PCR、引物設計及逆轉(zhuǎn)錄PCR

PCR（PolymeraseChainReaction)技術即聚合酶鏈式反應，又稱DNA體外擴增技術。1985年由美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明，榮獲1993年度諾貝爾化學獎。DNA半保留復制的機理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復性的性質(zhì)。PCR的基本原理PCR擴增體系模板（Template）：基因組、質(zhì)粒DNA、cDNA，也可以使細菌、組織樣品等。引物（Primer）：確定擴增目的序列的特異性；確定擴增產(chǎn)物長度。DNA聚合酶（DNAPolymerase）：推動PCR反應進行的機器。擴增效率和保真性。緩沖液（Buffer）：控制體系的pH和離子強度，為DNA聚合酶提供最佳工作環(huán)境。脫氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本組成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。Mg2+、K+、增強劑1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（95℃，30s）。2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補區(qū)結合（45～65℃，30s）。3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應（

72℃，30～60s）。PCR的基本原理高溫變性低溫退火中溫延伸理論：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），如果擴增30循環(huán)，目標DNA可增加230也就是109倍。實際：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實際上進行30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)一般可達106～107。PCR擴增曲線1.早期（E期）:引物在單鏈DNA模板上搜索互補序列，并與特定位點雜交。2.中期（M期）：擴增反應順利進行，產(chǎn)物呈指數(shù)型增長。3.晚期（L期）：平臺期，DNA聚合酶過度損耗或者產(chǎn)物的抑制。PCR擴增條件循環(huán)PCR反應條件94℃5min94℃30s56.2℃30s72℃30s72℃7min4℃∞PC1-P20：模板：基因組DNA；產(chǎn)物：506bp舉個例子PCR體系（10μL）模板：1μL上游引物：0.2μL下游引物：0.2μLEasyTaq酶：0.1μLEasyTaqBuffer：1μLdNTP：0.8μLddH2O：6.7μL30個循環(huán)1.避免PCR試劑的污染2.最適合的反應條件3.設置對照組：①PCR空白對照：在反應體系中剔除反應模板。②PCR陰性對照：即反應體系中用無關的基因片段代替目的模板。③PCR陽性對照：即反應體系中以已知能夠成功進行特異性擴增的模板。PCR的注意事項1.為什么完全沒有PCR擴增產(chǎn)物？①試劑質(zhì)量問題或者加樣時出錯，導致反應體系不完整。②聚合酶失活或反應體系中有聚合酶抑制劑。③PCR儀溫度控制不精確。④模板DNA發(fā)生降解。⑤引物或反應溫度設計不合理⑥靶片段GC含量過高或擴增對象長多常見問題2.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？①反應體系被污染。②引物特異性差。③退火溫度不合適。常見問題3.為什么PCR產(chǎn)物很少？①聚合酶活性過低。②循環(huán)次數(shù)偏低。③模板DNA濃度過低。常見問題4.為什么PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾？①DNA聚合酶過多或酶活性差。②dNTP和Mg2+濃度過高。③退火溫度過低，PCR循環(huán)數(shù)偏多。④模板DNA用量過大或模板DNA不純。⑤引物特異性差、引物間形成二聚體導致非特意擴增。常見問題普通PCR儀溫度梯度PCR儀實時熒光定量PCR儀為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。引物是PCR特異性反應的關鍵，同時也與PCR擴增的效率密切相關。引物設計的最重要的原則：最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。引物設計的目的1、引物應具有足夠的特異性。如果需要從基因組等較復雜的模板中擴增特定的DNA序列，則需要考慮目的DNA序列的保守性，盡量避免所選引物設計區(qū)域序列的非特異性。引物與非特異序列的同源性不超過70%或有連續(xù)8個互補堿基。

NCBIPrimerBLAST

引物設計的基本原則2、避開易形成二級結構的模板序列區(qū)域。

分子內(nèi)互補、發(fā)夾結構、分子間互補。

二級結構會這家引物與模板雜交以及PCR的困難，因此要盡可能避開這種序列區(qū)域。

用有關軟件預測mRNA的穩(wěn)定二級結構。

引物設計的基本原則3、引物長度一般為18-30個堿基之間。引物長度與反應的特異性和解鏈溫度成正相關。過短：擴增特異性下降過長：引物自身形成二級結構，以及引物二聚體。引物設計的基本原則4、G+C含量一般為40%-60%引物的堿基組成也會對引物的解鏈溫度產(chǎn)生影響。G+C含量過低：引物解鏈溫度低，引物易于從模板上解離。G+C含量過高：引物解鏈溫度高，易與非特異性序列雜交，出現(xiàn)非特異性擴增條帶。引物設計的基本原則5、Tm值之差應小于1℃，最適退火溫度在55-60℃。一對引物的Tm值差過大可直接導致PCR擴增效率下降或失敗。對于20bp左右的引物：Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）

一般情況下，PCR的最佳退火溫度比引物Tm值低5℃左右。引物設計的基本原則6、引物中四種堿基最好是隨機分布的避免4個以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重復。特別是引物的3’端不應有連續(xù)3個G或C，否則會使引物在G+C富集序列區(qū)域產(chǎn)生錯配，降低擴增的特異性。引物設計的基本原則7、引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身互補——發(fā)夾結構

引物之間互補——二聚體

引物自身連續(xù)互補堿基不應超過3個，引物之間連續(xù)互補堿基不應超過4個，尤其避免3’端的互補重疊。引物設計的基本原則8、引物的5’端可以修飾，3’端不可以修飾。引物的5’端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大，可以被修飾而不影響擴增的特異性。如：加酶切位點、標記生物素、引入點突變等。

由于延伸是從3’端開始的，所以不能進行任何修飾。引物設計的基本原則9、引物的3’端不可以A結尾。引物3’端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3’端最好選擇T。引物設計的基本原則10、引物3’端要避開密碼子的第3位。如擴增序列位于基因編碼區(qū)域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。引物設計的基本原則1、避免重復堿基，尤其是G。2、引物退火溫度在58-60℃之間。

3、G+C為30-80%。

4、3’端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C。5、引物的產(chǎn)物大小一般在80-250bp之間；80-150bp最為合適（可以延長至300bp）。

Real-TimePCR引物設計原則6、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。7、Real-TimePCR引物的擴增產(chǎn)物應跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，以避免基因組DNA污染影響。

Real-TimePCR引物設計原則PrimerPremier5.0Oligo6Primer3（在線）Primer-BLAST（在線）引物設計常用軟件FileNewDNAsequence粘貼模板序列引物搜索引物位置產(chǎn)物大小引物長度PrimerBLAST由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA）稱作逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR），由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。

逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理逆轉(zhuǎn)錄PCR的反應體系1、模板RNA2、逆轉(zhuǎn)錄酶3、逆轉(zhuǎn)錄引物Thanks！

93-96℃，較高的溫度變性更快更徹底，尤其是對富含G+C的靶序列而言。

退火溫度與時間取決于引物的堿基組成、長度和濃度。退火溫度可以通過計算推斷，通常采用溫度梯度PCR的方法進行摸索。

45.045.546.949.051.453.856.258.660.963.164.565.0MPC1-P20退火溫度摸索

延伸的溫度通常為所以DNA聚合酶的最適工作溫度，一般為72℃；延伸的時間主要取決于目的片段的大小，不同種類的聚合酶的合成效率也不同，因此還與DNA聚合酶的種類有關。EasyTaq：1-2kb/minTransStartTaq:1-2kb/minFastPfu:2-4kb/min循環(huán)數(shù)：

在其他參數(shù)都已優(yōu)化的條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃度。一般情況下30-35個循環(huán)即可。循環(huán)數(shù)太多：會增加非特異擴增產(chǎn)物的數(shù)量和復雜性。循環(huán)數(shù)太少：PCR產(chǎn)量太低。逆轉(zhuǎn)錄引物：

（1）隨機六聚核苷酸引物

僅長6個核苷酸，每個核苷酸位點上隨機加入4中不同的脫氧核苷酸，因此是46中不