第十一章 皰疹病毒科(Herpesviridae)

PAGEPAGE12第十一章皰疹病毒科（Herpesviridae）皰疹病毒是一群較大的包有囊膜的雙鏈DNA病毒，現(xiàn)已分離到的本科成員至少在80個(gè)種以上。它可以感染人和許多動(dòng)物包括哺乳類動(dòng)物、魚、蛙、嚙齒動(dòng)物、鳥、有袋目動(dòng)物，甚至有可能包括軟體動(dòng)物和真菌。這類病毒主要侵犯外胚層來(lái)源的組織，包括皮膚、粘膜和神經(jīng)組織，初次感染后，?？稍斐蓾摲鼱顟B(tài)，并反復(fù)發(fā)作，可達(dá)多年甚至終生。某些皰疹病毒可能是動(dòng)物和禽類腫瘤的病原因子，其中馬立克氏病病毒是已經(jīng)確認(rèn)的首例，醫(yī)學(xué)上也開始注意到某些皰疹病毒可能與人的癌癥有關(guān)。由于皰疹病毒的廣泛致病性及在潛伏感染和致癌方面的作用，這類病毒已引起病毒學(xué)者的普遍重視。第一節(jié)皰疹病毒的一般特征一、皰疹病毒的分類皰疹病毒科下分甲型皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）、乙型皰疹病毒亞科（Betaherpesvirinae）和丙型皰疹病毒亞科（Gammaherpesvirinae）。（一）甲型皰疹病毒亞科該亞科包含單純皰疹病毒屬（Simplexvirus）和水痘病毒屬（Varicellavirus）兩個(gè)屬。在這兩屬中主要的病毒有：1．單純皰疹病毒屬：有人皰疹病毒1型（單純皰疹病毒1型）〔Humanherpesvirus1（HerpessimplexvirustypeI）〕、人皰疹病毒2型（單純皰疹病毒2型）和羊皰疹病毒2（bovineherpesvirus2），另外，cercopithecine皰疹病毒是可能的種。2．水痘病毒屬：有偽狂犬病毒（Pseudorabiesvirus）、水痘-帶狀皰疹病毒（人皰疹病毒3型）、馬鼻肺炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、馬皰疹病毒1型（馬流產(chǎn)病毒）、馬皰疹病毒3型（交媾疹病毒）、貓皰疹病毒1型、獼猴皰疹病毒1型、傳染性喉氣管炎病毒等。（二）乙型皰疹病毒亞科本亞科包含巨細(xì)胞病毒屬（Cytomegalovirus）和鼠巨細(xì)胞病毒屬（Muromegalovirus）兩個(gè)屬。該兩屬中的重要病毒有：1．巨細(xì)胞病毒屬：有人皰疹病毒5型（巨細(xì)胞病毒）、馬巨細(xì)胞病毒（馬皰疹病毒2型）、豬巨細(xì)胞病毒等。2．鼠巨細(xì)胞病毒屬：有小鼠巨細(xì)胞病毒（鼠皰疹病毒1型）、大鼠巨細(xì)胞病毒（大鼠皰疹病毒2型）、豚鼠巨細(xì)胞病毒（豚鼠皰疹病毒1型）等。（三）丙型皰疹病毒亞科本亞科包含淋巴濾泡病毒屬（Lymphocryptovirus）和蛛猴皰疹病毒屬（Rhadinovirus）兩個(gè)屬，主要的種有：1．淋巴濾泡病毒屬：有人皰疹病毒4型（EB病毒）、雞皰疹病毒2型（馬立克氏病病毒）、火雞皰疹病毒（火雞皰疹病毒1型）、兔皰疹病毒1型、惡性卡他熱病毒（牛皰疹病毒3型）等。2．蛛猴皰疹病毒屬：有蛛猴皰疹病毒2型等。皰疹病毒各亞科的主要生物學(xué)特征特征αβγ在細(xì)胞培養(yǎng)上病毒繁殖速度和傳播快較慢不同細(xì)胞致病變作用殺死感染細(xì)胞作用慢，細(xì)胞先脹大而后被殺死不同宿主范圍不同較窄較窄隱性感染可以在神經(jīng)節(jié)潛伏在不同組織引起隱性感染常侵犯淋巴細(xì)胞和淋巴樣母細(xì)胞導(dǎo)致隱性感染二、皰疹病毒毒粒的一般特征（一）形態(tài)與結(jié)構(gòu)皰疹病毒系球形帶囊膜的較大病毒，直徑為200～300nm，重約1000～2000Md，在CsCl中的浮密度為1.20～1.29g/cm3。主要由核芯、衣殼、殼皮和囊膜4個(gè)結(jié)構(gòu)成分所組成。核芯由雙股線狀DNA與蛋白質(zhì)形成的纖維卷軸組成，超薄切片可見為均勻一致的圓形電子致密區(qū)，但有時(shí)看到花紋樣結(jié)構(gòu)，其纖維的末端固定于衣殼下側(cè)。核芯的直徑為30～70nm。衣殼直徑為100～110nm，有162個(gè)殼粒，排列成20面體，衣殼可能由三層組成，中層和內(nèi)層系無(wú)特定形態(tài)的蛋白質(zhì)薄膜，外層是由162個(gè)互相連接呈放射狀排列具有中空軸孔的殼粒構(gòu)成，殼粒的大小約12.5×9.5nm。衣殼的周圍常有一層無(wú)定形的球狀物質(zhì)所覆蓋稱為殼皮（Tegument），或稱皮層，在負(fù)染色標(biāo)本中常呈纖維樣，不同皰疹病毒的皮層厚度不同，即使在同一細(xì)胞內(nèi)增殖的病毒粒子的皮層厚度也不一樣。再外層為類脂雙層膜的囊膜，至少由兩層以上的結(jié)構(gòu)組成，其質(zhì)柔軟，厚薄不勻稱，上有短的突起，但對(duì)其構(gòu)造和排列情況以及功能等，尚無(wú)所知。（二）化學(xué)組成皰疹病毒的DNA為雙股線狀，分子量為85～150Md，其中帶狀皰疹病毒DNA最小，為85Md，而巨細(xì)胞病毒DNA最大，為150Md。大多數(shù)皰疹病毒的鳥嘌呤和胞嘧啶（G+C）含量較高，兩者之和常在55%以上，其中最高的如牛鼻氣管炎病毒和偽狂犬病病毒，達(dá)72%。線狀雙股DNA中有末端重復(fù)序列和內(nèi)部重復(fù)序列，其重復(fù)序列的數(shù)量和長(zhǎng)度在不同的皰疹病毒中也有較大差異。皰疹病毒DNA鏈中有缺口，所以堿變性以后可使DNA變小和呈現(xiàn)不均一性。其線狀DNA通過(guò)互補(bǔ)區(qū)也可以環(huán)化。皰疹病毒毒粒中至少有33種蛋白，分子量為15～275Kd，其中6～8種位于囊膜。在受染細(xì)胞中可以檢出大約20種病毒特異性蛋白，后者不構(gòu)成毒粒的成分。大約一半的蛋白是糖蛋白，有些是磷酸化的，至少有6個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)。衣殼中含有157、55、36和25Kd4種蛋白質(zhì)。分離的病毒DNA也有感染性，但不能完全排除混有蛋白分子。無(wú)囊膜的核衣殼更具有感染性，但仍比完整毒粒為小。核衣殼是主要的細(xì)胞內(nèi)顆粒，殼皮和外膜是它通過(guò)核膜和/或漿膜時(shí)獲得的。第二節(jié)皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)一、異構(gòu)體結(jié)構(gòu)多數(shù)皰疹病毒的基因組由兩個(gè)互相連接的長(zhǎng)節(jié)段（L）和短節(jié)段（S）DNA所組成，有的皰疹病毒其S、L節(jié)段可顛倒排列，如HSV（單純皰疹病毒），因而可以形成4種異構(gòu)體：P（原型）；IS（S節(jié)段顛倒）；IL（L節(jié)段顛倒）和ISl（S和L節(jié)段均倒置）。在皰疹病毒科中，其病毒基因組的大小和結(jié)構(gòu)有相當(dāng)大的差異。目前已知有7種不同的皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu)形式，其中人類皰疹病毒有4種。松鼠猴皰疹病毒DNA是HSV以外研究得較為詳盡的病毒。它的基因組結(jié)構(gòu)很獨(dú)特，其L節(jié)段長(zhǎng)約100kb，G+C含量低，在其兩側(cè)通過(guò)30個(gè)拷貝的約1kb的串聯(lián)重復(fù)，高G+C含量序列（H）的部分環(huán)狀變換排列而連接起來(lái)。在馬流產(chǎn)病毒（EAV）和偽狂犬病病毒（PRV），只有S倒置重復(fù)序列，在L節(jié)段未發(fā)現(xiàn)有倒置重復(fù)序列，并固定在一個(gè)方向。在海峽鲇魚病毒（CCV），其基因組較?。?20kb），也發(fā)現(xiàn)有的大的直接末端重復(fù)序列為其基因組結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。但東半球猴CMV（巨細(xì)胞病毒）以及馬和小鼠CMVDNA（220kb）是一種無(wú)倒置序列結(jié)構(gòu)、缺少L和S節(jié)段的線狀分子，EBV（EB病毒）DNA則是一種無(wú)倒置序列結(jié)構(gòu)的線狀分子，其內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)區(qū)（IR）都向著分子的一端。綜上所述，皰疹病毒基因組的結(jié)構(gòu)，從進(jìn)化的角度來(lái)說(shuō)，最古老、原始的脊椎動(dòng)物皰疹病毒是CCV和Lucke蛙瘤病毒，后者只有單一的末端直接重復(fù)序列。在鳥和哺乳類動(dòng)物的非嗜淋巴屬的皰疹病毒則發(fā)展成L和S倒置重復(fù)結(jié)構(gòu)，如HSV、MDV（馬立克氏病毒）以及西半球猴CMV；缺少L節(jié)段倒置的變種有VZV（水痘-帶狀皰疹病毒）、PRV（偽狂犬病病毒），EAV（馬流產(chǎn)病毒）等；兩套倒置均丟失的變種有東半球猴CMV，還可能包括樹鼩的皰疹病毒。在一種東半球CMV的基因組中，其內(nèi)部倒置重復(fù)區(qū)被從細(xì)胞來(lái)源的CA重復(fù)序列所替代。另一方面嗜淋巴性的皰疹病毒則發(fā)展成大套的內(nèi)部直接重復(fù)序列，如人和東半球猴的EBV樣病毒；或外側(cè)直接重復(fù)序列，如西半球猴松鼠猴皰疹病毒和H.ateles；或內(nèi)部和外側(cè)都有，如美洲兔的H.sylvilagus。在目前所研究過(guò)的皰疹病毒中，其基因組的一個(gè)末端或兩個(gè)末端有不均一現(xiàn)象，這主要是由于串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)不同所造成的。二、基因組內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列各自皰疹病毒基因組，除上述在大范圍的結(jié)構(gòu)上有差異之外，在內(nèi)部的序列結(jié)構(gòu)上也有差異，特別是串聯(lián)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)有很大的不同。這些內(nèi)部重復(fù)序列G+C含量很高，有些還是在編碼區(qū)；有些是細(xì)胞-病毒DNA的同源位點(diǎn)。三、基因組末端結(jié)構(gòu)早在1975年就發(fā)現(xiàn)HSV基因組的末端有直接重復(fù)序列，稱為“a”區(qū)。DNA序列分析表明，HSV1的“a”區(qū)為400bp，而HSV2則為250bp。不同HSV1毒株“a”區(qū)大小的變異與內(nèi)部短串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)目有關(guān)，HSV1和HSV2的“a”區(qū)很少同源性?！癮”區(qū)是由短的直接重復(fù)序列單元（20bp）所構(gòu)成，其數(shù)目的多少引起HSVL節(jié)段內(nèi)末端和外末端的不均一性。HCMV（人巨細(xì)胞病毒）DNAL節(jié)段的內(nèi)末端有比HSV大的類似的結(jié)構(gòu)（～800bp）。S節(jié)段的外末端也因重復(fù)序列數(shù)目的不同而呈不均一性。但是，小鼠CMV的線狀基因組僅含一短的30bp的直接重復(fù)序列。VZV（水痘-帶狀皰疹病毒）DNA序列分析卻表明其L節(jié)段末端有-88bp的倒置重復(fù)序列，S節(jié)段末端有一長(zhǎng)的倒置重復(fù)序列，為7319bp。EBV的DNA末端也是不均一的，有多至5個(gè)550bp序列的差異，隨機(jī)分布在其線狀DNA的兩個(gè)外側(cè)末端。幾乎所有皰疹病毒DNA的一個(gè)末端都含有一組28bp的保守序列：CCCCGGGGGGG-TGTTTTTGATGGGGGGG。至于從復(fù)制型的HSVDNA切割并包裝成成熟HSVDNA分子的信號(hào)，其本質(zhì)及精確的定位尚不清楚，但有可能在a區(qū)。這一功能是造成L和S倒置形成異構(gòu)體的根本機(jī)制。四、不同皰疹病毒基因組的比較人類5種主要的皰疹病毒基因組的全序列測(cè)定即將完成，屆時(shí)可以得到這幾種皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu)比較的精確資料，目前的資料是零星的。HSV1和HSV2在核苷酸水平上有50%的同源性，而酶譜分析研究表明，兩種DNA分子在物理結(jié)構(gòu)上是十分相似的，盡管HSV2的US區(qū)比HSV1（MP）的約長(zhǎng)3kb。兩種DNA分子同源性較差的區(qū)段位于G+C豐富的L和S節(jié)段的倒置重復(fù)區(qū)。與HSV最接近的動(dòng)物皰疹病毒是牛乳腺炎病毒（BMV），它與HSV的同源性分布于整個(gè)基因組，它不同于其它許多動(dòng)物皰疹病毒，仍保留其倒置L節(jié)段的結(jié)構(gòu)。嚴(yán)格條件下的雜交試驗(yàn)表明，HSV與關(guān)系較遠(yuǎn)的動(dòng)物皰疹病毒的基因組序列的保守區(qū)，位于L節(jié)段的中部，特別是HSV1DNA的DNA多聚酶/主要DNA結(jié)合蛋白區(qū)段。對(duì)各種皰疹病毒基因組比較認(rèn)為，各種皰疹病毒基因組之間，一方面在結(jié)構(gòu)和某些基因序列之間有一定的同源性，另一方面，確也有相當(dāng)?shù)牟煌?。例如EBV的EBNA1、2、3，BamHIM區(qū)的可為丁酸鈉誘導(dǎo)的兩個(gè)早期核抗原，在HSV中尚未發(fā)現(xiàn)有上述類似的基因產(chǎn)物。第三節(jié)基因轉(zhuǎn)錄與調(diào)節(jié)一、HSVHSV1基因組的全序列已經(jīng)測(cè)定，共152260bp，可分為UL、US、TRL、TRS、IRL和IRS各區(qū)段。UL有56個(gè)功能片段，US有12個(gè)功能片段。HSV1全基因組G+C%為68.3%，目前可以識(shí)別的基因數(shù)為72個(gè)，編碼70個(gè)不同的蛋白。美國(guó)芝加哥的Roizman首先把HSV的基因轉(zhuǎn)錄分為三類，即α、β、γ；同時(shí)在英國(guó)Glasgow的Subak-Sharp則分為IE（立即早期）、DE（早期或晚早期）和L（晚期）三類。早期基因轉(zhuǎn)錄是指DNA復(fù)制之前的轉(zhuǎn)錄，晚期基因轉(zhuǎn)錄是指或是在絕對(duì)依賴于DNA的復(fù)制（γ-2或真正的晚期），或者雖然在DNA復(fù)制前就開始合成，但在DNA復(fù)制后大量增加（γ-1，β/γ，準(zhǔn)晚期或早/晚期）。IE（α）mRNA的合成不需要任何病毒基因產(chǎn)物，而DE（β）mRNA的合成則需IE蛋白的合成才能進(jìn)行。α基因大約占基因組的10%，主要集中在倒置重復(fù)序列區(qū)段，但是一般來(lái)說(shuō)，早期或晚期基因是隨機(jī)分布在全基因組的，有60多個(gè)轉(zhuǎn)錄物。α基因有5個(gè)，即α0、α4、α22、α27和α47，隨后的基因有β1、β2、γ1和γ2，這都需要α基因的產(chǎn)物才能轉(zhuǎn)錄，特別是α4基因的產(chǎn)物，α4是主要的反式激活的調(diào)節(jié)蛋白。α0的全基因位于L節(jié)段的重復(fù)區(qū)，α4的全基因則位于S節(jié)段的重復(fù)區(qū)，α22和α47基因則位于S節(jié)段重復(fù)區(qū)與獨(dú)特區(qū)的交界處，α27基因則位于獨(dú)特區(qū)，但仍接近于L節(jié)段重復(fù)區(qū)與獨(dú)特區(qū)的交界處。所有的HSVα基因產(chǎn)物除α47之外，均是磷酸化的核蛋白。HSV1VF65基因編碼的蛋白，脯氨酸十分豐富，也是一種磷酸化的核蛋白，與以前所知的調(diào)節(jié)蛋白無(wú)同源性。VF65蛋白可從受染的細(xì)胞中或病毒毒粒中提取，它能激活HSV立即早期啟動(dòng)子。由于沒(méi)有DNA結(jié)合性質(zhì)，它通過(guò)與細(xì)胞因子的相互作用，結(jié)合于TAATGARAT序列上才發(fā)揮啟動(dòng)子激活作用。另一個(gè)HSV基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白是128Kd的DNA結(jié)合蛋白，后者對(duì)病毒DNA的復(fù)制以及對(duì)晚期多肽的合成和維持在正常水平是必需的，它是DE產(chǎn)物，非磷酸化蛋白，也結(jié)合單鏈DNA，也對(duì)早期基因的表達(dá)起作用。二、VZVVZV基因組全序列已經(jīng)測(cè)定，全長(zhǎng)124884bp，G+C含量為46.02%，其中UL共104836bp，G+C為44.33%；Trl和IRL各為88.5bp，G+C為68.3%；US共5232bp，G+C為42.7%；TRS和IRS各為7319.5bp，G+C為59.04%。根據(jù)DNA序列推導(dǎo)的功能片段有71個(gè)，其中許多終止于AATAAA或ATTAAA序列附近。皰疹病毒基因中含內(nèi)含子的并不普遍，HSV1基因組中只有4個(gè)是含有內(nèi)含子的拼接基因，VZV中ORFs42和45在該病毒表達(dá)過(guò)程中是可能拼接的，有的基因編碼區(qū)有部分重疊。第四節(jié)皰疹病毒的糖蛋白皰疹病毒的糖蛋白涉及病毒與細(xì)胞的互相作用，病毒感染的病理過(guò)程、免疫原性以及亞單位疫苗的研制。一、HSV糖蛋白種類在HSV感染的細(xì)胞中有6種糖蛋白：Gb、gC、gD、gE、gG和gH，這6種糖蛋白均存在于病毒毒粒中，在HSV2中尚未發(fā)現(xiàn)gH-1。二、不同皰疹病毒之間糖蛋白的同源性EBV的DNA全序列已經(jīng)測(cè)定，BXLF2ORF相當(dāng)于HSV1的gH-1，BALF4ORF相當(dāng)于HSV的gB，而EBV的gp350和gp220在其它皰疹病毒中尚未找列相對(duì)應(yīng)的。EBV基因組中的BDLF3和BILF2糖蛋白也未檢定。關(guān)于CMV的gp，用單克隆檢定的有g(shù)A-F，在gA上至少有5個(gè)抗原決定簇。HCMV基因組的HindIIIF片段序列分析表明，此處編碼一個(gè)糖蛋白與HSV-gB、VZV的gpII和EBV的BALF4有高度同源性。HCMV基因組中的L片段中，又發(fā)現(xiàn)了與HSV1gH，EBVBXLF2和VZVgpIII同源的糖蛋白，稱CMV-gH。馬HSV113gKd糖蛋白，牛乳腺炎病毒120Kd和130Kd糖蛋白與HSV-gB在抗原性和結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的。三、HSV糖蛋白的功能目前所知HSV糖蛋白的功能有：HSV糖蛋白的功能HSV糖蛋白gBgCgDgEgGgH在組織培養(yǎng)中病毒繁殖所必需+——+在毒粒中存在++++++病毒吸附細(xì)胞++++病毒進(jìn)入細(xì)胞++細(xì)胞融合（syn）+++細(xì)胞間傳播+FC受體———+——C3b-受體—+(gG-1)————NK特異性++中和活性++++++細(xì)胞免疫+++++四、HSV糖蛋白的抗原結(jié)構(gòu)gC-1有9個(gè)抗原決定簇，集中在2個(gè)不同的抗原結(jié)構(gòu)域中。結(jié)構(gòu)域I位于分子的C末端部分；結(jié)構(gòu)域II位于N末端，后者是由3個(gè)重復(fù)的但不同的亞結(jié)構(gòu)域所組成。gD有8個(gè)抗原結(jié)構(gòu)域，其中一些是型特異性的，另一些則是型共同的。抗原決定簇一般是由5～7個(gè)氨基酸殘基所組成，不同的抗原決定簇有不同的結(jié)構(gòu)，連續(xù)性抗原決定簇是由直接經(jīng)多肽鏈連接的氨基酸殘基所組成；而不連續(xù)性抗原決定簇的氨基酸殘基不是直接連接的，它們?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)上分散在各部分，由于蛋白折疊的緣故而連在一起。采用單克隆抗體，可以區(qū)分這兩類抗原決定簇，在操作上，不連續(xù)性的抗原決定簇可在還原和堿處理的變性條件下被破壞，而連續(xù)性的抗原決定簇在此條件則可保留。gD的8個(gè)抗原決定簇，gD-1有7個(gè)，其中3個(gè)是連續(xù)性的，分別位于成熟糖蛋白分子的268～287、340～356和11～19位，另4個(gè)是不連續(xù)的，位于成熟分子的N端頭260個(gè)氨基酸內(nèi)。五、機(jī)體免疫反應(yīng)用HSV毒?；蚴苋炯?xì)胞免疫動(dòng)物，所有HSV糖蛋白均可引起中和抗體的產(chǎn)生，純化的gB、gC、gD和E可以分別地產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體，但gD引起中和抗體的能力最強(qiáng)，所以gD具有制備各亞單位疫苗的前景。特異性單抗包括gB-1、gB-2、gC-1、gD-1、gD-2、gE-1gE-2和gH-1，可以保護(hù)動(dòng)物的HSV致死性感染。但是，也有證據(jù)說(shuō)明，中和作用不是抗病毒感染的主要保護(hù)機(jī)制?？笻SV的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可保護(hù)小白鼠的致死性腹腔內(nèi)HSV1感染。HSV1的糖蛋白涉及這一細(xì)胞免疫過(guò)程。如將成熟HSV糖蛋白用2-去氧-D-葡萄糖，衣霉素破壞后，可以降低它對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的溶解的敏感性，這些糖蛋白的功能可能是涉及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒。第五節(jié)皰疹病毒的繁殖病毒囊膜上的糖蛋白可使病毒與敏感細(xì)胞接觸，病毒囊膜糖蛋白（gpB）可引起與細(xì)胞胞漿膜相融合，使核衣殼直接進(jìn)入胞漿。在胞漿內(nèi)，核衣殼向核孔移動(dòng)，病毒DNA隨即釋放進(jìn)入核內(nèi)，開始病毒繁殖，在單層細(xì)胞培養(yǎng)上晦暗期為5～6小時(shí)，而對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期可達(dá)17小時(shí)，每個(gè)細(xì)胞可產(chǎn)生104～105顆粒，但僅有100個(gè)有感染性。病毒DNA的復(fù)制呈連鎖調(diào)控。當(dāng)病毒DNA進(jìn)入核之后，宿主細(xì)胞RNA多聚酶II即開始從不同的非鄰近區(qū)段轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生5種早期（α）mRNA，產(chǎn)生α蛋白，則可導(dǎo)致病毒基因組其它區(qū)段的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生晚早期（β）mRNA，β蛋白可阻斷α蛋白的合成，導(dǎo)致第三組RNA的轉(zhuǎn)錄，加工成晚期rmRNA。這樣，mRNA的合成和翻譯是協(xié)調(diào)的，α蛋白的形成對(duì)β蛋白的合成是必需的，這些非結(jié)構(gòu)蛋白和次要結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)晚期主要結(jié)構(gòu)蛋白（r）的合成則是必需的。所有r蛋白的合成不依賴于病毒DNA的復(fù)制：r1蛋白，如gpB和次要衣殼蛋白VP5在無(wú)病毒DNA合成的情況下就可以合成，但濃度較低；而r2蛋白（gpC）則嚴(yán)格需要DNA的復(fù)制。這三套mRNAs產(chǎn)生約50個(gè)病毒蛋白。病毒DNA的復(fù)制需要α和β蛋白，包括DNA多聚酶和DNA結(jié)合蛋白及宿主細(xì)胞酶類。DNA復(fù)制涉及復(fù)雜的復(fù)制型中間體的形成，包括“頭-尾”相連的連結(jié)體環(huán)和線環(huán)-形式。連結(jié)體DNA經(jīng)切割，包裝成核衣殼，無(wú)感染性且不穩(wěn)定。當(dāng)于核膜插入病毒糖蛋白獲得囊膜成熟時(shí)，成為具有感染力的病毒，從受感染細(xì)胞通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)緩慢釋放。在組織培養(yǎng)上大約只有25%的病毒DNA和蛋白裝配成毒粒，在核內(nèi)可形成嗜堿性包涵體。第六節(jié)馬立克氏病病毒的分子生物學(xué)馬立克氏病病毒（MDV），又名雞皰疹病毒2型，是引起禽馬立克氏?。∕arksdisease,MD）的病原。該病是一種具有高度傳染性、淋巴細(xì)胞增生性疾病，病理上以外周神經(jīng)、性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚發(fā)生單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征。本病既是危害世界養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一，又是世界上第一個(gè)用疫苗預(yù)防病毒性腫瘤獲得成功的范例。根據(jù)致病性和血清學(xué)反應(yīng)的不同，可將MDV相關(guān)皰疹病毒劃分為3個(gè)不同血清型：血清1型包括引起高發(fā)性內(nèi)臟或神經(jīng)腫瘤的MDV及其傳代后失去致病性和致瘤性的弱毒變異株；血清2型為非致瘤性自然弱毒株；血清3型為用于疫苗的火雞皰疹病毒，亦無(wú)致病性。一、MDV基因組MDVDNA為線狀雙股分子、浮密度1.706g/cm3，G+C含量46%，分子量108～120×106D，相當(dāng)于166～184kb。從感染的宿主細(xì)胞提取病毒DNA相當(dāng)困難。應(yīng)用DNA克隆片段作交叉雜交或電鏡檢查，可見變性的MDVDNA是由大小不同的兩個(gè)單鏈環(huán)通過(guò)一雙鏈臂連接而成，兩個(gè)單鏈環(huán)分別來(lái)自長(zhǎng)單一序列（UL）和短單一序列（Us），雙鏈臂則由末端長(zhǎng)、短反向重復(fù)序列（TRL、TRS）與相應(yīng)的內(nèi)部長(zhǎng)、短反向重復(fù)序列（IRL、IRS）堿基互補(bǔ)而成。MDV基因組這種結(jié)構(gòu)與α-皰疹病毒亞科的HSV-1、牛的潰瘍性乳頭炎病毒（UMV）、β-皰疹病毒亞科的CMV相同，而與γ-皰疹病毒亞科的EB病毒及α-皰疹病毒亞科的偽狂犬病病毒（PRV）不同。構(gòu)建了MDV血清1型BamHI、BglI和SmaI內(nèi)切酶圖譜、THV（火雞皰疹病毒）DNA基因組的BamHI、HindII、PstI限制性內(nèi)切酶圖譜和MDV血清2型DNA基因組的BamHI、EcoRI和XhoI的限制性內(nèi)切酶圖譜。比較分析發(fā)現(xiàn)，在非嚴(yán)格條件下，三個(gè)血清型的DNA之間有一定同源性，但在嚴(yán)格條件下雜交，幾乎不顯同源性。它們各有一個(gè)獨(dú)立的限制性酶切圖譜。MDV基因組編碼多種病毒特異性的蛋白抗原，對(duì)這些抗原基因的逐個(gè)定位及其結(jié)構(gòu)分析，其中主要的有：1．分泌性糖蛋白（gP）57-65（即A抗原）：編碼該糖蛋白多肽前體基因定位于UL區(qū)4.6kb的BamHI-B片段（精確位點(diǎn)在PvuII-EcoRI雙酶切位點(diǎn)之間2.35kb亞片段），基因轉(zhuǎn)錄方向從PvuII—EcoRI，該亞片段包括一個(gè)由1515bp組成的開放閱讀框（ORF），其中G+C為41%，經(jīng)翻譯后可產(chǎn)生505個(gè)氨基酸殘基組成的、分子量為56805D的多肽。2．非分泌性gP100、gP60、gP49糖蛋白復(fù)合物（即B抗原）：該基因定位于UL區(qū)中部BamHIK3和I3兩個(gè)相鄰片段，它包括可編碼865個(gè)氨基酸的原始翻譯產(chǎn)物的單個(gè)ORF，其中G+C為42%，ORF兩端負(fù)責(zé)啟動(dòng)和終止轉(zhuǎn)錄的序列十分保守。據(jù)推測(cè)MDVgB基因與HSV、PRV、VZV的gB基因有廣泛同源性。幾種病毒gB氨基酸同源性比較分析，可發(fā)現(xiàn)MDV與α-皰疹病毒之間同源性平均為50%，而與CMV和EB病毒同源性分別只有29%和28.2%。3．38Kd磷蛋白（pp38）：該蛋白與MDV致瘤性有關(guān)，其基因定位于BamHIH片段，它包括一個(gè)由870bp組成的單個(gè)ORF，編碼290個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。在BamHID片段未見有PP38的整個(gè)ORF復(fù)本，但在該片段TRL區(qū)發(fā)現(xiàn)部分相同序列（可編碼45個(gè)氨基酸）。4．5.5kb大小的EcorRI片段序列：在MDV基因組Us區(qū)中部，確定了5.5kb大小的EcorRI片段序列。它包括有6個(gè)ORF，其中除ORF1轉(zhuǎn)錄方向由右向左外，其余均是由左往右。ORF1與編碼HSV-1（Us2）基因同源，并與ORF2廣泛重疊；ORF3與HSVUs3基因同源，即編碼蛋白激酶（PK）基因所在。ORF4似乎是MDV獨(dú)特的，但通過(guò)與HSV-1gG比較，可見兩者有明顯相似性，故認(rèn)為ORF4為HSV-1gG同源基因。編碼MDVgD的ORF5與HSVgD基因高度同源，ORF5可編碼398個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，靠近ORF5的N′端有一條疏水區(qū)，信號(hào)肽的切除在此進(jìn)行。在C′端也有一個(gè)疏水區(qū)，具有跨膜功能。MDVgD中許多氨基酸殘基（60～260位置）在哺乳動(dòng)物α-皰疹病毒中是保守的，尤其是7個(gè)半胱氨有6個(gè)在同一處出現(xiàn)，表明它們有類似的三級(jí)結(jié)構(gòu)。MDVgD與HSV、PRV和VZVgD總的相似性分別為43.8%、42.9%和41%。編MDVgI的ORF6僅作了部分測(cè)定，已明確編碼其中252個(gè)氨基酸的序列，根據(jù)PRV和HSVgI長(zhǎng)度推算，估計(jì)已測(cè)定部分可代表MDVgI靠近N′端的65～70%。與其它皰疹病毒gI序列比較，MDVgI最保守區(qū)域位于分子的中部至N′端。5．感染細(xì)胞多肽4（ICP4）：該基因定位于US區(qū)的BamHI-A片段，編碼區(qū)全長(zhǎng)4245bp，G+C為52%，預(yù)計(jì)MDVIVP4蛋白有其它皰疹病毒ICP4的相似結(jié)構(gòu)，該基因已在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）中得到成功表達(dá)。6．P79蛋白抗原：為共同抗原，該基因定位于BamHIR片段及R片段兩側(cè)的O和B片段。7．meq基因：該基因與MDV致瘤密切有關(guān)，定位于IRL區(qū)的BamHII2片段及與此片段重疊的EcoQ片段。它包括一個(gè)編碼362個(gè)氨基酸的ORF，其對(duì)病毒的潛伏狀態(tài)有控制作用。它僅存在于MDV致瘤株，在腫瘤細(xì)胞中能持續(xù)高水平表達(dá)，尤其是它編碼的蛋白質(zhì)具有類似雞的fos/jun等核內(nèi)腫瘤基因產(chǎn)物的亮氨酸“拉鏈結(jié)構(gòu)”，表明它很可能是一個(gè)腫瘤候選基因。二、病毒特異性蛋白和抗原最初，采用瓊脂凝膠沉淀反應(yīng)（AGP）從MDV感染細(xì)胞檢測(cè)到3種主要抗原，分別稱為A、B、C抗原，當(dāng)型特異性McAb的發(fā)展和體外轉(zhuǎn)譯、分子雜交等方法的應(yīng)用，促進(jìn)了病毒特異性蛋白和抗原的研究，現(xiàn)已鑒定出至少46條MDV特異性蛋白帶，其中較為清楚的有：1．A抗原：是由MDV和THV感染細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的一種主要抗原，存在于感染細(xì)胞培養(yǎng)物上清，也見于細(xì)胞表面和胞漿中。A抗原可與常規(guī)免疫血清構(gòu)成AGP的主要沉淀線；在細(xì)胞培養(yǎng)物上連續(xù)傳代時(shí)，伴隨病毒致弱的同時(shí)出現(xiàn)A抗原產(chǎn)量降低。該抗原為57～65Kd的糖蛋白，與致瘤性無(wú)關(guān)，也無(wú)病毒中和作用，有人推測(cè)它在羽毛囊上皮細(xì)胞的病毒粒子免疫逃遁方面有一定作用，尤其與細(xì)胞早期感染及病毒侵襲淋巴細(xì)胞有關(guān)。由于缺乏直接證據(jù)，A抗原究竟有何功能仍是一個(gè)有待探討的課題。2．B抗原：由3種分子量不同gP(100Kd,60Kd,49Kd)組成的復(fù)合物，是一種非分泌性抗原，僅存在于細(xì)胞表面和胞漿。與CMV、PRV、VZV等gB翻譯后加工過(guò)程一樣，MDVgB最初來(lái)自非糖基化92Kd(pr88)多肽前體，糖基化后成為gP100中間體，然后，gP100中間體的二硫鏈斷開，形成gP60和gP49。B抗原是MDV非常重要的一種中和性抗原，用部分純化的B抗原免疫雞后，有誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，抵抗強(qiáng)毒攻擊，因而在基因工程疫苗設(shè)計(jì)中應(yīng)首先考慮。3．磷蛋白抗原：用SDS或致瘤性血清1型MDVMcAb作免疫沉淀反應(yīng)，可從MDV感染細(xì)胞裂解物中檢出分子量為41Kd、38Kd、24Kd的一組蛋白帶。其中38Kd的為一種磷蛋白（pp38），它是MDV誘導(dǎo)的非生產(chǎn)性腫瘤細(xì)胞系中唯一可檢出的一種病毒特異性抗原，因此該抗原可能與病毒致瘤性密切相關(guān)。4．蛋白激酶（PK）：皰疹病毒編碼至少兩種不同的PK，一種定位于α-皰疹病毒Us區(qū)，另一種在HSV-1、VZV的UL區(qū)。MDVUs區(qū)ORF3與前一種PK關(guān)系更為密切。與HSV、VZV、PRV相應(yīng)PK比較，MDVPK氨基酸總相似程度高達(dá)51%、53%和50%，而在催化區(qū)這種相似性更明顯（分別是60%、64%和63%）。目前對(duì)PK在MDV生長(zhǎng)周期或致瘤性方面的作用還不明了，但有證據(jù)表明MDVPK與MDV蛋白磷酸化有關(guān)，從而直接或間接地調(diào)控酶功效和促進(jìn)細(xì)胞分裂。5．gD和gI（糖蛋白D和I）：由MDVUs區(qū)ORF5和ORF6分別編碼的這兩種糖蛋白還了解不多，但是據(jù)來(lái)自HSVgD研究認(rèn)為gD是HSV感染中不可缺少的，在病毒感染的初始階段發(fā)揮重要作用。在痘苗病毒重組體表達(dá)時(shí)，它是抗HSV的一種重要免疫原。MDV在雞羽毛囊上皮細(xì)胞中可能表達(dá)gD，它的確切功能有待進(jìn)一步研究。gI對(duì)MDV體外培養(yǎng)并非必不可少，但還如PRVgI一樣，有可能起毒力作用。至于Us區(qū)ORF1編碼的US2及MDV屬共同抗原79Kd蛋白的功能尚不清楚。6．ICP4多肽：根據(jù)氨基酸順序推測(cè)，可將MDVICR4劃為5個(gè)區(qū)，其中2區(qū)和4區(qū)最保守（HSV和VZVICP4也是如此）。在N′端可見由絲氨酸殘基構(gòu)成的特征性區(qū)段。對(duì)HSVICP4作進(jìn)一步研究，它是一種具有調(diào)節(jié)功能的病毒早期介導(dǎo)蛋白。在病毒溶細(xì)胞感染或潛伏感染及控制感染狀態(tài)的調(diào)節(jié)方面，早期介導(dǎo)蛋白起著關(guān)鍵作用。雖然MDVICP4具有相似結(jié)構(gòu)域，但是否仍保留有相似的功能，還需作進(jìn)一步研究加以證實(shí)。7．meq蛋白：meq蛋白結(jié)構(gòu)很特別，它以亮氨酸“拉鏈”重復(fù)和堿性氨基酸富集的上游結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成轉(zhuǎn)錄激活劑fos/jun家族的成員之一。此外，在C′端有一個(gè)脯氨酸富集區(qū)，具有另一類轉(zhuǎn)錄因子的特征。預(yù)測(cè)meq（MDVEcoQ）蛋白分子量為39.7Kd，這已在MDV轉(zhuǎn)化的類淋巴細(xì)胞系中檢出一分子量為40Kd蛋白所證實(shí)。8．其它抗原：利用不同的McAb作免疫沉淀反應(yīng)，檢出了兩個(gè)與生產(chǎn)性感染細(xì)胞核有關(guān)的抗原，分子量分別為145～155Kd和135Kd，后者具有與DNA結(jié)合的特性。在生產(chǎn)性感染細(xì)胞漿，還發(fā)現(xiàn)一種分子量為92Kd的病毒特異蛋白，可被許多McAb予以識(shí)別。在潛伏感染的腫瘤細(xì)胞抽取物中，可見一種與MDVDNA克隆片段結(jié)合的2.8Kd蛋白，但在生產(chǎn)性感染細(xì)胞中則無(wú)。此外，在THV粒子的囊膜中可能結(jié)合有宿主細(xì)胞抗原。9．病毒誘導(dǎo)的酶：一種分子量為100Kd的DNA聚合酶，用磷酸纖維素柱層析可以部分純化，另外用THV和MDV血清1型可在CEF中誘導(dǎo)產(chǎn)生一種87Kd的胸腺嘧啶的酶，其活性可抗血清部分中和。三、MDV致瘤株的鑒定很久以來(lái)，人們就注意到MDV致瘤株與非致瘤株DNA結(jié)構(gòu)差異的比較。MDV強(qiáng)毒株在細(xì)胞培養(yǎng)物上連續(xù)傳代時(shí)，在致瘤性失去的同時(shí)伴有MDVUL兩側(cè)TRL和IRL中BamHI的D和H片段上132bp串聯(lián)正向重復(fù)的擴(kuò)增，可能由于擴(kuò)增致使1個(gè)或多個(gè)致瘤基因無(wú)法表達(dá)。132bp串聯(lián)正向重復(fù)區(qū)核苷酸序列高度保守，許多研究表明132bp重復(fù)區(qū)通過(guò)控制轉(zhuǎn)錄方式在血清1型MDV致瘤中發(fā)揮作用。應(yīng)用血清學(xué)方法無(wú)法對(duì)均屬于血清1型的致瘤株和非致瘤株作出鑒定。Silva等采用放射性標(biāo)記探針（EcoRIF片段）作Southern印跡雜交，檢查不同代次MD11，發(fā)現(xiàn)MD11在傳到60代時(shí)，EcoRIF片段消失，但在F片段前出現(xiàn)一較寬的拖跡片段，能與EcoRIF片段雜交。PCR技術(shù)，在用于MDV不同血清型，尤其是致瘤株與非致瘤株的鑒定方面，具有廣闊應(yīng)用前景。四、MDV核酸探針診斷Davidson等以雞羽毛囊為抗原，比較了ELISA、AGP、Dot-印跡雜交法，認(rèn)為ELISA比AGP敏感，ELISAOD值≥0.3的樣品，大多可與MDVDNA探針雜交。Dot-印跡雜交法敏感性和特異性都高，具與ELISA和AGP有良好相關(guān)性。Malkinson等比較了不同方法檢出雞羽毛囊病毒的時(shí)間、接毒感染雞檢出的時(shí)間為：ELISA，10～14天；AGP，14～24天；Dot-印跡雜交，11～18天。接觸方式感染雞的檢出，AGP比其它兩法晚14天。由此可見ELISA和Dot-印跡雜交法適合于自然病例的早期診斷。Levy等還用核酸探針從THV免疫雞的羽毛囊中檢出MDVDNA，證實(shí)THV免疫不能完全防止MDV在雞羽毛囊中的復(fù)制。對(duì)MDV核酸探針的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)許多研究者作了大量工作。單松華等用缺口平移法制備的生物素標(biāo)記探針，可用于鑒定MDV感染細(xì)胞培養(yǎng)物，診斷毛雞或光雞MD。3種方法比較，認(rèn)為Dot-印跡雜交法高度敏感，可達(dá)pg水平，而Dot-ELISA和AGP的敏感性稍差。錢建飛等和李光富等分別用光敏生物素和地高辛標(biāo)記MDVDNABamHIL片段，一致認(rèn)為Dot-印跡雜交法較AGP敏感，且可用于強(qiáng)毒株與THV疫苗株鑒別。崔治中用地高辛標(biāo)記探針，能從強(qiáng)毒感染18天的雞羽毛囊中檢出病毒DNA。五、基因工程疫苗研究近況近幾年來(lái)，有關(guān)MDV基因表達(dá)的研究十分熱烈，并取得了許多成果。1．A抗原：楊寶華等將MDV基因文庫(kù)BamHIB片段酶切獲得2.2kb亞片段，PCR法克隆于其中A抗原基因（1.8kb），與載體pKK223-3構(gòu)建了重組質(zhì)粒，在E.coli系統(tǒng)獲得了成功表達(dá)。Nilkura等將MDVA抗原基因與桿狀病毒重組