呈色反應(yīng)及等電點(diǎn)測定

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定

蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)1.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)的鑒定方法并了解其原理;2.學(xué)習(xí)氨基酸的鑒定方法并了解其原理.目的要求實(shí)驗(yàn)內(nèi)容雙縮脲反應(yīng)（尿素和蛋白液）黃色反應(yīng)（頭發(fā)，指甲，蛋白液）茚三酮反應(yīng)（氨基酸，蛋白質(zhì)）原理

雙縮脲反應(yīng)

雙縮脲雙縮脲絡(luò)合物雙縮脲4個(gè)肽鍵的氨基與銅離子形成絡(luò)合物多肽鏈雙縮脲似絡(luò)合物原理實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.加熱尿素生成雙縮脲,觀察雙縮脲反應(yīng)的顏色變化;2.觀察透析蛋白液的雙縮脲反應(yīng)的顏色變化.

雙縮脲反應(yīng)尿素(晶體)10%氫氧化鈉溶液1%硫酸銅溶液蛋白液（取雞蛋清，加6-10倍水混勻，過濾）

雙縮脲反應(yīng)實(shí)驗(yàn)試劑試管及試管架試管夾酒精燈實(shí)驗(yàn)器材

雙縮脲反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作見教材注意事項(xiàng)選用干燥的試管,尿素加熱時(shí)間不能過長(1分鐘以內(nèi));避免加入過量CuSO4,否則生成蘭色的Cu(OH)2能掩蓋紫紅色.

雙縮脲反應(yīng)黃色反應(yīng)酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸硝酸對苯環(huán)發(fā)生硝化作用，生成黃色的芳香硝基化合物，使蛋白質(zhì)發(fā)生變性反應(yīng)原理硝基酚（黃色）鄰硝醌酸鈉（橙黃色）實(shí)驗(yàn)試劑與器材見教材實(shí)驗(yàn)操作見教材原理茚三酮反應(yīng)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.蛋白質(zhì)(蛋白液)的茚三酮反應(yīng);2.氨基酸的茚三酮反應(yīng).茚三酮反應(yīng)0.5%茚三酮乙醇溶液透析蛋白液0.5%甘氨酸溶液茚三酮反應(yīng)實(shí)驗(yàn)試劑試管試管架酒精燈電吹風(fēng)茚三酮反應(yīng)實(shí)驗(yàn)器材注意事項(xiàng)在濾紙上觀察茚三酮反應(yīng)時(shí),濾紙應(yīng)該跟火焰保持一定距離.茚三酮反應(yīng)思考題1.如果蛋白質(zhì)水解作用一直進(jìn)行到雙縮脲反應(yīng)呈陰性結(jié)果,可對水解作用作出什么結(jié)論?2.能否利用茚三酮反應(yīng)可靠的鑒定蛋白質(zhì)的存在?茚三酮反應(yīng)蛋白質(zhì)含量測定

（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）2010.4蛋白質(zhì)的濃度測定方法根據(jù)它們的物理性質(zhì)，如折射率、比重、吸光值來測定，如蛋白質(zhì)的紫外吸收法；利用蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)，用化學(xué)反應(yīng)的方法測定，如凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin－酚試劑法測定；還可用染色法，如用氨基黑、考馬斯亮藍(lán)-G250測定；另外還可用螢光激發(fā)、放射性同位素計(jì)數(shù)等靈敏度較高的方法測定。上述方法中，紫外吸收法、雙縮脲法、Folin－酚試劑法、凱氏定氮法、考馬斯亮藍(lán)染色法最為常用，它們操作相對簡單，不需要昂貴的設(shè)備。以下主要介紹這幾種方法。雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量

原理：在堿性溶液中蛋白質(zhì)與銅離予形成紫紅色絡(luò)合物，可在540nm比色測定，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量及氨基酸組成無關(guān)，該法測定的蛋白質(zhì)濃度范圍為1-10g/l。器材試劑雙縮脲試劑標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（牛血清白蛋白）分光光度計(jì)離心機(jī)實(shí)驗(yàn)操作盡量詳細(xì)，涉及計(jì)算的最好提前計(jì)算好；提前掌握相關(guān)儀器設(shè)備的使用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量由干蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在280nm處有一個(gè)紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在280nm的光吸收值與其濃度成正比，因此可作定量測定，該法測定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0．l～1g/L。器材試劑分光光度計(jì)離心機(jī)實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)曲線制備考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)含量原理：考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性溶液中為棕紅色．當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變?yōu)樗{(lán)色，可在590nm處比色測定，該法反應(yīng)快、操作簡便，消耗樣品最少。缺點(diǎn)：不同蛋白質(zhì)之間差異大（why?），且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差。測定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.01-1.0g/l。器材試劑考馬斯亮藍(lán)G-250染色液配制實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)曲線制備待測樣品測定重點(diǎn)難點(diǎn)測定方法的選擇；待測蛋白質(zhì)的選材（蛋白質(zhì)的含量；蛋白質(zhì)種類；干擾因素）；制備蛋白質(zhì)溶液（盡可能多的含有目標(biāo)蛋白，澄清，無沉淀）；標(biāo)準(zhǔn)曲線制備（待測蛋白液濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線中間）。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定原理測定白明膠的等電點(diǎn):配置不同PH值的緩沖液,加入白明膠后,再加入脫水劑,觀察溶液的渾濁程度,指出等電點(diǎn)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定實(shí)驗(yàn)內(nèi)容0.1mol/l醋酸鈉溶液0.1mol/l醋酸溶液95%乙醇1%白明膠溶液1mol/l醋酸溶液蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定實(shí)驗(yàn)試劑試管4支(大)試管架吸量量管(5毫升2支,2毫升3支,1毫升1支)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定實(shí)驗(yàn)器材試劑(毫升)試

管號

碼12340.1mol/l醋酸鈉溶液

2.0

2.02.02.00.1mol/l醋酸0.250.502.0/1mol/l醋酸///0.8蒸餾水3.753.502.02.01%白明膠溶液2.02.02.02.0PH值5.65.34.74.1蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定白明膠應(yīng)先在水浴鍋加熱,攪拌并溶解,待完全溶解才能使用;滴加乙醇時(shí)應(yīng)邊加邊振蕩.蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定注意事項(xiàng)什么是蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)?蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)溶液中必然沉淀,請結(jié)合蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)說明以上結(jié)論對嗎?蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定思考題氨基酸的甲醛滴定2011.3實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占兹┑味ǚy量氨基酸含量的原理和方法實(shí)驗(yàn)原理氨基酸是兩性電解質(zhì)，在水溶液中達(dá)水解平衡是弱酸，完全解離時(shí)pH為11―12或更高；一般指示劑變色域小于10，很難準(zhǔn)確指示終點(diǎn)。指示劑名稱低pH值時(shí)顏色過渡、轉(zhuǎn)變顏色的pH范圍高pH值時(shí)顏色石蕊紅4.5-8.3藍(lán)酚酞無色8.2-10.0粉紅酚紅黃6.6-8.0紅甲基橙紅3.1-4.4黃甲基紫黃0.0-1.6紫藍(lán)甲基黃紅2.9-4.0黃甲基紅紅4.2-6.3黃剛果紅藍(lán)3.0-5.2紅百里酚藍(lán)黃8.0-9.6藍(lán)孔雀石綠黃0.2-1.8藍(lán)綠溴甲酚綠黃3.8-5.4藍(lán)綠溴甲酚紫黃5.2-6.8紫溴酚藍(lán)黃3.0-4.6紫溴百里酚藍(lán)黃6.0-7.6藍(lán)百里酚酞無色9.4-10.6藍(lán)實(shí)驗(yàn)原理

R-CH-COOHR-CH-COOHNH2

甲醛

N(CH20H)2

(氨基酸)(二羥甲基氨基酸）PK:10-12PK:7

酚酞（PH9左右由無色變成粉紅色）

PK：氨基酸完全解離時(shí)的PH值實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)試劑和器材三、器材1．錐形瓶

2．吸量管（2mL

、5mL

）3．堿式滴定管、滴定臺、蝴蝶夾四、試劑1．0．1m01／‘L標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液

2．0．1mol／L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液

3.0.5％酚酞指示劑

4.中性甲醛溶液實(shí)驗(yàn)操作1．取3個(gè)25mL的錐形瓶，編號。向第1、2號瓶內(nèi)各加入2mL0.01mol／L的標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液和1-2滴酚酞指示劑,向3號瓶內(nèi)加入2mL水1-2滴酚酞指示劑;然后向1號瓶中加入4mL甲醛溶液，混勻，再向1號瓶滴加0.01mol／L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液至溶液顯微紅色。向2、3號瓶中各加入4mL甲醛溶液，混勻，再分別向2、3號瓶滴加0.01mol／L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液至1號瓶顏色。

重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)2次，記錄每次每瓶消耗標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的mL數(shù)。取平均值，計(jì)算甘氨酸氨基氮的回收率。氨基氮的實(shí)際測得量：氨基氮(mg/ml)=（V2-V3）×0.14008/2

甘氨酸氨基氮回收率％=實(shí)際測得量/理論加入量×100%

實(shí)驗(yàn)操作C2H2NO2

編號試劑1230.01mol／L標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液2ml2ml酚酞指示劑1-2滴1-2滴1-2滴中性甲醛4ml4ml蒸餾水2ml0.01mol／L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至溶液粉紅色滴定至1號瓶顏色滴定至1號瓶顏色2.取未知濃度的甘氨酸溶液2ml，依上述方法進(jìn)行測定，平行做2份，取平均值。計(jì)算每ml甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg數(shù)。

氨基氮(mg/ml)=（V2-V3）×0.14008/2實(shí)驗(yàn)操作編號試劑123未知濃度甘氨酸溶液2ml