植物種質(zhì)資源離體保存

第十二章植物種質(zhì)資源離體保存植物種質(zhì)資源離體保存的概念和意義保持生物多樣性(biodiversity)是一個(gè)國(guó)際性備受重視的問(wèn)題。被喪失，而種質(zhì)資源是植物育種工作的根底，因此，搜集和保存種質(zhì)資源已受到世界各國(guó)的重視。(insituconservation)和非原生境保存(exsituconservation)，后者(試管)保存等。原生境保存和移地保存固然有其明顯的重要性，但要保存大量種質(zhì)，則需消耗巨大的人力、物力和土地，在實(shí)際上很難實(shí)施，而且易受自然災(zāi)難、蟲(chóng)害和病害的侵襲，造成植物存；③承受無(wú)性生殖來(lái)保持其優(yōu)良性狀的植物(如很多果樹(shù))，用種子生殖后代會(huì)發(fā)生變異；④〔依據(jù)枯燥對(duì)種子生命力的12這類種子也不能在低溫下貯藏。生長(zhǎng)在熱帶的藤黃科、山欖科、龍腦香科、番荔枝科、無(wú)患子科、馬錢科等植物都是這類種子〕植物不宜用種子保存或保存難度很大；⑤易遭自然災(zāi)難攻擊而喪失。2060種質(zhì)資源的離體保存(germplasmconservationinvitro)是指對(duì)離體培育的小植株、在超低溫保存中，也常常直接承受植物莖尖或分生組織、胚、花粉等材料作為保存材料。離體種質(zhì)保存有以下優(yōu)點(diǎn)：①所占空間少，節(jié)約大量的人力、物力和土地；②便于種質(zhì)資源的溝通利用；③需要時(shí)，可以用離體培育方法很快大量生殖；④避開(kāi)自然災(zāi)難引起的種質(zhì)丟失。固然，離體種質(zhì)保存也有一些值得留意的缺乏之處：①對(duì)于限制或延緩生長(zhǎng)的處理，需定期轉(zhuǎn)移，連續(xù)繼代培育；②易受微生物污染化和再生力量的逐漸喪失。70年月以來(lái)，人們把冷凍生物學(xué)(cryobiology)和植物離體微繁結(jié)合起來(lái)，進(jìn)展了離體種質(zhì)資源冷凍保存(freezingconservationinvitro)或超低溫保存(cryopreservation善，已經(jīng)或正在建立離體種質(zhì)保存庫(kù)。植物種質(zhì)資源離體保存的方法限制生長(zhǎng)保存限制生長(zhǎng)保存利用限制離體培育物的生長(zhǎng)速度來(lái)保存種質(zhì)的方法慢的速度生長(zhǎng)。這樣，轉(zhuǎn)移繼代的間隔時(shí)間可延長(zhǎng)。但應(yīng)用這些方法細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)和生產(chǎn)性狀的鑒定。低溫保存法低溫保存(lowtemperatureconservation)是限制生長(zhǎng)應(yīng)用最廣l～9℃(10～20℃)下培育，并常常同時(shí)提高培育基的滲透壓。在這種條件下，培育物的生長(zhǎng)受到限制，繼代培育時(shí)間間隔數(shù)個(gè)月至1溫(正常)下培育，即可快速恢復(fù)生長(zhǎng)。高滲透壓保存法2％～410％左右，就可到達(dá)抑制培育物生長(zhǎng)的目的。提高培育基的滲透壓還可承受外加甘露醇、山梨醇等惰性物質(zhì)2％～32％～5％的甘露醇處83％甘露醇，均可高滲透壓。生長(zhǎng)抑制劑(或延緩劑)保存法長(zhǎng)抑制劑—ABARNA制DNA生長(zhǎng)抑制劑。降低氧分壓保存法

)、多效唑等人工合成的植物9壓太低，則會(huì)產(chǎn)生毒害作用?？菰锉４娣ㄋ巧顒?dòng)的基質(zhì)，降低培育物水分，其生命活動(dòng)就能延緩，4～7d)，然后置于加生長(zhǎng)延緩劑或限制蔗糖的條件下保存。在不含蔗糖2恢復(fù)生長(zhǎng)快，適于現(xiàn)代化種質(zhì)庫(kù)的治理。值得一提的是，離體保存植物種質(zhì)時(shí)，不同植物、不同基因型或同一品種的不同材料，所承受的上的保存方法結(jié)合使用，更有助于延長(zhǎng)不同植物的保存年限。超低溫保存植物超低溫種質(zhì)保存的概念2070和Street氮中保存后能恢復(fù)生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致了種質(zhì)資源超低溫保存法的進(jìn)展。法處理后在超低溫(一196℃液氮)條件下進(jìn)展保存的方法。目前，承受莖尖、獼猴桃莖尖、薯蕷莖尖、馬鈴薯莖尖、蘋果根尖、甘薯莖尖等。超低溫保存的根本原理氮中(－196因而排解了遺傳性狀的變異，同時(shí)保存了細(xì)胞的活力和形態(tài)發(fā)生潛能。低溫冰凍過(guò)程中假設(shè)生物細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰細(xì)胞構(gòu)造就會(huì)遭到不行逆的破壞導(dǎo)致細(xì)胞和組織死亡植物材料在超低溫條件下之所以可以長(zhǎng)期保存并能在離開(kāi)保存環(huán)境后正常進(jìn)展細(xì)胞分裂和分化就是在冰凍過(guò)程中避開(kāi)了細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰并且在解凍過(guò)程中防止細(xì)胞內(nèi)水分的次生結(jié)冰而到達(dá)植物材料保存目的但是植物細(xì)胞含水量比動(dòng)物細(xì)胞高在冷凍(freezing)過(guò)程中會(huì)有冰晶形成和過(guò)度脫水，在解凍(thawing)過(guò)程中也會(huì)重形成冰晶和患病溫度沖擊(thermalshock)，保存難度大。假設(shè)直接將保存材料投放到液氮中，細(xì)胞和組織由于細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，引起組織和細(xì)胞死亡。因此，植物種質(zhì)超低溫保存必需實(shí)行如下措施：①選擇細(xì)胞內(nèi)自由水少抗凍力量強(qiáng)的植物材料；②實(shí)行一些預(yù)處理措施，提高植物材料的抗凍力量；③在冷凍過(guò)程中盡量削減冰晶的形成避開(kāi)組織細(xì)胞過(guò)度脫水；④在解凍過(guò)程中避開(kāi)冰晶的重形成以及溫度沖擊導(dǎo)致的滲透沖擊 (osmoticstress)等。超低溫保存的根本程序料(培育物)的選取、材料的預(yù)處理、冷凍處理、冷凍貯存、解凍、再12－1)。假設(shè)操作不當(dāng)，保存就會(huì)失敗，因此，必需把握好整個(gè)技術(shù)程序的各個(gè)環(huán)節(jié)。12－1植物離體材料超低溫保存的根本程序植物材料(培育物)選取已經(jīng)爭(zhēng)論或應(yīng)用過(guò)的植物材料或培育物主要有三類：①愈傷組幼齡植株。凍性強(qiáng)的離體培育物作為保存材料是超低溫保存離體種質(zhì)成功的關(guān)遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象，在現(xiàn)有的技術(shù)條件下，尚無(wú)有效的掌握措施，并且用莖尖、腋芽原基、胚、幼齡植株等有組織構(gòu)造的離體材料，由于其遺傳穩(wěn)定性好，易于再生，且細(xì)胞體積小、液泡小，含水量較低，細(xì)保存材料。生長(zhǎng)。幼小的球形胚比老齡胚存活率高。材料預(yù)處理的比例。由于分裂細(xì)胞小，胞內(nèi)自由水含量少，在冷凍過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)不易有大冰晶形成，細(xì)胞不易受害。的離體培育物進(jìn)展低溫預(yù)處理和低溫預(yù)處理是將離。冷凍前或冷凍期間，由于細(xì)胞脫水，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)可溶物的濃度在(DMSO)、脯氨酸、糖類、聚乙二醇、乙酰胺、糖醇和福美氧化硫等。對(duì)植物來(lái)說(shuō)，DMSO是最好的防5％～8％。解凍后的存活率。愈傷組織來(lái)說(shuō)，加速繼代可提高小細(xì)胞的頻率。然后，把莖尖或細(xì)胞0℃的條件下培育數(shù)日。冷凍處理(slowcoolingmethod)(fastcoolingmethod)、預(yù)凍法(pre-freezingmethod)和干凍法(dry-freezingmethod)。慢凍法個(gè)低溫的過(guò)程。慢凍法是分步進(jìn)展的，其根本操作為：先以1～5℃-30～-40℃或-1001h196℃)保存。形成冰晶，即使是體積較大、含水量較高的植物材料，也可以得到較浮培育物尤其適用，但要求嚴(yán)格掌握降溫速度?？靸龇靸龇ㄊ菍?duì)預(yù)處理過(guò)的材料以100～1000℃／min196℃成的冰晶體沒(méi)到達(dá)使細(xì)胞致死的程度。一些植物的離體種質(zhì)，如草莓、馬鈴薯、奢蕷、蘋果根尖等。預(yù)凍法預(yù)凍法是將植物組織放人液氮前，先經(jīng)幾個(gè)階段的預(yù)凍，如-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-70℃，然后再轉(zhuǎn)入-196℃液氮中。此法已較少使用。干凍法干凍法是把樣品放人烘箱內(nèi)或真空中，使其脫水(dehydration)，提高其抗凍性，然后再放人液氮中保存的方法。不活率。冷凍貯存在冷凍貯存期間，由于液氮在不斷揮發(fā)，所以，必需定時(shí)補(bǔ)充液-196℃下的材料要長(zhǎng)期貯40002ml20～25L隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力會(huì)有肯定的下降。因此，這項(xiàng)技術(shù)仍需改進(jìn)。解凍。解凍的速度是解凍技術(shù)的關(guān)鍵，解凍可分為快速解凍(fastthawing)和慢速解凍(slowthawing)兩種方法。解凍的速度慢，細(xì)胞內(nèi)簡(jiǎn)潔發(fā)生再結(jié)晶，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；速度快，再結(jié)晶的過(guò)程來(lái)不及發(fā)生，細(xì)胞存活率高。快速解凍法快速解凍法就是把冷凍的材料取出后，快速放入35～40℃(該溫度下解凍速度一般為500～700℃／min)溫水浴。慢速解凍法02～3℃的低溫下漸漸溶化。少數(shù)超低溫保存的材料只有承受慢速解凍才能存活，料死亡。因此，解凍速度的選擇應(yīng)參考冷凍速度。2.2.3.5進(jìn)展培育，應(yīng)將融解后的樣品直接置于瓊脂培育基上培育，l～2胞在冷凍過(guò)程中滲漏出來(lái)的某些重要物質(zhì)被洗掉了的原因。當(dāng)重培育曾在-196℃GA3

以后，冷GA

，莖尖則3GA3

就能直接長(zhǎng)成小植株。此外，參加活性炭可以顯著提高經(jīng)過(guò)冷凍和解凍的胡蘿卜試管苗的總的存活率。100％，因而需要測(cè)定培育物活力，以剔除沒(méi)有生活力的培育物。測(cè)定方法有FDA〔熒光素雙醋酸酯〕染色法、TTC〔氯化三苯基四氮唑〕復(fù)原法、EvansBlue20％～80％之間。(2℃)熬煉過(guò)的金冠和富士蘋果的莖尖，超低溫保存后成活率可達(dá)80Diosc