微生物學 04 微生物的營養(yǎng)

第四章微生物的營養(yǎng)第一節(jié)微生物的營養(yǎng)要求第二節(jié)培養(yǎng)基第三節(jié)菌種分離及保藏技術第一節(jié)微生物的營養(yǎng)要求一、碳源除水分外，需求最大(占干細胞重50%)。

1.包括：有機碳和無機碳。

2.功能：提供C和能量。

3.優(yōu)先利用：如葡萄糖效應（葡萄糖、乳糖）。二、氮源1.功能：提供N和部分能量。2.種類：無機和有機氮。3.優(yōu)先利用：（NH4）2SO4被認為速效氮源。如龜列鏈霉菌（產土霉素），利用玉米漿＞黃豆餅粉和花生餅粉。利用混合氮源，控制菌體生長和產代謝物→提高土霉素產量。三、無機鹽大量元素(10-4-10-3moL/L)：P、S、K、Mg、Fe、Na等；微量元素(10-8-10-6moL/L）：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等，須控制量。功能：酶的激活劑（Mg2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+），維持大分子和細胞結構(Ca,Mg,Fe等)，調節(jié)滲透壓（Na+）和無氧呼吸氫受體(NO3-,SO42-)等。四、生長因子（酶的輔酶或輔基）1.種類維生素（傳統(tǒng)生長因子），嘌呤、卟啉、甾醇、脂肪酸等。2.微生物對生長因子的利用（1）能合成全部：占大多數（自養(yǎng)型），過量合成型（鏈霉菌→VB12）。（2）不能或只能部分合成（異養(yǎng)型）須額外添加對應因子；如乳酸菌：添加嘌呤→核苷酸；支原體：添加甾醇。注：菌不同→需生長因子的種類和數量不同;同種菌，環(huán)境不同→需生長因子不同。如魯氏毛霉：在厭氧→需VB1+生物素；好氧→自身合成。五、水1.分為自由水和結合水。2.水活度(aw)微生物可實際利用的環(huán)境中自由水的量，或生長環(huán)境中水的有效性。一定溫度和壓力下，溶液蒸汽壓與同條件下純水蒸汽壓的比值。幾類微生物生長最適w微生物w一般細菌0.91酵母菌0.88霉菌0.80嗜鹽細菌0.70嗜鹽真菌0.65嗜高滲酵母0.60

aw=P/P0

P為溶液蒸汽壓；P0

為純水蒸汽壓

M的aw一般在0.60-0.99之間六、能量化學物質（化能營養(yǎng)型）有機物：化能異養(yǎng)型無機物：化能自養(yǎng)型輻射能（光能營養(yǎng)型）：光能自養(yǎng)和光能異養(yǎng)七、微生物的營養(yǎng)類型按碳源、能源、氫供體劃分。劃分依據營養(yǎng)類型特點碳源能源氫供體自養(yǎng)型異養(yǎng)型光能營養(yǎng)型化能營養(yǎng)型無機營養(yǎng)型有機營養(yǎng)型

CO2為唯一或主要碳源有機物為碳源光為能源有(無)機物為能源無機物為氫供體有機物為氫供體營養(yǎng)類型碳源能源氫供體光能無機自養(yǎng)型光能有機異養(yǎng)型化能無機自養(yǎng)型化能有機異養(yǎng)型

CO2有機物（或CO2）CO2有機物光能光能化學能(氧化無機物)化學能(氧化有機物)H2S、水、氫等;藻類、硫細菌有機物，如硫細菌;污水處理氫、H2S、氨等，如硝化細菌、硫化細菌等，物質循環(huán)有機物，真菌、原生動物，所有病原菌等注：區(qū)分是相對的。異養(yǎng)菌：有機物存在→可同化CO2

。自養(yǎng)菌也能利用有機物。條件變化→營養(yǎng)類型改變，如紫色非硫細菌無有機物：自養(yǎng)

；有機物存在：為異養(yǎng)；厭氧光照：光能營養(yǎng)；好氧黑暗：化能營養(yǎng)。第二節(jié)培養(yǎng)基人工配制，適合不同微生物生長繁殖或積累代謝產物所用的營養(yǎng)基質。一、配制培養(yǎng)基的原則二、培養(yǎng)基的類型及應用一配制培養(yǎng)基的原則目的明確營養(yǎng)協(xié)調

條件適宜經濟節(jié)約1.目的明確：目的菌、營養(yǎng)類型、什么用。2.營養(yǎng)協(xié)調濃度合適，比例協(xié)調（如C/N）。如水＞C源＞N源＞無機鹽＞生長因子。菌不同，C/N不同，細菌、酵母菌為5/1，霉菌為10/1。同一種菌，生長階段不同，C/N也不同。如谷氨酸棒桿菌，菌體生長C/N為4/1；谷氨酸積累為3/1。3.條件適宜滲透壓，pH，氧化還原電位和水活度。（1）pH細菌：pH7.0-8.0；放線菌：pH7.5～8.5；酵母和霉菌：pH4.5～6.0。調pH方法外源調節(jié)：1mol/L的NaOH和HCl溶液內源調節(jié)磷酸緩沖劑（KH2PO4和K2HPO4）：產生少量酸、堿時（pH6.4-7.2內起調節(jié)作用）。碳酸鈣：中和培養(yǎng)過程中產生大量酸。培養(yǎng)基中天然緩沖物質：氨基酸，蛋白質。（2）氧化-還原電位（）量度還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢。不同微生物要求值不同。好氧：0.3-0.4V→提高通氣量或加氧化劑；厭氧：+0.1V以下→加還原劑（抗壞血酸、Na2S等）；兼性厭氧：+0.1V→有氧呼吸，-0.1V→發(fā)酵。4.經濟節(jié)約糖蜜（含蔗糖，制糖工業(yè)廢液）乳清（含乳糖，乳制品工業(yè)廢液）麩皮、米糠、豆餅粉、花生餅粉等。5.附-滅菌處理121.3℃，15-20min或115℃，35min。不耐高溫物質：先過濾除菌或間歇滅菌→混合。長時間高溫→磷酸鹽、碳酸鹽+某些陽離子→沉淀。加EDTA，或分開滅菌→混合。6.常見的四種培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，pH7.0-7.2培養(yǎng)放線菌：高氏一號培養(yǎng)基，pH7.2-7.4培養(yǎng)酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基，自然培養(yǎng)霉菌：查氏培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，pH自然二、培養(yǎng)基的類型及應用（一）按成分來源劃分（二）根據物理狀態(tài)劃分（三）按用途劃分（一）按成分來源劃分1.天然培養(yǎng)基優(yōu)點：配制方便、營養(yǎng)多、經濟。缺點：成分雜，不穩(wěn)定，重復性差。例：肉湯、麥芽汁培養(yǎng)基。用途：研究和生產。2.合成培養(yǎng)基用途：研究。優(yōu)點：重復性強。缺點：貴、煩瑣、生長慢。例：高氏一號、察氏、葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基等。3.半合成培養(yǎng)基用途：廣泛。例：馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基。（二）根據物理狀態(tài)劃分1.固體培養(yǎng)基（1）固化培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基+瓊脂（1.5-2%）或明膠（5-12%）。用途：分離、鑒定、活菌計數及保藏。（2）天然固體培養(yǎng)基（3）非可逆性凝固培養(yǎng)基血清凝固或用無機硅膠做凝固劑，不能再融化，培養(yǎng)致病菌。注：凝固劑有瓊脂，明膠，硅膠。2.半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基+瓊脂（0.2-0.7%），如明膠培養(yǎng)基。用途：觀察細菌運動、噬菌體效價、厭氧菌的培養(yǎng)和保藏。3.液體培養(yǎng)基4.脫水培養(yǎng)基除水分以外，其他已配制好，如虎紅培養(yǎng)基（孟加拉紅+氯霉素）。（三）按用途劃分1.基礎培養(yǎng)基含所需基本營養(yǎng)物質。2.加富培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基+特殊營養(yǎng)物質(酵母膏,組織液,血液，血清等)。用途：培養(yǎng)苛刻菌，分離富集菌。3.鑒別培養(yǎng)基基礎培養(yǎng)基+指示劑（與微生物代謝產物發(fā)生顯色反應）→鑒別菌。名稱指示劑代謝產物特征性變化用途酪素培養(yǎng)基酪素胞外蛋白酶蛋白水解圈鑒別蛋白酶菌株H2S試驗培養(yǎng)基醋酸鉛H2S產生黑色沉淀鑒別產H2S的菌株伊紅美藍乳糖培養(yǎng)基伊紅、美藍酸反射：綠色金屬光澤透射：紫色菌落鑒別大腸桿菌纖維素水解圈放線菌霉菌4.選擇培養(yǎng)基

（1）根據特殊營養(yǎng)要求或理化抗性設計→分離菌種。（2）分類①加特殊營養(yǎng)物：如纖維素、蛋白質（氮源）或不加氮源（只加甘露醇）；②加抑制劑青霉素+鏈霉素（抑制細菌和放線菌，分離真菌）；孟加拉紅+鏈霉素+金霉素（分離真菌）；結晶紫（殺G+，分離G-）；苯酚或重鉻酸鉀（抑制細菌和真菌生長，低濃度對放線菌無影響）；制霉菌素（抑制霉菌和皮膚癬菌，分離細菌和放線菌）。5.其他分析培養(yǎng)基：分析化學物質（如抗生素、維生素）的濃度，或微生物的營養(yǎng)要求。還原性培養(yǎng)基：培養(yǎng)厭氧菌。組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基：含宿主細胞，培養(yǎng)病毒、衣原體、立克次氏體和某些螺旋體等。第三節(jié)菌種分離及保藏技術一、純培養(yǎng)分離技術固體分離技術、液體培養(yǎng)分離、單細胞分離及其選擇培養(yǎng)基分離技術四種。注：四種技術相輔相成，互相聯系。（一）、利用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)1.稀釋倒平皿法和涂布平板法(10X稀釋法，取菌懸液+培養(yǎng)基)2.平板劃線分離法

(連續(xù)劃線,目的是使cell分散)3.稀釋搖管法每只9ml無菌水涂布平板法稀釋倒平皿法樣品液取1mL樣品1.稀釋倒平皿法和涂布平板法注：無菌條件下操作；稀釋倒平皿法：溫度45-50℃，長在培養(yǎng)基表面和內部。涂布平板法：長在培養(yǎng)基表面。玻璃刮棒(涂布器)2.平板劃線法3.稀釋搖管法分離厭氧菌，稀釋倒平板法的變通形式。過程含培養(yǎng)基的試管（50℃左右）；梯度稀釋樣品，搖勻冷凝。倒滅菌液體石蠟-固體石蠟混合物，培養(yǎng)。挑單菌落。（二）、液體培養(yǎng)基分離法挑較大細菌、原生動物和藻類。用液體培養(yǎng)基梯度稀釋→培養(yǎng)。同一稀釋度，若大多數試管沒有菌生長（＞95%）→有菌生長的試管→純培養(yǎng)物。（三）、單細胞分離法顯微鏡下直接挑取。難度與個體的大小成反比，藻類、原生動物易分離，細菌難分離。（四）、選擇培養(yǎng)基分離法1.直接分離：樣品中目的菌含量多時。2.加富分離：樣品中目的菌含量少。樣品液直接分離涂布平板法對氨基苯甲酸為唯一碳源9ml無菌水取1mL樣品富集分離對氨基苯甲酸為唯一碳源的液體培養(yǎng)基對氨基苯甲酸為唯一碳源無對氨基苯甲酸，不生長有對氨基苯甲酸，生長二、菌種保藏技術根據菌種特性和保藏目的進行保存。1.原則（1）選良種，最好是休眠體（分生孢子、芽孢）（2）創(chuàng)造休眠環(huán)境如低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑等。2.幾種常用保藏方法方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評價冰箱保藏法(斜面)冰箱保藏法（半固體）石蠟油封藏法*沙土保藏法冷凍干燥法低溫低溫低溫、缺氧干燥、無營養(yǎng)干燥、無氧、低溫、有保護劑各大類細菌、酵母菌各大類**產孢子微生物各大類3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上簡便簡便簡便簡便有效簡便有效3.菌種衰退、復壯（1）衰退自發(fā)突變→丟失優(yōu)良生產性狀、遺傳標記。①原因：基因突變，傳代過多。②衰退表現菌落和細胞形態(tài)改變；生長慢，產孢少；抵抗力減弱；代謝物產量或寄生力下降。③防衰退方法控制傳代次數；用不易衰退的細胞傳代（如單核孢子）；選合適培養(yǎng)條件及保藏方法；（2）復壯①

狹義復壯:已衰退，找出未衰退個體。②

廣義復壯:未衰退前，進行純種分離、生產性能測定→提高性能。③復壯措施純種分離：平板劃線、涂布、單細胞挑取等。接入寄主內復壯；淘汰已衰退的個體（理化條件處理→殺死衰退個體）。4.國內外菌種保藏機構（1）任務：收集、保管→不死、不衰、不亂→研究、交換和使用。（2）菌種保藏機構：中國微生物菌種保藏委員會(CCCCM)

美國的典型菌種保藏中心(ATCC)

英國國家典型菌種保藏所（NCTC）法國里昂巴斯德研究所（IPL）練習題1.名詞：生長因子、培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、水活度、加富培養(yǎng)基、