細(xì)胞產(chǎn)物分析技術(shù)-吸光光度法-2012

吸光光度法基本原理儀器簡(jiǎn)介靈敏度與準(zhǔn)確度分析條件的選擇應(yīng)用簡(jiǎn)介基本原理吸光光度法是基于被測(cè)物質(zhì)的分子對(duì)光具有選擇吸收的特性而建立的分析方法。光的電磁波性質(zhì)射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光基本原理光作用于物質(zhì)時(shí)，物質(zhì)吸收了可見光，而顯示出特征的顏色，這一過程與物質(zhì)的性質(zhì)及光的性質(zhì)有關(guān)。物質(zhì)對(duì)光的吸收物質(zhì)對(duì)光的吸收滿足Plank條件hS2S1S0S3E2E0E1E3hhh基本原理吸收光譜AbsorptionSpectrum純電子能態(tài)間躍遷S2S1S0S3hE2E0E1E3S2S1S0hAhhh分子內(nèi)電子躍遷帶狀光譜銳線光譜A基本原理物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收物質(zhì)的電子結(jié)構(gòu)不同，所能吸收光的波長(zhǎng)也不同，這就構(gòu)成了物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收基礎(chǔ)。例：A物質(zhì)B物質(zhì)同理，得：1ev=1.610-19J.基本原理透光率（透射比）Transmittance透光率定義：T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光It基本原理T：透光率A：吸光度Lambert–BeerLaw基本原理b：吸光液層的厚度，光程，cmc：吸光物質(zhì)的濃度，g/L,mol/LK：比例常數(shù)K

K

ac：mol/Lc：g/L吸收定律與吸收光譜的關(guān)系A(chǔ)C吸光定律A或吸收光譜AC

max基本原理吸光的加合性多組分體系中，如果各組分之間無相互作用，其吸光度具有加合性，即對(duì)吸收定律偏離AC主要原因非單色光吸光質(zhì)點(diǎn)的相互作用基本原理吸光分析法目視比色法標(biāo)準(zhǔn)系列未知樣品特點(diǎn)利用自然光比較吸收光的互補(bǔ)色光準(zhǔn)確度低（半定量）不可分辨多組分方法簡(jiǎn)便，靈敏度高光電比色法UltravioletVisualSpectroscopy0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示I0It參比樣品入射光I0透射光It儀器簡(jiǎn)介紫外-可見分光光度計(jì)組件光源單色器樣品池檢測(cè)器信號(hào)輸出氫燈，氘燈，185~350nm；鹵鎢燈，250~2000nm.基本要求：光源強(qiáng)，能量分布均勻，穩(wěn)定作用：將復(fù)合光色散成單色光棱鏡光柵玻璃，350~2500nm,石英，185~4500nm平面透射光柵，反射光柵玻璃，光學(xué)玻璃，石英作用：將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并放大光電管，光電倍增管，光電二極管，光導(dǎo)攝像管（多道分析器）表頭、記錄儀、屏幕、數(shù)字顯示儀器簡(jiǎn)介單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示儀器簡(jiǎn)介單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)比值光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示光束分裂器儀器簡(jiǎn)介靈敏度吸光光度法是一種適合于微量組分測(cè)定的儀器分析法，檢測(cè)限大多可達(dá)10-3~10-4g/L或~g/mL數(shù)量級(jí)。準(zhǔn)確度能滿足微量組分測(cè)定的要求。一般相對(duì)誤差2~5%。例如，石灰石中微量鐵，含量為0.067%，相對(duì)誤差以5%計(jì)算，結(jié)果為0.064~0.070%，絕對(duì)誤差為0.003%靈敏度與準(zhǔn)確度對(duì)同一種待測(cè)物質(zhì)，不同的方法具有不同的，表明具有不同的靈敏度。例，分光光度法測(cè)銅銅試劑法測(cè)Cu426=1.28104L．mol-1．cm-1雙硫腙法測(cè)Cu495=1.58105L．mol-1．cm-1一般情況<104

~104~105

>105低靈敏度中等靈敏度高靈敏度靈敏度不同的本質(zhì)原因是什么？靈敏度與準(zhǔn)確度根據(jù)誤差傳遞公式，推導(dǎo)出濃度測(cè)量的相對(duì)偏差為T=0.368=36.8%A=0.434為了減少測(cè)量誤差，控制溶液的吸光度A=0.15~1T=70~10%誤差公式推導(dǎo)0.368靈敏度與準(zhǔn)確度測(cè)定波長(zhǎng)的選擇無干擾，選擇max有干擾AA待測(cè)溶液吸光度的選擇控制A=0.15~1T=70%~10%方法選擇C選擇b1、非單色光影響小2、靈敏度高靈敏度與準(zhǔn)確度參比液的選擇原則：扣除非待測(cè)組分的吸收以顯色反應(yīng)為例進(jìn)行討論M+R=M-Rmax試液 顯色劑溶劑吸光物質(zhì)參比液組成無吸收無吸收光學(xué)透明溶劑基質(zhì)吸收無吸收吸收不加顯色劑的試液無吸收吸收吸收顯色劑基質(zhì)吸收吸收吸收吸收顯色劑+試液+待測(cè)組分的掩蔽劑若欲測(cè)M-R的吸收maxA（樣）=A（待測(cè)吸光物質(zhì)）+A（干擾）+A（池）A（參比）=A（干擾）+A（池）靈敏度與準(zhǔn)確度分析條件的選擇顯色反應(yīng)有機(jī)物質(zhì)官能團(tuán)強(qiáng)吸收直接測(cè)定UV-VIS官能團(tuán)弱吸收衍生化反應(yīng)UV-VIS顯色反應(yīng)無機(jī)物質(zhì)通常通過顯色反應(yīng)生成吸光系數(shù)大的有色物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，以提高靈敏度332+桔紅色max鄰二氮菲酸度的影響副反應(yīng)M+nR=MRnOH-H+存在型體的變化RH=R-+H+

12生成不同配比的絡(luò)合物例，磺基水楊酸–Fe3+pH=2~3FeR紫紅色pH=4~7FeR2橙色pH=8~10FeR3黃色分析條件的選擇酸度的選擇可得適宜pH范圍實(shí)際工作中，作A~pH曲線，尋找適宜pH范圍。ApHM+nR=MRnOH-H+分析條件的選擇顯色劑的用量M+nR=MRn實(shí)際工作中，作A~CR曲線，尋找適宜CR范圍。ACR分析條件的選擇應(yīng)用簡(jiǎn)介微量組分的測(cè)定單組分的測(cè)定多組分的測(cè)定介紹一種解聯(lián)立方程法AXY12根據(jù)加合性原則解聯(lián)立方程，可求得Cx,Cy為物質(zhì)的特征參數(shù)，可通過配制標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)測(cè)定兩組分的濃度的實(shí)驗(yàn)方案ACs(x)純物質(zhì)或共存物質(zhì)不干擾單組分的測(cè)定微量鐵的測(cè)定氨基酸的測(cè)定鄰二氮菲法茚三酮法蛋白質(zhì)的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法總磷的測(cè)定磷鉬藍(lán)法海水中營(yíng)養(yǎng)鹽的測(cè)定返回應(yīng)用簡(jiǎn)介示差光度法常規(guī)法以空白溶劑為參比示差法以濃度