酶工程第10章固定化酶催化的動(dòng)力學(xué)特征

第十章固定化酶催化的動(dòng)力學(xué)特征一、酶的固定化對(duì)其動(dòng)力學(xué)特性的影響二、影響固定化酶動(dòng)力學(xué)的因素三、外擴(kuò)散限制效應(yīng)四、內(nèi)擴(kuò)散限制效應(yīng)一、酶的固定化對(duì)其動(dòng)力學(xué)特性的影響1．酶活性的變化酶在固定化時(shí)，總會(huì)有一部分未被固定而殘留在溶液中，造成了酶的部分損失；同時(shí)由于各種原因也會(huì)造成已被固定的酶的活性有所下降。這是大多數(shù)固定化酶的情況，只有個(gè)別的酶在固定化后活性未變或反而升高。如果固定化酶的動(dòng)力學(xué)仍服從米氏方程，則可通過米氏常數(shù)Km值的大小來反映酶在固定化前后活性的變化。一些酶在溶液中和固定化后的米氏常數(shù)值

酶底物固定化試劑Km（mol/L）

肌酸激酶ATP無（溶液酶）對(duì)氨苯基纖維素6.5×10－48.0×10－4

乳酸脫氫酶NADH無（溶液酶）丙酰玻璃7.8×10－65.5×10－5

α－糜蛋白酶N-乙酰酪氨酸乙酯無（溶液酶）可溶性醛葡聚糖

1.0×10－31.3×10－3

無花果蛋白酶N-苯酰精氨酸乙酯無（溶液酶）CM-纖維-702×10－22×10－2

胰蛋白酶苯酰精氨酰胺無（溶液酶）馬來酸/1,2-亞乙基

6.8×10－32.0×10－4

酶活性變化的評(píng)價(jià)指標(biāo)酶活性表現(xiàn)率：

指實(shí)際測(cè)定的固定化酶的總活性與被固定化了的酶在溶液狀態(tài)時(shí)的總活性之比。酶活性收率：指實(shí)際測(cè)定的固定化酶的總活性與固定化時(shí)所用的全部游離酶的活性之比。

上述兩種評(píng)價(jià)指標(biāo)的差別在于是否考慮了剩余的未被固定化的酶。2．酶穩(wěn)定性的變化一般來說，酶被固定化后，無論是保存時(shí)的穩(wěn)定性，還是使用時(shí)的穩(wěn)定性均有提高。據(jù)理論推測(cè)，酶固定化后其半壽期將增加1倍。同時(shí)，固定化酶的熱穩(wěn)定性也有所提高，要比溶液酶提高10多倍。這是因?yàn)楣潭ɑ?，酶的空間結(jié)構(gòu)變得更為堅(jiān)固，加熱時(shí)不易變性，增加了酶的熱穩(wěn)定性。

二、影響固定化酶動(dòng)力學(xué)的因素1．空間效應(yīng)：（1）構(gòu)象效應(yīng)

酶的活性部位和變構(gòu)部位的性質(zhì)取決于酶分子的三維空間結(jié)構(gòu)。酶在固定化過程中，由于存在著酶和載體的相互作用，從而引起了酶的活性部位發(fā)生某種扭曲變形，改變了酶活性部位的三維結(jié)構(gòu)，減弱了酶與底物的結(jié)合能力，此種現(xiàn)象稱為構(gòu)象效應(yīng)。影響固定化酶動(dòng)力學(xué)的因素1．空間效應(yīng)：（2）屏蔽效應(yīng)載體的存在又可產(chǎn)生屏蔽效應(yīng)，或稱為位阻效應(yīng)。因?yàn)檩d體的存在使酶分子的活性基團(tuán)不易與底物接觸，從而對(duì)酶的活性部位造成了空間障礙，使酶活性下降。影響固定化酶動(dòng)力學(xué)的因素2．分配效應(yīng)當(dāng)固定化酶處在反應(yīng)體系的主體溶液中時(shí)，反應(yīng)體系成為固液非均相體系。人們常把固定化酶顆粒附近的環(huán)境稱為微環(huán)境，而把主體溶液體系稱為宏觀環(huán)境。由于固定化酶的親水性、疏水性及靜電作用等引起固定化酶載體內(nèi)部底物或產(chǎn)物濃度與溶液主體中濃度不同的現(xiàn)象稱為分配效應(yīng)。分配效應(yīng)中的分配系數(shù)

這種分配效應(yīng)一般采用液固界面內(nèi)外側(cè)的底物濃度之比，即分配系數(shù)來定量表示。設(shè)界面內(nèi)側(cè)的底物濃度為[S]i，界面外側(cè)的底物濃度為[S]o，則分配系數(shù)K可表示為：靜電作用造成的分配效應(yīng)

通常酶可能被固定在帶電荷的酶膜上或載體上。底物在溶液中也會(huì)離子化，這樣在固定的電荷和移動(dòng)的離子之間，常會(huì)發(fā)生靜電相互作用，產(chǎn)生分配效應(yīng)。根據(jù)Boltzman分配定律，分配系數(shù)K可以表示為式中

Z—底物分子所帶的電荷；F—法拉第常數(shù)；U—載體的靜電電勢(shì)；R—?dú)怏w常數(shù)；T—絕對(duì)溫度。

當(dāng)載體與底物所帶的電荷相反時(shí)，K大于1；當(dāng)兩者帶有相同電荷時(shí)，K小于1。

考慮靜電作用的反應(yīng)速度方程對(duì)于固定化酶催化的反應(yīng)，其底物濃度應(yīng)取在固定化酶內(nèi)外表面附近的微環(huán)境的數(shù)值。因?yàn)?，?dāng)Z和U異號(hào)時(shí)，K>1，，反應(yīng)速度增高；反之，，反應(yīng)速度降低；當(dāng)任何一方電荷為零時(shí)，不變。影響固定化酶動(dòng)力學(xué)的因素3．?dāng)U散效應(yīng)固定化酶催化反應(yīng)時(shí)，底物必須從主體溶液進(jìn)入到固定化酶內(nèi)部的活性中心處，反應(yīng)的產(chǎn)物又必須從固定化酶的活性中心傳出到主體溶液中。這種物質(zhì)的傳遞過程主要是擴(kuò)散過程，擴(kuò)散的速率在某些情況下會(huì)對(duì)酶反應(yīng)速度產(chǎn)生限制作用，特別是當(dāng)擴(kuò)散速率緩慢而酶的催化活性又很高時(shí)，這種限制作用會(huì)相當(dāng)明顯。

外擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散

外擴(kuò)散是指底物從主體溶液向固定化酶的外表面的擴(kuò)散，或產(chǎn)物從固定化酶的外表面向主體溶液中的擴(kuò)散。外擴(kuò)散發(fā)生在酶反應(yīng)之前或之后。由于外擴(kuò)散阻力的存在，使底物或產(chǎn)物在主體溶液和固定化酶外表面之間產(chǎn)生濃度梯度。

內(nèi)擴(kuò)散是對(duì)有微孔的載體而言。底物從固定化酶的外表面擴(kuò)散到微孔內(nèi)部的酶活性中心處，或是產(chǎn)物沿著相反途徑的擴(kuò)散。對(duì)底物而言，內(nèi)擴(kuò)散限制與酶催化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。固定化酶底物和產(chǎn)物的分布狀況酶的本征動(dòng)力學(xué)空間效應(yīng)難以定量描述，并且它與固定化方法、載體的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)、底物分子的大小和形狀等因素有關(guān)?？臻g效應(yīng)的影響一般是通過校正動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vm和Km來體現(xiàn)的。在此基礎(chǔ)上建立起來的動(dòng)力學(xué)方程一般稱之為本征動(dòng)力學(xué)（intrinsicdynamics），所測(cè)得的反應(yīng)速度稱為本征反應(yīng)速度。

本征動(dòng)力學(xué)是指酶的真實(shí)動(dòng)力學(xué)行為，包括溶液酶和固定化酶。對(duì)于后者，它僅將空間效應(yīng)的影響考慮在內(nèi)。從這個(gè)意義上講，固定化酶的本征動(dòng)力學(xué)與溶液酶的本征動(dòng)力學(xué)是有差別的。固有動(dòng)力學(xué)分配效應(yīng)造成的結(jié)果是使微觀環(huán)境與宏觀環(huán)境的底物濃度出現(xiàn)差別，從而影響酶催化反應(yīng)的速度。如果在上述本征動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)上，加上這種分配效應(yīng)造成的濃度差異對(duì)動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生的影響，所建立的動(dòng)力學(xué)稱為固有動(dòng)力學(xué)（inherentdynamics）。對(duì)這種動(dòng)力學(xué)比較簡(jiǎn)單的處理方法是：動(dòng)力學(xué)方程仍然服從米氏方程的形式，僅對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)予以修正。有效動(dòng)力學(xué)不論分配效應(yīng)是否存在，固定化酶受到擴(kuò)散限制時(shí)所觀察到的反應(yīng)速度稱為有效反應(yīng)速度，此時(shí)的動(dòng)力學(xué)稱為有效動(dòng)力學(xué)（effectivedynamics），或稱宏觀動(dòng)力學(xué)。由于生化物質(zhì)在溶液內(nèi)和固定化酶微孔內(nèi)的擴(kuò)散速率是比較慢的，所以擴(kuò)散阻力是影響固定化酶催化活性的主要因素，并且建立起來的有效動(dòng)力學(xué)方程也不完全服從米氏方程。

幾種動(dòng)力學(xué)之間的關(guān)系固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的特征

對(duì)固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，不僅要考慮固定化酶本身的活性變化，還要考慮到底物等物質(zhì)的傳質(zhì)速率的影響，而傳質(zhì)速率又與底物等物質(zhì)的性質(zhì)和載體的性質(zhì)，以及操作條件等因素有關(guān)。因此對(duì)于這樣一個(gè)為非均相體系建立起來的動(dòng)力學(xué)方程，不僅包括酶的催化反應(yīng)速度，而且還包括了傳質(zhì)速率。這是固定化酶催化反應(yīng)過程動(dòng)力學(xué)最主要的特征。三、外擴(kuò)散限制效應(yīng)為了集中研究外擴(kuò)散限制效應(yīng)，常選用液體不能滲透的無電活性的固定化酶膜或固定化酶顆粒作為研究的模型。在這種情況下，固定化酶催化反應(yīng)的過程包括3步：①底物從主體溶液擴(kuò)散到固定化酶的外表面；②底物在固定化酶的外表面上進(jìn)行反應(yīng)；③產(chǎn)物從固定化酶的外表面擴(kuò)散進(jìn)入主體溶液。其中，①和③為單純的傳質(zhì)過程，②為催化反應(yīng)過程。其中任一步速率發(fā)生變化，都會(huì)影響到整個(gè)酶反應(yīng)速度。

外擴(kuò)散限制效應(yīng)假定一不帶電荷的固定化酶，其外表面上的反應(yīng)速度符合米氏方程形式，即

式中：Vi為底物在固定化酶外表面上的消耗速度，又稱宏觀反應(yīng)速度，單位為mol/(L·s)；

[S]i為底物在固定化酶外表面上的濃度，單位為mol/L。外擴(kuò)散限制效應(yīng)

底物由主體溶液擴(kuò)散到固定化酶外表面的速率應(yīng)表示為

式中：Vd為底物由主體溶液擴(kuò)散到固定化酶外表面的速率，單位為mol/(L·s)；

kL

為液膜的傳質(zhì)系數(shù)，“m/s”；

a

為單位體積所具有的傳質(zhì)表面積，“m-1”；

kLa為體積傳質(zhì)系數(shù)，“s-1”；[S]0為底物在主體溶液中的濃度，“mol/L”

外擴(kuò)散限制效應(yīng)在穩(wěn)態(tài)條件下，應(yīng)有

，即

該式表示在穩(wěn)態(tài)條件下，外擴(kuò)散傳質(zhì)速率等于在固定化酶外表面上底物的反應(yīng)速度。

外擴(kuò)散限制效應(yīng)

當(dāng)外擴(kuò)散傳質(zhì)速率很快，而固定化酶外表面的反應(yīng)速度相對(duì)較慢，成為該反應(yīng)過程速度的限制步驟時(shí)，固定化酶外表面的底物濃度應(yīng)為主體溶液中的底物濃度，即。這時(shí)的反應(yīng)速度應(yīng)為在這種情況下，酶反應(yīng)速度不受傳質(zhì)速率的影響，為該酶的本征反應(yīng)速度，或稱在此條件下可能達(dá)到的最大反應(yīng)速度，用表示。

外擴(kuò)散限制效應(yīng)

當(dāng)外擴(kuò)散傳質(zhì)速率很慢，而酶表面上的反應(yīng)速度很快，此時(shí)傳質(zhì)速率成為限制步驟。固定化酶外表面上的底物濃度趨于零，有

在這種情況下，酶反應(yīng)速度與最大傳質(zhì)速率相等，用表示。

外擴(kuò)散限制效應(yīng)上述兩種情況為兩種極端的情況，一般的情況處于這兩者之間，稱為過渡區(qū)，如圖所示。在過渡區(qū)的酶反應(yīng)速度為宏觀反應(yīng)速度，它可由兩種方法求得。（1）由[S]i值確定Vi值在過渡區(qū)，[S]i值應(yīng)滿足方程

外擴(kuò)散限制效應(yīng)由可得

兩邊同除以[S]0，并給方程左邊的分子分母同除以[S]0得

外擴(kuò)散限制效應(yīng)引入，，并定義，

式中：為無因次底物濃度；為無因次米氏常數(shù)；為無因次準(zhǔn)數(shù)，常稱為Damk?hler

（丹克萊爾）準(zhǔn)數(shù)。

外擴(kuò)散限制效應(yīng)將上式整理成一元二次方程標(biāo)準(zhǔn)形式

令，代入上式得

解此方程可得

根據(jù)題意，只能為正值，故

外擴(kuò)散限制效應(yīng)解出后，根據(jù)求出，再將

代入即可求出

在上述方法中，是一個(gè)重要的無因次準(zhǔn)數(shù)，其物理意義為

外擴(kuò)散限制效應(yīng)在上述方法中，是一個(gè)重要的無因次準(zhǔn)數(shù)，其物理意義為

當(dāng)<<1時(shí)，酶催化的最大反應(yīng)速度要大大慢于底物的傳質(zhì)速率，此時(shí)該反應(yīng)過程由反應(yīng)動(dòng)力學(xué)控制；當(dāng)>>1時(shí)，底物的傳質(zhì)速率大大慢于酶催化的最大反應(yīng)速度，此時(shí)該反應(yīng)過程由傳質(zhì)擴(kuò)散控制。

外擴(kuò)散限制效應(yīng)（2）作圖法求[S]i值和Vi值根據(jù)，底物在固定化酶外表面的濃度應(yīng)同時(shí)滿足傳質(zhì)速率方程式和反應(yīng)速度方程式，因此也可通過作圖法求出值和相應(yīng)的值。

外擴(kuò)散限制效應(yīng)四、內(nèi)擴(kuò)散限制效應(yīng)

對(duì)于固定于多孔性載體中的固定化酶，其催化反應(yīng)的主要部位是在顆粒內(nèi)部。內(nèi)擴(kuò)散阻力主要來自于微孔內(nèi)的阻力。這種內(nèi)擴(kuò)散阻力的大小與固定化酶顆粒內(nèi)部的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)、反應(yīng)物的性質(zhì)等因素有關(guān)。在討論內(nèi)擴(kuò)散對(duì)固定化酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響時(shí)，常將均勻分布著酶的多孔球形顆粒作為研究的模型。因此要首先研究顆粒載體的結(jié)構(gòu)參數(shù)和物質(zhì)在微孔內(nèi)的擴(kuò)散。1．載體的結(jié)構(gòu)參數(shù)a．比表面積Sg它指單位質(zhì)量載體所具有的內(nèi)表面積，以m2/g表示。通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定，一般載體的比表面積可達(dá)200～300m2/g。b．微孔半徑多孔載體的內(nèi)表面積與微孔孔徑的大小有關(guān)?？讖皆叫?，比表面積越大。若單位質(zhì)量載體所具有的孔體積以Vg表示，則平均微孔半徑為

微孔半徑的計(jì)算設(shè)微孔為圓柱狀管道，長(zhǎng)為l，半徑為r

，則其內(nèi)表面積（不算兩端）孔體積

兩式相除，

載體的結(jié)構(gòu)參數(shù)c．孔隙率載體的孔隙率為載體顆粒內(nèi)孔隙所占有的體積與該顆粒體積之比。因此值恒小于1，它在數(shù)值上與Vg的關(guān)系為

。式中為表觀密度，它表示單位顆粒體積中所含有的固體的質(zhì)量。

載體的結(jié)構(gòu)參數(shù)d．顆粒當(dāng)量直徑為了表示不同形狀固定化酶顆粒的大小，一般采用如下方法：①以與顆粒體積相等的球體直徑dV表示，稱為“體積相當(dāng)直徑”；②以與顆粒外表面積相等的球體直徑dS

表示，稱為“外表面積相當(dāng)直徑”；③以與顆粒的比表面積相等的球體直徑dSV表示，稱為“比表面積相當(dāng)直徑”。體積相當(dāng)直徑對(duì)于同一非球形顆粒，按上述不同定義表示的當(dāng)量直徑在數(shù)值上是不同的。假設(shè)某任一形狀的固定化酶顆粒，其體積為VP，外表面積為AP，則根據(jù)上述定義的各當(dāng)量直徑分別為：體積相當(dāng)直徑dV外表面積相當(dāng)直徑外表面積相當(dāng)直徑dS

比表面積相當(dāng)直徑

比表面積相當(dāng)直徑dSV形狀系數(shù)ψ描述顆粒形狀可引入形狀系數(shù)的概念，用ψ表示。其定義為與顆粒體積相同的球體的外表面積AS與顆粒的外表面積AP之比，即ψ＝。由于體積相同的幾何體中球體的外表面積最小，所以一般是AS<AP，ψ<1。如果顆粒就是球體，則ψ＝1。ψ表示了任意顆粒的外形與球體相接近的程度，故又稱為圓球度。正方體顆粒的圓球度為0.806。

載體的結(jié)構(gòu)參數(shù)e．顆粒密度顆粒密度有3種定義方法：顆粒表觀密度固體的質(zhì)量/顆粒的體積顆粒真密度固體的質(zhì)量/固體的體積顆粒堆密度固體的質(zhì)量/床層的體積上述3種密度的差別在于體積計(jì)算的不同，顯然存在。

2．物質(zhì)在微孔內(nèi)的擴(kuò)散分子在微孔內(nèi)的擴(kuò)散分為兩種機(jī)理：①一種稱為分子擴(kuò)散，此種擴(kuò)散的阻力來自于分子之間的碰撞，擴(kuò)散速率主要受分子之間相互碰撞的影響，而與微孔直徑的大小無關(guān)。②另一種稱為努森（Knudson）擴(kuò)散，其擴(kuò)散的阻力主要來自于分子與孔壁之間的碰撞，而分子之間的碰撞影響較小。它常發(fā)生在微孔直徑較小的情況下。分子擴(kuò)散與努森擴(kuò)散

微孔內(nèi)某一組分進(jìn)行的擴(kuò)散屬于哪一種擴(kuò)散機(jī)理，與分子運(yùn)動(dòng)的平均自由程及微孔直徑的

d

相對(duì)大小有關(guān)。當(dāng)≤0.01時(shí)（也就是平均自由程相對(duì)短且微孔直徑相對(duì)大時(shí)），為分子擴(kuò)散；當(dāng)≥10時(shí)（也就是平均自由程相對(duì)長(zhǎng)且微孔直徑相對(duì)小時(shí)），為努森擴(kuò)散。介于這兩者之間則屬于兩種擴(kuò)散機(jī)理并存。微孔內(nèi)液體分子的擴(kuò)散速率在液體中，由于液體中的分子的平均自由程很小，所以液體在微孔內(nèi)的擴(kuò)散機(jī)理一般視為分子擴(kuò)散。其擴(kuò)散速率由分子擴(kuò)散系數(shù)決定，而液體的分子擴(kuò)散系數(shù)比氣體的分子擴(kuò)散系數(shù)小得多。微孔內(nèi)液體分子的擴(kuò)散速率可用Fick定律來表達(dá)：式中：Ns為底物S的擴(kuò)散通量；x為沿?cái)U(kuò)散方向的距離；De為底物S在微孔內(nèi)的有效擴(kuò)散系數(shù)。

分子擴(kuò)散系數(shù)與有效擴(kuò)散系數(shù)

有些固定化酶顆粒，其顆粒內(nèi)部的微孔是彎彎曲曲的，而不是整齊的圓柱體，微孔的大小也不均勻，微孔之間可能封閉，也可能相通。因此與在主體溶液中進(jìn)行的分子擴(kuò)散相比，擴(kuò)散阻力明顯增大，其有效擴(kuò)散系數(shù)要比分子擴(kuò)散系數(shù)小。

曲節(jié)因子當(dāng)固定化酶顆粒內(nèi)部的微孔是任意取向，顆粒的孔隙率為時(shí)，對(duì)顆粒單位外表面積而言，微孔的開口面積所占的分?jǐn)?shù)也為。各微孔可能相互交叉，各微孔的形狀和同一微孔不同部位的截面積也存在差異，這使得分子在顆粒內(nèi)的擴(kuò)散與在一圓柱形的微孔內(nèi)的擴(kuò)散顯然是不同的，常引入一個(gè)校正參數(shù)對(duì)此進(jìn)行校正，稱為曲節(jié)因子，或稱為彎曲系數(shù)、溝路曲折系數(shù)等。位阻因子有時(shí)底物或產(chǎn)物可能是大分子，此時(shí)微孔壁會(huì)對(duì)這些大分子產(chǎn)生一定的阻礙作用，此作用常以位阻因子H表示。考慮到上述因素，有效擴(kuò)散系數(shù)De與分子擴(kuò)散系數(shù)D的關(guān)系為式中：為固定化酶顆粒的孔隙率，其值為0～1；為曲節(jié)因子，其值一般為1.4～7；H——位阻因子，其值為0～1。

大分子的受阻擴(kuò)散

當(dāng)微孔直徑比擴(kuò)散分子直徑大得多時(shí)，位阻因子H近似為1。但在某些情況下，例如蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散，其直徑與微孔直徑幾乎為同一數(shù)量級(jí)，此時(shí)，位阻因子H就變得很重要，這時(shí)的擴(kuò)散又常稱為受阻擴(kuò)散。在微孔內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散時(shí)，有效擴(kuò)散系數(shù)比在主體溶液中擴(kuò)散明顯減小，對(duì)于常用固定化凝膠，大約為0.5～0.8。某些底物在生物凝膠中的有效擴(kuò)散系數(shù)（水溶液）凝膠種類膠濃度（質(zhì)量%）底物溫度（℃）有效擴(kuò)散系數(shù)（m2/s）海藻酸鈣2葡萄糖256.1×10－10海藻酸鈣2乙醇251.0×10－9海藻酸鈣2色氨酸306.67×10－10明膠3.8蔗糖52.09×10－10明膠5.7蔗糖51.86×10－10明膠7.6蔗糖51.35×10－10明膠25乳糖50.37×10－103．微孔內(nèi)反應(yīng)組分的濃度分布在微孔內(nèi)擴(kuò)散和反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，因而沿著從外到里的方向，底物濃度和反應(yīng)速度同時(shí)在下降。要描述濃度及反應(yīng)速度的變化規(guī)律，必須首先建立包括擴(kuò)散和反應(yīng)在內(nèi)的質(zhì)量衡算方程式。由于內(nèi)擴(kuò)散狀況與固定化酶顆粒的形狀有關(guān)，并且固定化酶顆粒多為球形，下面就以球形固定化酶顆粒為討論對(duì)象。

（1）質(zhì)量衡算方程