藻類生物學(xué)實驗室新生培訓(xùn)手冊

藻類光生物學(xué)試驗室生培訓(xùn)手冊2樂觀參與，enjoyit！【培訓(xùn)內(nèi)容】●了解試驗室規(guī)章制度及爭論生須知●把握根本試驗技術(shù)●培訓(xùn)總結(jié)為了使試驗室能夠高效、有序的運轉(zhuǎn)，藻類光生物學(xué)試驗室制定了自己試驗時，各位爭論生還需要遵守爭論生守則，以保證自己能夠順當(dāng)畢業(yè)。培訓(xùn)時間：入學(xué)第一周第一天為了能夠進展科學(xué)爭論，一些根本試驗技術(shù)的把握是必需的，生將在試驗預(yù)習(xí)。培訓(xùn)時間：開學(xué)第一、二周海水二氧化碳系統(tǒng)各重量的計算：氣態(tài)CO2溶入海水后，一方面聽從亨利定律〔在肯定溫度下，氣體在液體中的飽和濃度與液面上該氣體的平衡分壓成正比〕CO2(g)←→CO2(aq)，因此CO2[CO2]與CO2的平衡分壓pCO2之間的線性關(guān)系可表示為[CO2](aq)=KH*pCO2，KH是海水中二氧化碳的溶解度系數(shù)與溫度、鹽度和壓力有關(guān);另一方面，CO2還和水反響生成碳酸，CO2＋H2O←→H2CO3，然后，H2CO3分兩步電離H2CO3←K1’→H+＋HCO3-－←K2’→CO32-＋2H+H+ 3 2 3a [HCO-]/[HCO] 〔1〕H+ 3 2 3H+ 3 3a [CO2-]/[HCO-] 〔2〕H+ 3 32K1’、K’、分別是碳酸的第1、第2表觀解離常數(shù),23其中[HCO3－]+2[CO2-]=Ac 〔3〕3Ac為碳酸鹽總堿度,它跟海水總堿度(AT)有如下關(guān)系：Ac=AT-2.206×10-5×B Cl‰×KB’/〔K’+a B =AT–BCl‰是海水氯度，KB’是硼酸的解離常數(shù)K當(dāng)海水溫度、鹽度確定時，、K’、K’、B值都可查表得到，這樣通過測定KH 1 2海水的pH和總堿度，按以下方程即可計算碳酸鹽體系各組分(HCO3-、CO32-、CO2*、∑CO2)的濃度和pCO2。由公式〔1〕〔2〕和〔3〕可得碳酸系統(tǒng)各組分計算公式：H+[HCO3-]=Ac/(1+2K2’/a )H+2 3 2 H+ 2 [CO2-]＝Ac×(K’/a )/(1+2K’/a )[CO2*]=(Ac×aH+/K1’)/(1+2K’/2 3 2 H+ 2 3∑CO2＝[HCO3－]+[CO－]+[CO2*]3H+ H+ 1 2 =Ac×[(1+K2’/a +a /K’)/(1+2K’/a pCO2=[CO2*]/KH+ H+ 1 2 2 2 3 CO(aq)和HCOCO*2 2 3 以上各參數(shù)計算在軟件CO2SYS完成(BLewis,E.,andD.W.R.Wallace.ProgramDevelopedforCO2SystemCalculations.ORNL/CDIAC-105.CarbonDioxideInformationAnalysisCenter,OakRidgeNationalLaboratory,U.S.DepartmentofEnergy,OakRidge,Tennessee.)。5.989.10DIC組分的含量。細胞色素的定量葉綠素a〔chla、葉綠素c〔chlc〕和類胡蘿卜素【試驗原理】chla665nmchla的含量?！驹囼灢襟E】1〕將藻體置于肯定量的甲醇中，放置于4℃的冰箱內(nèi)過夜處理。2〕1500g10min，750、665、652OD3Porra供給的公式,[Chla](μg/ml=16.29〔665－750－8.54〔652750，計算其含量。chlc含量：chlc(μg/ml)=67.3×A635-14.1×A668A668635668的吸取值。Strickland&Parsons的公式計算類胡蘿卜素含量：Carotenoids(μg/ml)=7.6*[(A480－A750〕-1.49*(A510－A750藻紅〔PE〕和藻藍蛋白〔PC〕0.2g的藻體，在研缽內(nèi)參加肯定量的石英砂和少量的磷酸緩沖液〔pH＝6.8〕將藻體研碎，10分鐘，取上清液，將沉淀物連續(xù)研磨，并重復(fù)上面的步驟，564 最終將溶液定容為25ml，然后用分光光度計測定A455、A 、A 564 A618A645值。PEPC[PE]=[(A564-A592)-(A455-A592)*0.2]/0.12[PC]=[(A618-A645)-(A592-A645)*0.51]/0.151.藻體研磨要盡量充分，直至離心沉淀物根本無顏色。計算題：培育液中藻體的濃度是105cells/ml,取10ml培育液，離心，750、665、652OD0.001、0.0082、0.0026，求單位細胞藻體中葉綠素含量。問答題：1.為什么在測定葉綠素定量或掃描吸取光譜時，通常需要測定750nm的吸光值？色素定量的公式較多，承受不同計算公式，驗證差異的大小。色素的提取，是定量的關(guān)鍵，如何確定提取是完全的？對于組織構(gòu)造負責(zé)的藻體，需將其研磨碎后提取，應(yīng)留意那些步驟？光合作用速率的測定C14測定方法【試驗原理】〔初級生產(chǎn)力〕依照SteemanNielsen〔1952〕14C同位素標記法來進展測定。浮游植物進展光合作用需要固定海水中的無機碳〔DIC，海HCO3-、CO32-、CO2H2CO3等形式存在，它們之間存在動態(tài)平衡，可以相互轉(zhuǎn)化，這樣當(dāng)參加H14CO3-時，經(jīng)過培育之后，通過液閃計數(shù)可以計算浮游植物14CDICH14CO3-的比例，可以推算浮游植物總共固定了DIC?！驹囼灢襟E】進展光合固碳速率測定時，將取得的水樣用180μm孔徑的篩絹濾去浮游動物，20ml的石英管中。然后用連續(xù)加樣器〔eppendorf〕吸取肯定體積的14C液體，按每管100μl〔放射活度為5μCi〕的加樣量參加，蓋上塞子搖勻后到室外承受陽光照耀〔或在太陽模擬器下。石英管蓋上或包裹上不同的膜以承受不同的陽光輻射處理，膜的類型因試驗?zāi)康牡牟煌煌?，培育過程中用流水水浴控溫〔當(dāng)以模擬器為光源時，用空調(diào)控溫24小時。GF/F直25mm20ml的液閃瓶中。最終將液閃瓶連同濾膜一起放入到一個密閉的塑料盒中，同時在盒中放一小其次天將液閃瓶取出放入45℃烘箱中烘干，儲存。每個液閃瓶中參加閃耀液〔OptiphaseHisafe3〕3ml。放置2-3h后，置于液體閃耀計數(shù)儀〔ScintillationCounter,BeckmanCoulter,LS6500〕中測定。浮游植物固碳量用以下公式計算：μgC/L=[(CPM-CPM)/Ce]×I×DIC/AL D f〔每分鐘計數(shù)的數(shù)目；CPMD為比照樣品〔暗瓶〕中被固定的放射性物質(zhì)的放射量；Ce14C的標準樣品獲得；CO214C12C的利用率存在差異，6%If1.06；DIC為培育液總?cè)芙鉄o機碳濃度；A14C的每分鐘裂變數(shù)DPM〔14C活度06固碳速率(μgC(μgchla)-1h-1)由該固碳量除以葉綠素濃度及培育時間得到。NaH14CO3

在溶液中是一個平衡體系，所以樣品盡量保存在低溫下(4oC)以氣體揮發(fā)，污染環(huán)境并影響測定結(jié)果。2操作空間通風(fēng)良好，以盡量削減呼吸吸入造成內(nèi)輻射。樣品處理是關(guān)鍵，否則會影響試驗結(jié)果，甚至看到的試驗現(xiàn)象為假象。得到2-3夠，一般酸化過夜)；野外試驗時，酸化后樣品一般要烘干(或-20oC)保存，烘烘干時間>6h。樣品帶回試驗室測定時，參加閃耀液后最好放置2-3h后測定，以便使樣品充分消化，然后再進展計數(shù)?！矯14的量與葉綠素濃度的關(guān)系〔參考數(shù)值：<0.1μgchla/L 0.1～5μgchla/L 加5μCi；>5μgchla/L 1μCi14〔AmershambioscienceUKLimiteNa14C3濃縮液12.5ml,總活度25mCi2mCi/ml50μCi/ml。具體操作為：先用一般濾紙預(yù)先過濾一定體積的海水，再用直徑50mm孔徑0.47μm的微孔濾膜反復(fù)過濾。為防止在接下來的8080%的海水將Na14CO34℃冰箱中備用。20ml5μCiC-146小時后，過濾、酸化、烘干、參加液閃計數(shù)，到得的數(shù)值是CPML9754.4，CPMD1034.8，液閃計數(shù)儀的計數(shù)0.960.32μg/L,DIC2.2mM，求海水中浮游植物的固碳速率(μgC(μgchla)-1h-1)。氧電極法〔CO2一樣，見下〕化所需要的時間以及反響槽的容積可以計算光合作用速率?！玖粢馐马棥啃枰３譁囟鹊暮愣?，并進展攪拌。30%，反響器中細胞濃度不能過高。P-Ccurve測定將細胞懸浮于無碳海水中后，取肯定體積量注入反響容器，在400μmolm-2s-1光強下，使細胞進展光合作用CO2”耗竭〔凈放氧速率為零〕之后，添加NaHCO3溶液，在各種“CO2”濃度下測定藻類的光合作用速度。Michaelis-Menten方程擬合求得：V=Vm*[S]/(Km+[S])V：給定無機碳濃度下的凈光合放氧速率[S]：DICCO2濃度一半時的無機碳〔DICCO2〕濃度留意事項放氧到達零所需的時間拉長。這種狀況下，細胞在強光照和低CO2濃度下簡潔2受損傷，導(dǎo)致光合作用活性降低;CO2濃度的適應(yīng)性，影30min30min,CO2緩沖液和試驗材料。2測定條件確實定CO2以外影響光合作用速度的主要因子有光照強度、光質(zhì)、溫度、溶CO2濃度關(guān)系之前.首先需要確定光合作用速度飽和時的光照強度，然后在此光照條件下確定其最適溫30%(封閉系統(tǒng)測定時氧濃度增高、無機碳濃度降低等導(dǎo)致光合作用低下的現(xiàn)象)。(反響液)的配制CO2〔CO2-free〕緩沖液CO2濃度反響液時是必需的。測定海產(chǎn)藻類時用低濃度的鹽酸將海N210-20min就行，水量多時可適當(dāng)延長。將海水NaOH溶液(將過NaOHCO2的NaOH溶液)pHCO32-NaOH溶液中“CO2N2向蒸餾水充氣，驅(qū)除CO2NaOHpH。由于調(diào)配好的緩沖液中還會有極少量的CO2溶入，所以最好用吸氣器再進展脫氣。25－50mmol/L的緩沖液(依據(jù)設(shè)定pH值的不同選擇MES, HEPES, Bis-Tris-Propane, Tricine, 這些緩沖液均不被細胞吸取，所以對細胞的生理活性不產(chǎn)生影響。P-Icurve測定(0,50,100,300,600,900μmol·m-2·s-1)，光照強度用光量子計測定。P－I(Pmax)(Rd)從曲線中直接讀出，P-I曲線的初始斜率(即光合作用在光限制局部的斜率)。光補償點及光飽和點的計算公式為：Ic=-Rd/ɑ,Ik=(Pmax+Rd)/ɑ(Henley1993)。紅外氣體分析法開放系統(tǒng)法：用葉室開放氣路系統(tǒng)法測定大型海藻在空氣中的CO2吸取速率。測定時所承受的溫度水平通過調(diào)整空調(diào)房中的溫度而掌握(在上可以顯示葉室中藻體的溫度)。測定呼吸速率時使葉室處于黑暗之中。依據(jù)光)重)和氣流量而計算光合(或呼吸)速率。其計算公式為：Pn=△C×F×60×273/[(273+T×22.4×DW]F(Lmi-1);T為光合反響溫度C);DW為藻樣干重〔。計算題：從海水中取一片藻體，吸干其外表水分稱得其重量是0.7g，放入葉25oC，在肯定光強條件下，其恒定△C為40ppM，氣體流速為0.2L/min,求該藻體的光合作用速率(μmoleC微藻常用培育法4.14.1(batchculture)在一個相對獨立密閉的系統(tǒng)中，一次性投入培育基對微生物進展接種培育的方(batchculture)。由于它的培育系統(tǒng)的相對密閉性，故分批培育也叫密閉培育〔closedculture。分批培育特點：他任何掌握。4,對數(shù)期、穩(wěn)定期及衰亡期。培育周期短，染菌和細胞突變的風(fēng)險小?！瞫emi-continuousculture〕度恒定或培育液總體積不變。半連續(xù)培育特點：細胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平，培育過程可連續(xù)到很長時間?？蛇M展屢次收獲。常用培育基的配置f/2Mediumf/2Medium(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)950mL過濾海水中參加以下物質(zhì)：QuantityCompoundStockSolutionMolarConcentrationinFinalMedium1mLNaNO375g/LdH2O8.83x10-4M1mLNaH2PO4·H2O5g/LdH2O3.63x10-5M1mL*Na2SiO3·9H2O*30g/LdH2O*1.07x10-4M*1mLf/2tracemetal(seerecipebelow)-solution0.5mLf/2vitamin(seerecipebelow)-solution1L，高壓滅菌。元素。f/2TraceMetalSolution(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)950mL蒸餾水中參加以下物質(zhì):QuantityQuantityCompoundStockSolutionMolarConcentration3.15gFeCl3·6H2O-1x10-5M4.36gNa2EDTA·2H2O-1x10-5M1mLCuSO4·5H2O9.8g/LdH2O4x10-8M1mLNa2MoO4·2H2O6.3g/LdH2O3x10-8M1mLZnSO4·7H2O22.0g/LdH2O8x10-8M1mLCoCl2·6H2O10.0g/LdH2O5x10-8M1mLMnCl2·4H2O180.0g/LdH2O9x10-7MinFinalMedium1L，高壓滅菌。inFinalMediumf/2VitaminSolution(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)950mL蒸餾水中參加以下物質(zhì)：QuantityCompoundStockSolutionMolarConcentrationinFinalMedium1mLVitaminB121.0g/LdH2O1x10-10M10mLBiotin0.1g/LdH2O2x10-9M200mgThiamine·HCl-3x10-7M(cyanocobalamin)1L，4℃保存。(cyanocobalamin)留意：由于維生素B12和生物素是以結(jié)晶形式存在，因此在配制母液的時候，B120.89mLdH2O，1mg9.6mLdH2O。KMediumKMedium950mL過濾海水中參加以下物質(zhì)：QuantityQuantityCompoundStockSolution1mL1mL1mL1mL*1mL1mL1mL0.5mLNaNO3NH4Clbeta-glycerophosphateNa2SiO3·9H2O*H2SeO3Tris-base(pH7.2)75g/LdH2O2.68g/LdH2O2.16g/LdH2O30g/LdH2O*1.29mg/LdH2O121.1g/LdH2OKtracemetalsolution (seerecipebelow)f/2vitaminsolution(seerecipebelow)MolarConcentrationinFinalMedium8.83x10-4M3.63x10-5M1x10-5M1.07x10-4M*1x10-8M1x10-3M--1L，高壓滅菌。KTraceMetalSolution(Kelleretal.1987)900mL蒸餾水中參加以下物質(zhì):41.6gNa2EDTA·2H2O-1x10-4M3.15gFeCl3·6H2O-1x10-5M1mLNa2MoO4·2H2O6.3g/LdH2O1x10-8M1mLZnSO4·7H2O22.0g/LdH2O1x10-9M1mLCoCl2·6H2O10.0g/LdH2O1x10-9M1mLMnCl2·4H2O180.0g/LdH2O1x10-8M1mLCuSO4·5H2O9.8g/LdH2O1x10-8MQuantityCompoundStockQuantityCompoundStockSolution MolarConcentrationinFinalMediumf/2VitaminSolution(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)950mL蒸餾水中參加以下物質(zhì)：QuantityCompoundStockSolutionMolarFinalMedium1mLVitaminB121g/LdH2O1x10-10M10mLBiotin0.1g/LdH2O1x10-9M200mgThiamine·HCl-1x10-7M(cyanocobalamin)1L,過濾消毒到塑料瓶中，4℃保存。(cyanocobalamin)留意：由于維生素B12和生物素是以結(jié)晶形式存在，因此在配制母液的時候，dH2O，1mg9.6mLdH2O。三培訓(xùn)總結(jié)性意見。時間：開學(xué)其次周最終一天葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)〔chlorophyllfluorescencedynamics〕技術(shù)被稱為爭論植物光合氣體交換指標相比，葉綠素?zé)晒鈪?shù)更具有反映“內(nèi)在性”的特點。斷植物體內(nèi)光合機構(gòu)運轉(zhuǎn)狀況、分析植物對逆境響應(yīng)機理的重要方法?！驳湍軕B(tài)〕躍遷到激發(fā)態(tài)〔高能態(tài)〕。激發(fā)3〔光化學(xué)反響〕、發(fā)出熒光和以熱的形式耗散掉。依據(jù)能量守恒定律，三者有如下關(guān)系：+光化學(xué)+熱=1PSII的全部反響中心處于完全開放狀態(tài)〔qp=1〕并且全部的非光化學(xué)過程處于最小時〔qn=0〕時的熒光產(chǎn)量。Fm：最大熒光，是在暗適應(yīng)狀態(tài)下當(dāng)PSII〔qp=0〕并且全部的非光化學(xué)過程處于最小時〔qn=0〕時的熒光產(chǎn)量。Fm’在光適應(yīng)狀態(tài)下當(dāng)PSII的全部反響中心處于關(guān)閉狀態(tài)〔qp=0〕并且全部的非光化學(xué)過程處于最優(yōu)時〔qn>0〕時的熒光產(chǎn)量。Fo’在光適應(yīng)狀態(tài)下當(dāng)PSII的全部反響中心處于開放狀態(tài)〔qp=1〕并且全部的非光化學(xué)過程處于最優(yōu)時〔qn>0〕時的熒光產(chǎn)量。Fv/Fm是PSII的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，又叫原初光化學(xué)的最大產(chǎn)量、PSII光化學(xué)反響的潛在產(chǎn)量、PSIIPSII反響中心均處于開放狀態(tài)時的量子產(chǎn)量。當(dāng)藻類或植物受到脅迫時，F(xiàn)v/Fm顯著下降。因此，F(xiàn)v/Fm是爭論光抑制或各種環(huán)境脅迫對光合作用影響的重要指標。Fv‘/Fm’是PSII光化學(xué)的有效量子產(chǎn)量，代表激發(fā)能被開放的反響中心捕獲的PSII的光化學(xué)被限制的程度。由Fv’/FmFv/Fm滅系數(shù)q〔0≤q≤1〕來表示。葉綠素?zé)晒獯銣缫话惴譃楣饣瘜W(xué)淬滅〔qn〕和非〔qnNPQ〕Xe-PAM操作步驟：在電腦上雙擊Wincont軟件進入操作界面；將樣品參加樣品池，放入樣品槽，依據(jù) Ft值〔300-500〕設(shè)置取出樣品池〔或樣品池中參加參比液，如培育基濾液等〕點擊Auto-zero，試驗過程中無論改動什么參數(shù)，測量前都需自動調(diào)零，依據(jù)需要在設(shè)置窗內(nèi)設(shè)置相應(yīng)參數(shù)〔可以保存以便下次使用；3.暗適應(yīng)樣品要想獲得Fv/Fm，需要點擊界面右側(cè)參數(shù)區(qū)Fm按鈕，然后點擊SAT-Pulse按鈕獲得相應(yīng)Yield值；4.同樣在Lightcurve，Inducedcurve界面獲得相應(yīng)曲線。GFS-3000F操作步驟：使用前需對分析器進展校準：需聯(lián)機對儀器進展校準，參閱說明書。當(dāng)|dCO2|>2ppm時需對CO2進展校對零點；當(dāng)|dH2O|>200ppm時需對H2O進展零1-23-5個月進展CO2和H2Ospan〔最大值〕連接儀器。連接葉室和主機，連接時留意From和To管的連接。連接進氣管和電源。on〕，然后選擇標準測量頭〔Standardhead〕或熒光附件〔LED-Arry/PAM-Module3055-FL〕。在測量模式〔Measuremode〕下預(yù)熱30～60分鐘。在菜單設(shè)置下進展文件名和參數(shù)的設(shè)定。首先設(shè)定文件名〔Filename〕。然低一些，標準設(shè)定為750。設(shè)定流速之后，可設(shè)定CO2和H2O的濃度。假設(shè)利用環(huán)境大氣，不需掌握CO2濃度，則不必設(shè)定，而且須將CO2吸取管換為空管；掌握CO2濃度需先將CO2吸取管換上，同時安裝好CO2注入系統(tǒng)〔小鋼瓶〕；取消CO2設(shè)定操作：選擇CO2，選OFF即可，未設(shè)定前顯示未CO2off。設(shè)定葉室風(fēng)扇5〔Light通常選擇PARtop，然后按light設(shè)定光強。選擇葉室溫度掌握模式(Tempmode)：>>翻頁,設(shè)定熒光參數(shù)，夾上無熒光的薄片進展調(diào)零Z－offset;夾上暗適應(yīng)后的葉片后調(diào)整測量光強度ML－Ampl及Gain使得瞬時熒光值Ft在200－300之間；其它參數(shù)為默認設(shè)定值即可。不測定初始熒光Fo和Fm時無需設(shè)定。將葉室關(guān)閉嚴實，觀測主機前面的樣品室和參比室的氣流指示器顯示的流量校準氣流直至流量相等〔參考〕。按窗口下部的測量模式ModeMP即選為調(diào)零模式ModeZP，在此模式下進展調(diào)零，約30min，選Windows中的2charts，查看查看dCO2ZP和dH2OZP確實定值是否穩(wěn)定〔均應(yīng)接近直線〕并趨近于零，調(diào)零確保測得的數(shù)據(jù)準確〕按ModeZP選ModeMP，進入測量模式，開頭測定光合；在ModeMP狀態(tài)下，在Windows中選settings，下部常用的幾個操作選擇中將消滅儲存葉室調(diào)零storeZPcuv。測定前需先選擇storeZPcuv進展葉室調(diào)零〔注：尤其是測定的氣此時在不加葉片時，窗口顯示的光合值A(chǔ)/氣孔導(dǎo)度GH2O應(yīng)接近0。設(shè)定樣品編號Object，將葉片夾入葉室中。假設(shè)葉面積可布滿8cm葉室則不需積并依據(jù)公式進展計算。待各參數(shù)如凈光合A，氣孔導(dǎo)度GH2O等相對穩(wěn)定時就可以按開頭儲存Startstoring間間隔Interval選擇。同時測定熒光參數(shù)時可按窗口下方的常用操作中的儲存測量值及最大熒光效率StoreMP+Fv/Fm(需先暗適應(yīng)并保持葉室黑暗)，儲存測量值和量子產(chǎn)額storeMP+Yield.參比室相平。USB〔System〕下選擇文件傳輸Filetransfer,然后選擇從GFS3000中輸出文件transferfilesfromGFS300，之后依據(jù)提示操作即可將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到電腦中。通過操作菜單1〔option1〕下的數(shù)據(jù)治理子菜單〔data-management〕可以刪除儲存卡中的數(shù)據(jù)文件.ZealquestWALZZealquestWALZ氣體交換概述可控的參數(shù):光強PAR(0-2023umol/m2/s)溫度水汽含量(0-100%rH)(0-3000ppm)流速(0-1500umol/s)通風(fēng)速度6HO+6CO22LightCHO+6O61262可計算的參數(shù):蒸騰速率光響應(yīng)曲線氣孔導(dǎo)度胞間CO2濃度植物水分利用效率RH~100%,WiCiTemp.RH100%,WaCa(380ppm)COHO22VentilationFlow葉片在測量葉室內(nèi)