第4章 細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)

第4章細(xì)胞培養(yǎng)的基本

技術(shù)教學(xué)目的1、掌握細(xì)胞培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求2、了解細(xì)胞培養(yǎng)常用的基本方法和操作要領(lǐng)無(wú)菌技術(shù)貫穿細(xì)胞培養(yǎng)的始終一、基本操作技術(shù)和要求一、培養(yǎng)室內(nèi)的無(wú)菌操作第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求(一)培養(yǎng)前的準(zhǔn)備有條不紊和安全可靠1.培養(yǎng)用物品的滅菌消毒(寫出物品的清單)2.操作臺(tái)的消毒(各種物品布局合理進(jìn)行紫外線消毒30分鐘;3.洗手和著裝(原則上與外科手術(shù)相同)4.火焰消毒(酒精燈使用、金屬器械、吸過(guò)培養(yǎng)液的吸管).（一）無(wú)菌操作培養(yǎng)前準(zhǔn)備：準(zhǔn)備好所需物品清點(diǎn)無(wú)誤放置操作場(chǎng)所。培養(yǎng)室和超凈臺(tái)消毒：0.2％新潔爾滅拖地紫外線照射30-50min/d75%alcohol擦洗臺(tái)面紫外線消毒勿照射培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)液每天操作前洗手和著裝：嚴(yán)格按照外科手術(shù)要求消毒著裝，操作前75％alcohol消毒無(wú)菌培養(yǎng)操作：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持無(wú)菌操作。點(diǎn)燃酒精燈，一切操作在火焰附近燒灼進(jìn)行。燒灼時(shí)間勿過(guò)長(zhǎng)防止退火。洗過(guò)培養(yǎng)液的吸管不能再燒灼。橡膠物品不能燒灼時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。吸管不能混用。（二）培養(yǎng)細(xì)胞的取材1.基本要求：

“快”，少于24h

“無(wú)菌”

用鋒利的器械切取組織減少損傷血液，脂肪，神經(jīng)組織等要棄去培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)要豐富，胎牛血清10-20％成功率：胚胎組織>成熟個(gè)體腫瘤組織>正常組織2.基本器材和用品眼科組織剪刀彎鑷手術(shù)刀（消毒）裝有無(wú)血清培養(yǎng)基或Hank’s液的小瓶小燒杯培養(yǎng)皿3.取材皮膚粘膜取材：上皮細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)源內(nèi)臟和實(shí)體瘤：體內(nèi)所發(fā)生腫瘤及各臟器是常用材料血細(xì)胞：靜脈，耳垂或手指取血，肝素抗凝骨髓，羊水，胸水，腹水：離心后立即培養(yǎng)。鼠胚組織：引頸法處死整個(gè)浸入75％alcohol5min

固定于木板取材雞胚組織：將蛋以氣室向上置燒杯中消毒剪刀環(huán)行剪開蛋殼玻璃棒挑出雞胚

（三）組織材料分離細(xì)胞懸液：500-1000rpm低轉(zhuǎn)速離心5-10min

組織塊：機(jī)械分散法:剪刀剪取后反復(fù)吹打剪切分離法：剪或切成1mm3培養(yǎng)

消化分離法：

⑴胰蛋白酶法

使用最廣泛。適宜消化間質(zhì)少的軟組織如肝腎等，對(duì)硬癌組織效果差。所需時(shí)間較短，主要缺點(diǎn)是破損細(xì)胞。⑵膠原酶解離細(xì)胞法：對(duì)解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度200u/ml，36.5℃溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質(zhì)酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。價(jià)格較高，大量使用增加成本。⑶EDTA法：較胰蛋白酶作用緩和，適宜消化分離傳代細(xì)胞。二、原代培養(yǎng)

取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。

1.組織塊培養(yǎng)法：常用，簡(jiǎn)單，成功率高。1000ml100ml2.消化培養(yǎng)法：快速得到大量活細(xì)胞，適宜培養(yǎng)大量組織，原代細(xì)胞產(chǎn)量高。步驟繁瑣，易污染，一些消化酶成本高，價(jià)格昂貴。3.器官培養(yǎng)：從供體獲得器官或器官組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外進(jìn)行培養(yǎng)。要求：特殊培養(yǎng)條件r<1mm

足夠氧氣滲入三、傳代培養(yǎng)和細(xì)胞系的維持1.原代細(xì)胞的首次傳代傳代：細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過(guò)程。是建立細(xì)胞系關(guān)鍵的時(shí)期。細(xì)胞沒有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁大部分表面以前不要傳代。根據(jù)細(xì)胞不同消化時(shí)間具體處理。首次傳代細(xì)胞數(shù)量要多。2.細(xì)胞傳代方法貼壁生長(zhǎng)：采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。懸浮生長(zhǎng)離心法傳代直接傳代法半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3.細(xì)胞系的維持“換液”傳代”“再換液”“再傳代”“細(xì)胞凍存”4.培養(yǎng)細(xì)胞的純化⑴自然純化：利用某種細(xì)胞增殖優(yōu)勢(shì)排擠其它細(xì)胞。無(wú)法人為選擇，時(shí)間長(zhǎng)，適于惡性腫瘤。⑵人工純化：酶消化法：利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶耐受性不同。機(jī)械劃除法：用橡皮刮子或彎頭滴管直接從瓶壁刮除。反復(fù)貼壁法：利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間和穩(wěn)定性不同。培養(yǎng)基限定法：某些細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中必須存在或去處某種物質(zhì)。流式細(xì)胞儀分離法：利用細(xì)胞核酸含量，某些物質(zhì)含量或細(xì)胞結(jié)構(gòu)大小等參數(shù)分離。5.原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代期衰退期五、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸教學(xué)目的1．掌握培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理2．掌握冷凍保存的常用方法3．掌握凍存細(xì)胞的常用復(fù)蘇方法4．掌握細(xì)胞運(yùn)送的幾種方法□1776年Spallanzani最早發(fā)表了“冷”處理對(duì)馬精子生命活動(dòng)的影響的報(bào)道，用雪冷凍玻璃瓶中的馬精子10多分鐘之后，再將玻璃瓶放回室溫下，精子又“復(fù)活”.□1900年前后，基本肯定生物成分能夠在零下溫度貯存的事實(shí)。□1949年至1960年稱“甘油時(shí)期”?！?959年：二甲亞砜（DMSO）發(fā)展史一、培養(yǎng)物的的冷凍保存與復(fù)蘇1．概念１）冷凍保存(cryopreservation)：是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。2）復(fù)蘇(thawing)：是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過(guò)程3）因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷被稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷(intracellularicedamage)。4）保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷被稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷(solutiondamage)原則：慢凍快融細(xì)胞的低溫冷凍儲(chǔ)存：

是細(xì)胞培養(yǎng)室的常規(guī)工作和通用技術(shù)。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。⑴原理：在低于－70℃的超低溫條件下，細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。

⑵原則：緩慢冷凍

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．冰晶就大，大冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。細(xì)胞凍存所用用品⑶慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存器簡(jiǎn)易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。液氮罐⑷低溫保護(hù)劑的應(yīng)用滲透性：具有滲透性的冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子的物質(zhì)，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、甲醇等。常用的是DMSO，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。

非滲透性：非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉等。

⑸冷凍保存溫度冷凍保存溫度是指能長(zhǎng)久保存細(xì)胞的一個(gè)深低溫度。在這樣的溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢或停止，但經(jīng)長(zhǎng)期保存和復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。從實(shí)際和效益的觀點(diǎn)出發(fā)，液氮溫度（﹣196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。（1）應(yīng)控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。（2）不宜將凍存的細(xì)胞放置在0～－60℃過(guò)長(zhǎng)時(shí)間。低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度范圍內(nèi)；（3）凍存小管宜采用塑料凍存管，不宜用玻璃安瓿。注意事項(xiàng)⒉細(xì)胞復(fù)蘇方法原則：快速?gòu)?fù)蘇（l）操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)復(fù)蘇的細(xì)胞3.培養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)輸冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸：利用特殊容器盛液氮或干冰保存。效果好但麻煩。充液法：選生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞，生長(zhǎng)1/3－1/2瓶底壁，棄掉舊培養(yǎng)液，補(bǔ)充新培養(yǎng)液至瓶頸留微量空氣，封口膜封口。貼身攜帶，達(dá)目的地后倒掉多余培養(yǎng)液，次日換液。四、細(xì)胞系及其鑒定

原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細(xì)胞類型多而復(fù)雜。因此在培養(yǎng)初期，存活和生長(zhǎng)的細(xì)胞類型也是多種多樣的。所以再培養(yǎng)不僅僅是為了維持細(xì)胞不斷地生長(zhǎng)，而且是使培養(yǎng)物逐步成為具有增殖能力、特征專一、類型均勻的培養(yǎng)細(xì)胞，即細(xì)胞系(Cellline)。各種已被命名和經(jīng)過(guò)細(xì)胞生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系或細(xì)胞株，都是一些形態(tài)比較均一、生長(zhǎng)增殖比較穩(wěn)定的和生物性狀清楚的細(xì)胞群。1.細(xì)胞系鑒定當(dāng)細(xì)胞系建立后，應(yīng)對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行一系列鑒定后，才能應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等方面的研究。細(xì)胞系的細(xì)胞來(lái)源鑒定細(xì)胞系的純度，即除了主類細(xì)胞外，還雜有哪類細(xì)胞細(xì)胞系的穩(wěn)定性，即在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中主要指標(biāo)應(yīng)無(wú)明顯變化累積細(xì)胞系的形態(tài)及其表達(dá)特征的基本數(shù)據(jù)，以及其與來(lái)源細(xì)胞的差異等2.細(xì)胞系鑒定指標(biāo)⑴染色體：染色體是一種鑒定細(xì)胞系的種屬、性別來(lái)源較為確切的指標(biāo)；也是檢查細(xì)胞系是否趨于穩(wěn)定，在離體培養(yǎng)條件下細(xì)胞有否發(fā)生轉(zhuǎn)化的可靠指標(biāo)；是區(qū)別正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞的指標(biāo)。采用染色體數(shù)目、核型分析以及染色體分帶技術(shù)檢測(cè)。⑵同工酶譜：通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、LDH(乳酸脫氫酶)、核苷磷酸化酶三種方法，根據(jù)條件選擇。

⑶細(xì)胞DNA遺傳特征:

3.細(xì)胞株建立要求及管理⑴記錄要求：

組織來(lái)源、細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)、培養(yǎng)條件和方法⑵鑒定、管理和使用

按國(guó)際慣例，在雜志或刊物上報(bào)道，詳細(xì)介紹上述各項(xiàng)目即可。各國(guó)管理中心、細(xì)胞庫(kù)美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)ATCC(AmericanTypeCultureCollection)、人遺傳突變細(xì)胞庫(kù)HGMR、細(xì)胞衰老細(xì)胞庫(kù)CAR

ATCC入庫(kù)細(xì)胞要求檢測(cè)項(xiàng)目（基本要求）：

培養(yǎng)簡(jiǎn)歷：組織來(lái)源日期、物種、供