(chǎn)物的抑制作用可以忽略，即不必考慮逆反應(yīng)的存在。換言之，據(jù)此假設(shè)所確定的方程僅適用于反應(yīng)初始狀態(tài)。

生成產(chǎn)物的速率要慢于底物與酶生成復(fù)合物的可逆反應(yīng)速率，因此，生成產(chǎn)物的速率決定整個酶催化反應(yīng)的速率，而生成復(fù)合物的可逆反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)。因此，又稱為“平衡”假設(shè)。

2.2.2M-M方程的建立及其特征參數(shù)的求取2.米氏方程[穩(wěn)態(tài)法]AnEnzymaticReactionEenzymeSsubstrateESenzyme-substratecomplexPproduct4個假設(shè)：在反應(yīng)過程中，酶的濃度保持恒定，即[E]tot=[E]free+[ES]與底物濃度[S]相比，酶的濃度是很小的，因而可以忽略由于生成中間復(fù)合物而消耗的底物。產(chǎn)物的濃度是很低的，因而產(chǎn)物的抑制作用可以忽略，即不必考慮逆反應(yīng)的存在。換言之，據(jù)此假設(shè)所確定的方程僅適用于反應(yīng)初始狀態(tài)。

當(dāng)從中間復(fù)合物生成產(chǎn)物的速率不能忽略，反應(yīng)體系中底物濃度要比酶的濃度高得多，中間復(fù)合物分解時所得到的酶又立即與底物相結(jié)合，從而使反應(yīng)體系中復(fù)合物濃度維持不變，即中間復(fù)合物的濃度不再隨時間而變化，這就是“擬穩(wěn)態(tài)”假設(shè)。

Michaelis-MentenConstant由米氏方程可知：當(dāng)[S]<<Km

rp=k+2e[S]/Km當(dāng)[S]>>Km

rp≈rp,max=k+2e3.特征常數(shù)Km和rp,max的求法Lineweaver-burk法，雙倒數(shù)法1/rp1/rp1/[S]斜率=Km/rp,max1/rp,max0⊙⊙⊙⊙⊙說明雙倒數(shù)圖解法用得最為廣泛；在S濃度較低的一側(cè)，常因測定困難，rp值的誤差有增大的傾向。Eadie-Hofstee法rprp/[S]斜率=-Km0⊙⊙⊙⊙⊙說明此方法的優(yōu)點是即使S濃度范圍很大，也能通過圖解法求得rp值；但因兩軸上都包含實測值rp，故誤差較大。Hanes—Woolf法(簡稱H—W法)，又稱Langmuir作圖法[S]/rp[S]斜率=1/rp,max0⊙⊙⊙⊙⊙-Km其中：k1=k+2e/Kmk1=1/Km積分法⊙-1/Km斜率=k+2e/Km0⊙⊙⊙⊙式中[SES]-不具有催化反應(yīng)活性,是不能分解為產(chǎn)物的三元復(fù)合物。有些酶反應(yīng)，在底物濃度增加時，反應(yīng)速率反而會下降，這種由底物濃度增大而引起反應(yīng)速率下降的作用稱為底物抑制作用。穩(wěn)態(tài)法2.2.3底物抑制動力學(xué)穩(wěn)態(tài)法2.2.4產(chǎn)物抑制動力學(xué)穩(wěn)態(tài)法2.3有抑制劑酶促反應(yīng)動力學(xué)2.3.1競爭性抑制劑穩(wěn)態(tài)法2.3.2非競爭性抑制劑對上述機(jī)理同樣存在下述關(guān)系:CE0=CE+C[ES]+C[EI]+C[SEI]式中C[SEI]

—底物-酶-抑制劑三元復(fù)合物濃度式中rI,max

—存在非競爭性抑制時的最大反應(yīng)速率2.3.3反競爭性抑制劑2.4復(fù)雜的酶反應(yīng)動力學(xué)擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)rES==02.4.2雙底物反應(yīng)動力學(xué)乙酰輔酶A和草酰乙酸生成檸檬酸的反應(yīng)就是雙底物反應(yīng)其機(jī)理為根據(jù)酶的總濃度不變的原則，則有

K1＝K4，K2＝K3

可推得

2.4.3平行反應(yīng)動力學(xué)定義底物的總濃度為cST,則有則總的反應(yīng)速率為2.4.4別構(gòu)酶反應(yīng)動力學(xué)2.5操作參數(shù)對酶促反應(yīng)的影響2.5.1pH對酶促反應(yīng)的影響e0=[EH2