第四章 目的基因的制備、連接、導入與基因文庫的構(gòu)建

第四章目的基因的制備、連接、導入、篩選與基因文庫的構(gòu)建

目的基因與克隆載體的體外重組

重組載體引入受體細胞目的基因制備重組子的篩選基因文庫的構(gòu)建基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達調(diào)控機制和生物學功能，或建立高效表達系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌（細胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克隆；另一類是利用PCR擴增技術(shù)甚至化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。第一節(jié)目的基因的制備目的基因設(shè)計需要考慮的問題基因的長度及引物的設(shè)計限制性酶切位點的去處與添加去除基因內(nèi)部正反向重復序列使用宿主偏愛的密碼子添加起始與終止密碼子添加表達所需特殊序列，如信號肽、調(diào)整閱讀框、核糖體結(jié)合位點等PCR法

cDNA法鳥槍法

化學合成法目的基因制備方法1化學合成法化學合成法的基本戰(zhàn)略化學合成的單元操作DNA化學合成的用途1.1.1全基因合成化學合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：小片段粘接法：混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

1.1化學合成法的基本戰(zhàn)略補釘延長法：混合退火根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合大片段酶促法：混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%1.1.2探針等寡聚核苷酸合成在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設(shè)計時必須考慮下列問題：生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針探針應(yīng)具有足夠的長度，通常在17-20個核苷酸之間探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補區(qū)域探針等寡聚核苷酸合成某段連續(xù)的氨基酸序列CysMetAsp

GluMetLysArg

AsnIle所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATACTGATGGGTTCCGACGGCGTCGC設(shè)計的簡并探針序列TGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGAAG此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設(shè)計expressedsequencetag1.2化學合成的單元操作化學合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng)，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。從反應(yīng)機理上來講，DNA化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計的三氯乙酸化學合成的單元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活縮合氧化脫取代基玻璃珠連接臂碘液四唑亞磷酰胺亞磷酰胺四唑活性中間體脫保護基(一般對A、C堿基采用苯甲?；Ｗo；G堿基用異丁?；Ｗo；T堿基不必保護；亞磷酸用腈乙基保護)1.3DNA化學合成的用途合成天然基因修飾改造基因

設(shè)計新型基因

制備探針、引物、接頭

如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等

基因等2PCR法

PCR（PolymeraseChainReaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應(yīng)必需的雙引物PCR法定向擴增目的基因的基本原理5‘5‘目的基因5‘變性加熱5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加熱變性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加熱變性引物退火底物聚合123由TaqDNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為TaqDNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆

PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR擴增產(chǎn)物T載體T7lacZMCSoriApr3cDNA法cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略cDNA法分離目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mDNAcDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPscDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導法：獲得的雙鏈cDNA

5’端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1cDNA第二鏈的合成

DNApol

dNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA

5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’S1AAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA

5’5’TTTTTTTTTTTTTT

3’3’T4-DNAligasecDNA第二鏈的合成

dCTPTdT引導合成法：獲得的雙鏈cDNA

能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’3‘

HO5‘ppp’5G

G

AAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGG3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’NaOH退火KlenowdNTPscDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略雙鏈cDNA的克隆

雙鏈平頭的cDNA通常可以使用下列三種方法克隆入載體中：

平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收

平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收

cDNA法分離目的基因的基本程序完備分離程序

提取細胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子篩選時，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等

cDNA法分離目的基因的基本程序特異分離程序

提取細胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進行克隆特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等

cDNA法分離目的基因的基本程序差異分離程序

利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因

例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進而研究其生物學功能

差異分離程序

多瘤病毒感染的FR3T3細胞正常的FR3T3細胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈cDNA單鏈cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二鏈克隆提取mRNA共價交聯(lián)上柱原位雜交病毒誘導表達的基因cDNA克隆cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)

細菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因

4鳥槍法鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆的基本戰(zhàn)略隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離

鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷

超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端

全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整與載體連接

如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞轉(zhuǎn)化受體細胞

篩選含有目的基因的目的重組子

菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）

鳥槍法操作的改進使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率

使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA

鳥槍法操作的改進例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當于1.6-2.0

kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進行拼接在連接前將DNA片段進行分級分離

2.0kb1.6kb1.8kb鳥槍法操作的改進凍融法吸附法：膠回收試劑盒低融點膠回收法電洗脫法法凝膠DNA片段回收技術(shù)

鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)第二節(jié)目的基因與克隆載體的體外重組粘性末端的連接（定向克隆法）平末端的連接同聚物加尾法加人工接頭連接法加DNA銜接物連接法PCR產(chǎn)物的連接一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起單酶切、雙酶切粘性末端連接法定向克隆法優(yōu)點:(1)載體及目的基因末端不互補，不會自身環(huán)化；(2)定向插入目的基因。注意事項：(1)載體及目的基因需要電泳純化；(2)避免酶切不完全。（一）直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’二、平末端（bluntend）的連接（1）同聚加尾法（二）人工加尾形成“粘性末端”DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補的核苷酸。②加尾－堿基互補同聚物加尾法末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶④缺點：③優(yōu)點：能把任何片段連接起來操作繁瑣；外源片段難以回收；同聚物尾巴影響外源基因表達。非酶切位點（2）銜接物（linker）連接Linker：用化學合成法合成的一段10-12bp的，具有一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別位點的平末端雙鏈寡核苷酸GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：（二）人工加尾形成“粘性末端”（1）多核苷酸激酶處理（2）T4連接酶連接（3）限制性內(nèi)切酶消化（4）目的片段與載體連接加人工接頭連接法優(yōu)點：兼具同聚物加尾法和粘性末端連接法的優(yōu)點；缺點：待克隆外源基因不能含有人工接頭相同的酶切位點。人工接頭DNA片段（二）人工加尾形成“粘性末端”（3）DNA接頭（adapter）連接法①

adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序列）Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’人工合成的寡鏈核苷酸加DNA銜接物連接法人工合成的寡鏈核苷酸含有粘性末端，因此需要防止其自身環(huán)化，通過在其粘性的5’末端進行脫磷酸修飾，使之彼此間無法連接。多核苷酸激酶接頭與接頭以粘末端連接，影響與DNA片段的連接②優(yōu)點：連上后就能用。③缺點：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。④防止自我連接5‘p-GATCCCGG-

GGCC-CCGGGGCCCTAG-p5’Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-3’

GGCC-p5’BamHIadapterP--P

5’HO-GATCCCGG-GGCC

CCGG-GGCCCTAG-OH5’5’HO-GATCCCGG3’GGCC-OH5’nick缺口nick缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接T4多核苷酸激酶處理使5’磷酸化三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計酶切位點符合載體的多克隆位點；（1）設(shè)計原則（2）帶酶切位點的引物的結(jié)構(gòu)3’端15～20bp與模板互補；5’端內(nèi)切酶識別序列＋保護堿基避免與所擴增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點重復。三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計酶切位點請設(shè)計一對PCR引物，在N端和C端分別加一個EcoRI（GAATTC，保護堿基GCA）和BamHI酶切位點（GGATCC，保護堿基CGC），另外，各含有18個同該基因同源的核苷酸，能夠用于擴增該基因的編碼序列。寫出P1和P2的引物序列。帶酶切位點的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’CCTAGGCGC

PCR產(chǎn)物-5’3’-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoRI位點BamHI位點AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’CCTAG

PCR產(chǎn)物-5’3’-GGEcoRIBamHI兩頭各有一個粘性末端！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA三、PCR產(chǎn)物的連接2.與T載體直接連接3、Gateway載體構(gòu)建系統(tǒng)噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)；

高效的實現(xiàn)DNA序列在多種載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移。入門克隆改造過的各種表達載體第三節(jié)重組載體引入受體細胞物理法：基因槍法、電擊法、超聲法、顯微注射法、激光微束法化學法：PEG法，脂質(zhì)包埋法、磷酸鈣、DEAE-葡萄糖等介導的DNA轉(zhuǎn)染法載體介導法：質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化介導、農(nóng)桿菌介導、病毒介導法一、重組DNA導入大腸桿菌（一）轉(zhuǎn)化（transformation）大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（三）轉(zhuǎn)染（transfection）受體菌直接捕獲噬菌體DNA的過程。（二）轉(zhuǎn)導（transduction）借助噬菌體把外源DNA導入細菌的過程。（一）轉(zhuǎn)化（transformation）（1）熱激法（heatshock）（2）電轉(zhuǎn)化法（electronporation）（3）PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（4）接合轉(zhuǎn)化制備感受態(tài)細胞增加受體菌細胞膜的通透性（1）熱激法目的感受態(tài)細胞：處于能吸收外源DNA分子的生理狀態(tài)的細胞制備感受態(tài)細胞1、將處于對數(shù)生長期的細菌置于0℃的CaCl2低滲溶液中，細胞膨脹成球形，處于感受態(tài)；2、將感受態(tài)細胞與DNA混合，Ca2+與DNA結(jié)合形成抗DNase的羥基-磷酸鈣復合物，粘附于細胞表面；3、經(jīng)42℃短時間熱激處理，細胞吸收DNA復合物；4、在培養(yǎng)基中生長數(shù)小時之后，球形細胞復原并增殖。CaCl2法制備感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化DNA的原理

10ng載體DNA100L感受態(tài)細胞冰浴30min42℃1~2min加入1mLLB培養(yǎng)基（Amp-）37℃振蕩培養(yǎng)1h10-100L轉(zhuǎn)化液涂Amp＋平板吸附DNA攝入DNA操作步驟：（p140）轉(zhuǎn)化率：106-108/gDNA（2）電轉(zhuǎn)化法

原理：在高壓脈沖下，細菌細胞表面形成暫時性微孔，重組DNA通過微孔進入細胞后，脈沖結(jié)束，細胞恢復原狀。實驗簡單，不需要制備特殊的感受態(tài)細胞“感受態(tài)”：清洗處理，在低溫下使細胞處于無離子區(qū)且有甘油或蔗糖等保護劑的懸液中，保證電擊過程中細胞不被擊穿而死亡。轉(zhuǎn)化率：109~1010/gDNA（二）轉(zhuǎn)導由噬菌體和細胞病毒介導的遺傳信息的轉(zhuǎn)移過程（三）轉(zhuǎn)染噬菌體DNA不經(jīng)過蛋白包裝成病毒顆粒，直接被感受態(tài)細胞捕獲的過程。與轉(zhuǎn)化無本質(zhì)區(qū)別體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，形成噬菌斑。每gDNA能形成106個噬菌斑

現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動物細胞的過程也稱轉(zhuǎn)染

體外包裝過程病毒載體介導法:

Fosmid載體的連接、重組與導入二、重組DNA導入真核細胞（一）導入酵母細胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化堿金屬離子介導的完整細胞轉(zhuǎn)化PEG1000轉(zhuǎn)化法電擊法（二）導入植物細胞（三）導入動物細胞1.利用原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2

PEG插入外源基因的載體共轉(zhuǎn)化：將兩個以上的基因同時導入感受態(tài)細胞的方法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化細胞達原生質(zhì)體總數(shù)的1%~2%，轉(zhuǎn)化率受再生率影響共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%~33%

酵母0.1mol/LLiCl處理感受態(tài)2.堿金屬離子介導的完整細胞轉(zhuǎn)化插入外源基因的載體40%PEG4000熱激涂布選擇性平板，篩選轉(zhuǎn)化子

吸收線性DNA能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍轉(zhuǎn)化率：103個

/g

DNA；共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少4.電擊轉(zhuǎn)化（1）適于原生質(zhì)體和完整細胞（2）轉(zhuǎn)化率高，105個/gDNA（3）單鏈轉(zhuǎn)化率高于雙鏈3.PEG1000轉(zhuǎn)化PEG處理酵母細胞，可獲得類感受態(tài)，用于轉(zhuǎn)化PEG法將外源基因融合進入宿主電擊法將外源基因?qū)胨拗鞫?、重組DNA導入真核細胞（一）導入酵母細胞載體介導的轉(zhuǎn)化（農(nóng)桿菌介導）DNA直接導入（基因搶法、電擊法等）種質(zhì)系統(tǒng)法（花粉管通道法等）（二）導入植物細胞（三）導入動物細胞（二）導入植物細胞1.農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將目的基因插入到載體的T-DNA區(qū)，形成重組DNA（二）導入植物細胞1.農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將重組DNA轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌（二）導入植物細胞1.農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法通過農(nóng)桿菌侵染植物外植體（二）導入植物細胞1.農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將含有外源目的基因的T-DNA整合到植物細胞基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因植株在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng)2天葉盤法的具體操作T-DNA的染色體整合機制農(nóng)桿菌介導法共整合轉(zhuǎn)化程序二元整合轉(zhuǎn)化程序又稱生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。DNA1.2m鎢彈頭吸附金屬微粒加速，進入受體細胞基因槍裝入2.基因槍法（genegun）外植體制備轟擊外植體培養(yǎng)及選擇具體操作1.DNA微彈的制備2.外植體的制備3.DNA微彈轟擊4.外植體的培養(yǎng)植物細胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液電擊處理愈傷組織幼苗分化3.電擊法（電穿孔法）選擇培養(yǎng)二、重組DNA導入真核細胞（一）導入酵母細胞1.磷酸鈣沉淀法2.脂質(zhì)體介導法3.顯微注射法4.DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法（二）導入植物細胞（三）導入動物細胞原理：（三）導入動物細胞1.磷酸鈣沉淀法通過磷酸鈣-DNA共沉淀，將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎罁?jù)不同的細胞類型，平皿上最多能有10%的細胞能吸收DNA沉淀。操作簡便，成本低廉、可大批量轉(zhuǎn)染、對細胞毒性小、效果穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)染效率低。2.脂質(zhì)體介導法脂質(zhì)體包埋DNA，通過細胞膜進入細胞。應(yīng)用玻璃顯微注射器，直接把外源DNA注射到宿主細胞核里，使其整合到染色體上。3.顯微注射法1）外源基因制備：線性化的質(zhì)?；蚰康钠?）收集受精卵：受孕后幾小時內(nèi)3）顯微注射：將外源基因注入受精卵的雄原核4）受精卵移植二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖為多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細胞攝入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法葡聚糖葡聚糖DEAE-dextran外源DNA細胞混合DEAE-dextran對細胞有毒，常采用低濃度長時間處理吸附到細胞表面后被細胞吞入，部分DNA可以進入到細胞核里。4.DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)化率及影響因素轉(zhuǎn)化率（cfu

/μgDNA）：每微克重組DNA轉(zhuǎn)化后，接納DNA分子的受體細胞的個數(shù)，即陽性克隆數(shù)。（一）轉(zhuǎn)化率的計算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/DNA的加入量轉(zhuǎn)化率及影響因素例：取1μl（0.1ng/μl）完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100μl的感受態(tài)細胞。向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入900μl培養(yǎng)液，讓細菌恢復一小段時間，取100μl鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落，轉(zhuǎn)化率為多少？轉(zhuǎn)化率＝1000

/0.01ngDNA=108

cfu/μg

例：某一DNA重組實驗的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107cfu/mg天然載體，經(jīng)酶切和連接處理后的重組載體轉(zhuǎn)化率比天然載體約低100倍，欲獲得104個重組克隆，需要投入多少重組載體DNA進行重組實驗？104＝107

cfu/mg×10-2×a×20%重組載體a=0.5mg普通的亞克隆實驗：1×106

cfu/μgDNA；更復雜的亞克隆：1×107cfu/μgDNA，如有限量的DNA的轉(zhuǎn)化，T-A克??；構(gòu)建文庫：>1×108

cfu/μgDNA。1）載體DNA類型、大?。恢亟MDNA濃度、純度2）受體細胞3）轉(zhuǎn)化方法：同一轉(zhuǎn)化方法技術(shù)參數(shù)影響轉(zhuǎn)化率（二）轉(zhuǎn)化率的影響因素一、載體表型選擇法二、根據(jù)插入基因的表型選擇三、DNA電泳檢測法四、PCR檢測法五、核酸雜交檢測法六、免疫化學檢測法七、DNA序列分析第四節(jié)重組子的篩選與鑒定重組子的篩選直接篩選間接篩選DNA鑒定載體篩選翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物其他方法（報告基因等）NorthernblottingWesternblotting標記補救篩選質(zhì)粒載體的α互補篩選（藍白色斑篩選法）噬菌體包裝容量的正性篩選質(zhì)粒載體的抗性標記篩選同源性分析鑒定（原位雜交）DNA序列分析重組子酶切圖譜鑒定重組子大小鑒定1.抗藥性標記及其插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒上有兩個抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位點BamHI和SalI;Ampr上有插入位點PstI。一、載體表型選擇法2.-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍+深藍色-半乳糖苷酶使X-gal分解成藍色產(chǎn)物。利用插入的外源基因的表達產(chǎn)物特性進行直接選擇。轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。二、根據(jù)插入基因的表型選擇1.彌補缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長例：抗生素抗性抗性基因載體外源DNA連接轉(zhuǎn)化受體菌抗生素培養(yǎng)基平板含抗生素抗性基因的克隆才能生長使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。2.增加新性狀有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。1.直接電泳檢測法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。三、

DNA電泳檢測法Marker載體重組克隆2.酶切電泳篩選法根據(jù)外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選一兩種內(nèi)切酶切割，電泳后比較電泳結(jié)果：DNA帶數(shù)和長度。一般用重組時的內(nèi)切酶將外源DNA切出單雙四、PCR擴增檢測法應(yīng)用PCR反應(yīng)擴增出預期DNA片斷（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）；（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR；（3）凝膠電泳；（4）是否有條帶產(chǎn)生，條帶大小是否正確。五、核酸雜交檢測法1.Southernblotting從宿主細胞中提取DNA，用探針雜交。2.Northernblotting主要檢測插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細胞中提取RNA，用探針雜交。3.Westernblotting在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。①（SDS）點樣電泳方向膜膠蛋白②轉(zhuǎn)膜③雜交待測蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗④檢測3.Westernblotting4.原位雜交篩選利用抗體作為“探針”，檢測產(chǎn)生外源DNA編碼的抗原的菌落或噬菌斑。六、免疫化學檢測法對表達產(chǎn)物的檢測。蛋白－蛋白“雜交”放射性抗體檢測與菌落雜交相似DNA測序是最為準確的重組子鑒定方法，可以鑒定重組克隆序列是否準確無誤。七、DNA序列分析（1）大腸桿菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（β-D-glucuronidase，GUS）；（2）細菌和螢火蟲的熒光素酶（Luciferase）；（3）水母綠色熒光蛋白（GFP）基因（GreenFluorescentProtein）。植物轉(zhuǎn)化體報告基因（reportergene)篩選報告基因：基因載體上引入的一些可證明載體已經(jīng)進入宿主細胞，并可將含有目的基因的宿主細胞從其他細胞中識別區(qū)分甚至挑選出來的具有特殊標志意義的基因。第五節(jié)基因文庫的構(gòu)建基因文庫的基本概念基因文庫的構(gòu)建程序基因組文庫重組克隆的排序基因文庫的基本概念基因庫與基因文庫基因庫（genepool）特定生物體全基因組的集合（天然存在）

基因文庫（genelibraryorgenebank）從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因）存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）

基因文庫的基本概念基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然，cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫基因文庫的基本概念基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕蔲=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小

例如，人的單倍體DNA總長為2.9x109

bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克隆；而當完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克隆基因文庫的基本概念基因文庫的質(zhì)量標準除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的制備為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，

用于基因組文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高AAAA用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在100kb左右如果先將細胞固定在低融點凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000kb大小的DNA片段基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的切割用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控

連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！基因文庫的構(gòu)建程序載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體l-DNA由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)?？妓官|(zhì)粒15kb25kb45kbBAC300kbYAC400kb用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌基因文庫的構(gòu)建程序從基因文庫中篩選目的基因大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組