第十一章維生素的測定

維生素的測定概述

維生素是調(diào)節(jié)人體各種新陳代謝過程必不可少的重要營養(yǎng)素。人體如從膳食中攝入維生素的量不足或者機(jī)體由于某種原因吸收或合成發(fā)生障礙時，就會引起各種維生素缺乏癥。近幾年已經(jīng)查明僅有少數(shù)幾種維生素可以在體內(nèi)合成，大多數(shù)維生素都必須由食物供給。因此，維生素作為強(qiáng)化劑已在食品工業(yè)的某些產(chǎn)品中開始使用，測定食品中的維生素含量，不僅可評價食品的營養(yǎng)價值，同時還起到監(jiān)督維生素強(qiáng)化食品的劑量，以防攝入過多的維生素而引起中毒，所以，測定食品中維生素在營養(yǎng)分析方面具有重要的意義。

第十一章維生素的測定

脂溶性微生物素（如A、D、E、K等）；水溶性維生素（如B1、B2、B6、C、B12等）。維生素A：是人體必需營養(yǎng)素，能促進(jìn)人體發(fā)育，防止眼膜炎、夜盲癥等疾病。維生素B1：也叫硫胺素，對人體的功能主要是防腳氣病、神經(jīng)炎，幫助消化，促進(jìn)發(fā)育。維生素B2：對人體功能防口角炎、皮膚炎，防止怕光現(xiàn)象。維生素C：防壞血病，促進(jìn)外傷愈合，使機(jī)體增強(qiáng)抵抗力。維生素D：調(diào)節(jié)體內(nèi)礦物鹽的平衡，特別是對人體內(nèi)鈣、磷的代謝，并能防止軟骨病。

目前已發(fā)現(xiàn)的維生素約有二、三十種，按維生素溶解性能可將它們分成兩大類：

分析方法維生素的分析方法可分為以下幾種：（1）涉及人體和動物的生物分析方法。（2）利用原生動物、細(xì)菌和酵母的微生物分析方法（3）分光光度法、熒光法、色譜、酶法和免疫等物理化學(xué)分析方法。

脂溶性維生素的測定一、維生素A目前維生素A都是合成的，來源：（1）從動物肝臟中得到；（2）從維生素前體而得到（維生素前體：主要指類胡蘿卜素，主要是β-胡蘿卜素）維生素A的測定常用的方法有三氯化銻比色法、紫外分光光度法、熒光分析法、液相色譜法。對于三氯化銻比色法適用于樣品中含VA高的樣品，方法簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，但是對維生素A含量低的樣品，如每克樣品中含5～10μg維生素A時，這時樣品由于受其脂溶性物質(zhì)的干擾，不應(yīng)用比色法測定。對于紫外分光光度法不必加顯色劑顯色，可直接測定維生素A的含量，對樣品中含VA低的也可以測出可信結(jié)果，操作簡便、快速。

1、維生素A的性質(zhì)

⑴因有許多不飽和鏈，故見光易分解；⑵在缺氧情況下，對熱較穩(wěn)定，對光特別敏感。如測強(qiáng)化奶粉時，速度要快，一般要求測定時間短，因?yàn)闀r間長，見光時間長，見光分解，故測出的比出廠的含量要少；⑶對堿穩(wěn)定；2.測定方法2.1三氯化銻光度法2.1.1測定原理在氯仿溶液中，維生素A與三氯化銻作用可生成藍(lán)色可溶性絡(luò)合物，在620nm波長處有最大吸收峰，其藍(lán)色的深淺與維生素A的含量在一定范圍內(nèi)成正比，故可通過吸光度測定維生素A的含量。

2.1.2測定步驟

⑴樣品用有機(jī)溶劑萃取脂類樣品可以根據(jù)脂肪的測定處理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取劑，也可用回流方法提取脂類。如果樣品中含蛋白質(zhì)和淀粉多的情況下可采用乙醚提取法。⑵脂類的皂化脂類含有維生素和脂肪這兩部分，通過皂化（50%KOH、無水C2H5OH、熱回流）把它們分開，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。皂化條件：（1）C2H5OH︰脂類=8︰1；（2）皂化溫度與時間：70℃、30分鐘在皂化時可以加入抗氧劑焦性沒食子酸，防止氧化。目前皂化有三種情況：低堿=脂肪︰KOH為1︰2.5的關(guān)系另外在皂化時加抗氧化劑與不加抗氧化劑回收率不一樣，加抗氧化劑的回收率高于不加抗氧化劑的回收率。

低溫（室溫）中溫（70℃±2℃）高溫（100℃15min）低堿低堿低堿回收率不完全回收率46%回收率70%⑶提?。翰辉砘锖驮砘锝?jīng)水、乙醚萃取可得到不皂化物。⑷柱層析分離干擾物質(zhì)采用柱層析分離干擾物質(zhì)，如果柱層析把β-胡蘿卜素也洗脫下來，那么這時維生素A與β-胡蘿卜素就是一個混合物，還要將它們分離開。如果樣品中只有維生素A而不含β-胡蘿卜素時，這時可直接定容。維生素A與β-胡蘿卜素分離：吸附劑：

8份中性Al2O3和2份堿性Al2O3混合，裝柱分離方法：a.用2%丙酮石油醚洗β-胡蘿卜素；

b.用乙醚洗VA。2.1.3計算SbCl3比色法維生素A／CHCl3＋SbCl3／CHCl3→形成蘭色物質(zhì)→在620nm有最大吸光峰這種蘭色物質(zhì)不穩(wěn)定，很快褪色或變成其它物質(zhì)，所以在分析時最好在暗室中進(jìn)行，并且做標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算：每百克樣品含VA的量=C×（V1/V2）×（100/W）C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得VA的量V1：CHCl3定容的量V2：測定所取樣液體積說明及討論（1）乙醚中是否含有過氧化物的檢驗(yàn)方法（2）乙醇中是否含有醛的檢驗(yàn)方法（3）三氯甲烷中是否含有分解產(chǎn)物2CHCl3+O22HCl+2CCl2O（4）所用氯仿不應(yīng)含有水SbCl3+H2OSbOCl+2HCl（4）維生素A見光易分解，整個實(shí)驗(yàn)應(yīng)在暗處進(jìn)行（5）由于三氯化銻與維生素A所產(chǎn)生的藍(lán)色物質(zhì)不穩(wěn)定，很快褪色或變成其它物質(zhì)，所以在分析時最好在暗室中進(jìn)行，并且做標(biāo)準(zhǔn)曲線。（6）三氯化銻腐蝕性較強(qiáng)，不能沾在皮膚上，用過的儀器應(yīng)用鹽酸浸泡而后清洗。（7）本法適用于維生素A含量較高的樣品。紫外吸收光譜：分子價電子能級躍遷。波長范圍：100-800nm.(1)遠(yuǎn)紫外光區(qū):

100-200nm(2)近紫外光區(qū):200-400nm(3)可見光區(qū):400-800nm250300350400nm1234eλ可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。電子躍遷的同時，伴隨著振動轉(zhuǎn)動能級的躍遷;帶狀光譜。2測定方法

2.2紫外分光光度法

紫外吸收光譜的產(chǎn)生

Lamber-Beer定律：吸收光譜法基本定律描述物質(zhì)對單色光吸收強(qiáng)弱與液層厚度和待測物濃度的關(guān)系假設(shè)一束平行單色光通過一個吸光物體

紫外分光光度法測定維生素A

原理：VA為脂溶性的，測定VA時必須先將樣品中的脂肪抽提出來進(jìn)行皂化，萃取不皂化部分，在經(jīng)柱層析除去雜質(zhì)等干擾物質(zhì)，在紫外328nm下測定，求出含量。二、維生素D

1.維生素D的性質(zhì)維生素D是類固醇的衍生物，具有維生素D活性的物質(zhì)約10余種，在功能上可以防治佝僂病。其中最主要的是維生素D2(麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣醇)。

維生素D在魚肝油和雞蛋黃等食品中含量較多，一般成人不會缺VD，而嬰兒容易缺乏。2.測定方法2.1三氯化銻光度法原理：在三氯甲烷溶液中，維生素D與三氯化銻結(jié)合生成一種橙黃色化合物，并于500nm波長處有一個最大吸收，其呈色程度與維生素D含量成正比。

維生素D／CHCl3

＋SbCl3／CHCl3→形成橙黃色物質(zhì)→500nm下測定

說明食品中維生素D含量一般較低，而其他維生素及物質(zhì)含量大于維生素D，對測定產(chǎn)生干擾，測定前必須經(jīng)柱層析除去這些物質(zhì)。此法測定值為D2和D3的總量。2.2紫外分光光度法

VD／乙醇→265nm下測定

2.3高效液相色譜法（HPLC）基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性水溶性維生素的測定一、維生素B1的測定VB1又叫硫胺素1、食品中VB1的存在形式⑴常以游離態(tài)存在；⑵復(fù)合脂形式存在（磷蛋白）；⑶輔羧酶形式存在

VB1在酵母、米糠、麥胚、花生、黃豆以及綠色的蔬菜和牛乳、蛋黃中比較豐富，動物組織不如植物含量豐富。2、VB1的性質(zhì)⑴VB1在中性、堿性下不穩(wěn)定，易分解；⑵VB1在酸性條件下穩(wěn)定，即使加熱酸性也穩(wěn)定；⑶VB1為白色結(jié)晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。

3、VB1的測定

世界各國都用熒光法測定一、熒光與磷光的產(chǎn)生過程

1.分子能級與躍遷分子能級比原子能級復(fù)雜；在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜

excitationspectrumandfluore-scencespectrum1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；2.熒光光譜(或磷光光譜)

固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（）：2.定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)濃度很低時，將括號項(xiàng)近似處理后：

If

=2.3I0lc

=Kc（2）定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度VB1的測定原理：硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中，被氧化成一種蘭色熒光物質(zhì)，即為硫色素，在紫外光下，硫色素發(fā)出熒光。二、維生素B2的測定（1）VB2的特性（PropertiesofVB2）①對熱穩(wěn)定，對酸和中性pH也穩(wěn)定,在120℃加熱6h僅少量破壞。②在堿性條件下迅速分解。③在光照下轉(zhuǎn)變?yōu)楣恻S素和光色素,并產(chǎn)生自由基,破壞其它營養(yǎng)成分產(chǎn)生異味,如牛奶的日光臭味即由此產(chǎn)生。三、維生素C的測定

維生素C是一種已糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以被人們稱做抗壞血酸，主要為還原型及脫氫型兩種，廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑橘等食品中含量較多。它是氧化還原酶之一，本身易被氧化，但在有些條件下又是一種抗氧化劑。維生素C（還原型）純品為白色無臭結(jié)晶，熔點(diǎn)190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油劑。在水溶液中易被氧化，在堿性條件下易分解，在弱酸條件中較穩(wěn)定，維生素C開始氧化為脫氫型抗壞血酸（有生理作用）。如果進(jìn)一步水解則生成2，3-二酮古樂糖酸，失去生理作用。根據(jù)它具有的還原性質(zhì)可以測定維生素C的含量。常用的測定方法有（1）2，6-二氯靛酚法

（還原型VC）（2）2，4-二硝基苯肼法

（總VC）（3）碘酸法（4）碘量法（5）熒光法

1.2，6-二氯靛酚滴定法

1、原理：還原型抗壞血酸還原染料2，6-二氯靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原后紅色消失。還原型抗壞血酸還原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。

在沒有雜質(zhì)干擾時，一定量的樣品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)2，6-二氯靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比。

注意事項(xiàng)

⑴所有試劑的配制最好都用重蒸餾水；⑵滴定時，可同時吸二個樣品。一個滴定，另一個作為觀察顏色變化的參考；⑶樣品進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，