生化分離工程實(shí)驗(yàn)2014修改版

生化分離工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師：郝勃電子郵箱：haobo@聯(lián)系電話：辦公地點(diǎn)：菌株的優(yōu)化培養(yǎng)總DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR擴(kuò)增目的基因乙醇沉淀回收線性化片斷大腸桿菌表達(dá)載體pET-28酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5挑取轉(zhuǎn)化子并抽提質(zhì)粒驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒(PCR及酶切驗(yàn)證)檢索感興趣的基因（以katB為例）直接優(yōu)化并合成連T載測(cè)序結(jié)構(gòu)解析重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)挑取重組子,用菌落PCR方法驗(yàn)證IPTG誘導(dǎo)促使目的大量蛋白表達(dá)細(xì)胞破碎及蛋白抽提目標(biāo)蛋白的純化蛋白質(zhì)濃度測(cè)定--Bradford法目標(biāo)蛋白的鑒定—Westernblotting結(jié)晶本次試驗(yàn)內(nèi)容本次試驗(yàn)的主要內(nèi)容His-Tag系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)katBfabZkatB是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶，其催化細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫分解，保護(hù)細(xì)胞組織，防止膜脂過(guò)氧化。在菌體中常以四聚體的形式存在。大腸桿菌fabZ基因編碼3-羥基脂酰ACP脫氫酶，是大腸桿菌脂肪酸代謝途徑中的必須基因，該基因的突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。背景資料——目的基因fabZ

基因：474bp；蛋白17.8kDa，酶切后MBP標(biāo)簽

42.5kDa

katB基因：1467bp；蛋白55.8kDa背景資料——表達(dá)載體pMAL-c2系列的載體帶有malE信號(hào)序列，能使融合蛋白穿過(guò)細(xì)胞膜。Imidazole（咪唑）

競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系背景資料——組氨酸和Ni-NTA親和作用原理系統(tǒng)原理示意圖pMALMBP標(biāo)簽

42.5kDaSDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子表面活性劑。它能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，包裹蛋白，掩蓋電荷差異和形狀區(qū)別，使得電泳速率只與分子量有關(guān)。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N，N’—亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。引發(fā)劑是過(guò)硫酸銨(APS)，催化劑是四甲基乙二胺（TEMED）。背景資料——聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)原理聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳，根據(jù)電荷差異和分子大小不同來(lái)分離蛋白質(zhì)。濃縮效應(yīng)和分子篩效應(yīng)注意事項(xiàng)：有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)趲€基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對(duì)于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對(duì)分子量。

丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺均為神經(jīng)毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用。因此必須小心操作，不得吸入和接觸皮膚，聚合完全聚丙烯酰胺凝膠無(wú)毒。凝膠配制過(guò)程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無(wú)法注膠.注膠過(guò)程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡.水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡

※凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面.電泳前確保玻璃杯下面的氣泡去除干凈！生化分離工程實(shí)驗(yàn)安排一、接種按2%的接種量將兩種菌株分別加入到含抗生素的LB培養(yǎng)基中,做好標(biāo)記（寫(xiě)清組號(hào)、基因信息、抗性）。二、誘導(dǎo)注：在加入IPTG之前，搖勻菌液并各取1ml于1.5ml的離心管中，做好標(biāo)記（組號(hào)，基因名）記作“誘導(dǎo)前”，放于離心管板中，于-20℃保存。配試劑將超凈臺(tái)內(nèi)PA瓶中剩余的菌液用槍吸取200μl于1.5ml離心管中，10000rpm離心1min，棄上清(可用槍將上清吸盡)。加入200μl的無(wú)菌水洗滌菌體上殘留的培養(yǎng)基，10000rpm離心1min，棄上清，然后重懸于40μl滅過(guò)菌的去離子水中，100℃煮沸15min。

10000rpm離心1min，取上清5μl作為菌落PCR的模板。三、菌液PCR（驗(yàn)證目的基因已轉(zhuǎn)入宿主菌中）PCR體系H2O8μl10XPCRbuffer2.5μldNTP2.0μl上游引物(F)1μl下游引物(R)

1μlTaq酶0.5μl模板5μl總體積20μlPCR程序95℃5min95℃35s55℃30s72℃40s/90s72℃10min25℃5minCycle30注：陽(yáng)性對(duì)照(將模板換成1μl質(zhì)粒)；陰性對(duì)照（將模板換成5μl

H2O）；不用重復(fù)，PCR管上做好標(biāo)記！瓊脂糖凝膠電泳1.制備0.8%瓊脂糖凝膠(已配好)。

2.膠板制備:將干凈的膠板放入膠槽中，并在固定位置放好梳子。再將配好的瓊脂糖凝膠在微波爐里充分融化，冷卻

到65℃左右后小心地倒入膠槽內(nèi)。室溫靜置直至凝

膠完全凝固，垂直輕拔梳子。將膠板放入電泳槽中，

添加1×TAE電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)膠板1-2㎜為止。3.加樣:將PCR后的樣品和與LoadingBuffer充分混勻后加入膠孔

中。每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)槍頭，以防污染。4.電泳:打開(kāi)電源進(jìn)行電泳（電壓80V）。約30min后，停止電泳。5.電泳完畢后，取出凝膠用溴化乙錠（EB）染色。6.觀察照相:在紫外燈下觀察并用拍照保存。將加入誘導(dǎo)劑后的菌液再放入37℃，200rpm的搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)4-5h后收集菌體。注：在離心沉淀之前搖勻菌液取1ml于1.5ml的離心管中，做好標(biāo)記（組號(hào)，基因名）記作“誘導(dǎo)后”放在第八組的離心管板上。離心時(shí)用天平嚴(yán)格配平（差異在0.02g之內(nèi))！四、收菌五、裂解細(xì)胞將冷凍保存的細(xì)胞團(tuán)在室溫下解凍，冰上破碎至菌液成澄清（

200-300w超聲6×10s-10s，約20min）,天平嚴(yán)格配平后10000*g，4℃，離心20min。上清取1ml于1.5ml離心管中，作標(biāo)記為“上清”沉淀用1ml對(duì)應(yīng)的buffer（his-tag為bindingbuffer，pMAL為columnbuffer）重懸后，保存在1.5ml的離心管中，標(biāo)記為“沉淀”。六、蛋白純化注：收集到的蛋白做好標(biāo)記后須在冰上保存，避免其失活pMAL?系統(tǒng)MBP標(biāo)簽的切除從A595最大的幾管(一般是第二、第三管)取80μl用于蛋白酶FactorXa的酶解。在80μl洗脫液中取15μl保存在pcr管中，作為酶切對(duì)照。剩下的65μl加入3μl的FactorXa后混勻，室溫下反應(yīng)2h。分別在0.5h、1h、2h取樣15μl。注：每次取樣做好標(biāo)記后，將樣品放于-20℃保存Ni柱的清洗與保存第1步：2倍體積6M鹽酸胍，0.2M醋酸第2步：2倍體積水第3步：1倍體積2%SDS（注意低溫容易析出）第4步：1倍體積25%乙醇第5步：1倍體積50%乙醇第6步：1倍體積75%乙醇第7步：5倍體積100%乙醇第8步：1倍體積75%乙醇第9步：1倍體積50%乙醇第10步：1倍體積25%乙醇第11步：1倍體積水第12步：5倍體積100mMEDTA，pH8.0第13步：3倍體積水由于EDTA處理后仍可有少量蛋白未能完全釋放，建議在純化不同蛋白時(shí)應(yīng)另?yè)QHis·Bind樹(shù)脂。樹(shù)脂的再生當(dāng)柱流速明顯下降，或樹(shù)脂在使用離子化緩沖液處理之后沒(méi)能顯示深藍(lán)綠色，則樹(shù)脂需要更徹底的清洗處理。七、配制SDS注意：梳子厚度與膠板厚度要配套！

八、SDS電泳點(diǎn)樣順序：誘前、誘后、上清、沉淀、穿透液、W1、W終、Marker、E1、E2、E3、酶切后點(diǎn)樣：按1:1比例，取樣品加入loadingbuffer中，置沸水浴中煮沸10min，冷卻，離心1min，取上清液20ul點(diǎn)樣。(記錄點(diǎn)樣順序)點(diǎn)樣完畢后即可開(kāi)始電泳，先以80v電壓跑15-20min，蛋白質(zhì)通過(guò)積層膠后，更換到120v，待溴酚藍(lán)接近分離膠底部后停止電泳，取下膠板，小心撬開(kāi)膠板割取分離膠，放入染色皿中，加入一定染色液（沒(méi)過(guò)膠面即可）。置于搖床上染色3h左右。染色完畢后，回收染色液，加入脫色液，搖床脫色數(shù)次，最后一次可以過(guò)夜脫色。1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成各濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用蒸餾水稀釋至1L。九、蛋白濃度測(cè)定每加完一管立即在漩渦振蕩器上混合，2~5min后以1號(hào)為對(duì)照調(diào)零測(cè)A595以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（ug）為橫坐標(biāo)，用吸光度A595為縱坐標(biāo)作標(biāo)曲。注：震蕩過(guò)程中不要太劇烈，以免產(chǎn)生較多氣泡而無(wú)法消除.管號(hào)1234567katB和Fabz(ul）