第八章植物細胞培養(yǎng)及次生物質(zhì)生產(chǎn)

第八章植物的細胞培養(yǎng)

及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)培養(yǎng)過程：培養(yǎng)物外植體愈傷組織不定芽根形成愈傷組織誘導培養(yǎng)基再分化培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基

植物細胞培養(yǎng)（PlantCellCulture）:在離體條件下，對植物單個細胞或小的細胞團進行培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，大量獲得細胞群體的技術(shù)。植物細胞培養(yǎng)的類型單細胞培養(yǎng)(單個細胞)細胞懸浮培養(yǎng)(小的細胞團)大規(guī)模細胞培養(yǎng)(大量培養(yǎng)細胞)第一節(jié)植物的單細胞培養(yǎng)一、植物細胞分離方法機械分離法：從完整植物器官和組織中分離單細胞的方法。常用的是葉片（葉肉組織排列疏松）。將葉片輕輕研碎、過濾、離心、收集、凈化優(yōu)點：細胞不受酶傷害；有利于進行細胞的生理和生化研究。酶解法:選擇專一性水解酶在溫和的條件下將植物細胞壁物質(zhì)(纖維素、果膠、多糖)降解,從而使細胞彼此分開,獲得單個細胞的方法。優(yōu)點：可獲得較多的游離細胞（但對禾本科植物葉片效果不好）。植物細胞分離方法愈傷懸浮法：從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過搖床振蕩獲得分散的單細胞或小細胞團。優(yōu)點：細胞不受傷害，可獲得較多的游離細胞或小的細胞團。植物細胞分離方法二、單細胞培養(yǎng)技術(shù)（singlecellculture）1、平板培養(yǎng)(platingculture)2、看護培養(yǎng)(nurseculture)3、微室培養(yǎng)(micro-chamberculture)4、雙層濾紙培養(yǎng)(feederlayercultur)1、細胞平板培養(yǎng)將一定密度的懸浮細胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術(shù)。Bergman(1960)首創(chuàng)單細胞的分離：一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6個細胞。單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5×105個/毫升植板：將1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為1-2mm左右。細胞懸浮過濾與培養(yǎng)基混合植板培養(yǎng)克隆愈傷組織平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細胞團的單細胞在接種單細胞總和中所占的比例。每個平板形成的細胞團數(shù)植板率＝×100%

每個平板接種的細胞總數(shù)優(yōu)點：單細胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯微鏡下對細胞進行定點觀察，是單細胞株篩選和突變體篩選的常用方法。由于它具有篩選效率高、篩選量大、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應用于細胞分裂、分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)物合成等。缺點：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。Muir(1953)首創(chuàng)此法獲得煙草單細胞體系。優(yōu)點：簡便易行，效果好。缺點：不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程。2、看護培養(yǎng)3、微室培養(yǎng)細胞起始密度：30～80個/室優(yōu)點：可對培養(yǎng)細胞連續(xù)進行顯微觀察，了解一個細胞的生長、分裂、分化等過程缺點：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH變動幅度大，培養(yǎng)細胞僅能短期分裂。

把處理（如X射線處理）過的無分裂能力或分裂很慢的細胞來飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細胞，使其分裂和生長。4、雙層濾紙培養(yǎng)（飼養(yǎng)層培養(yǎng)）第二節(jié)懸浮培養(yǎng)細胞懸浮培養(yǎng)（Cellsuspensionculture)：將單個游離細胞或小細胞團懸浮于液體培養(yǎng)基中，在保持良好細胞分散狀態(tài)下進行培養(yǎng)（懸浮振蕩培養(yǎng)）的技術(shù)。一、細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)懸浮培養(yǎng)包括：愈傷組織的誘導;

懸浮系的建立與細胞的生長增殖(一)愈傷組織的誘導適宜于細胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織要求：松散性好（疏松易碎）、增殖快。適宜的外植體：幼莖、葉柄等是最常使用的外植體適宜的培養(yǎng)基：適當?shù)募に貪舛?；較低的蔗糖濃度；必要的附加物質(zhì)多次繼代篩選

外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，松散易碎。

適于懸浮培養(yǎng)適于再生植株(一)愈傷組織的誘導(二)懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)愈傷組織1-2g愈傷/10-20ml培養(yǎng)基100、250ml三角瓶（30、70ml培養(yǎng)基）120rpm,25℃黑暗培養(yǎng),初始培養(yǎng)換液1次/3d以防粘稠蔗糖梯度離心或過濾法(淘汰過大或生理狀態(tài)不好的細胞團)繼代培養(yǎng)100-110rpm（懸浮細胞系穩(wěn)定以后）繼代時間為1周時（原懸浮液：新培養(yǎng)基=1：4）懸浮細胞的起始密度一般在104×105個細胞/毫升成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系滿足三個條件：均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小，一般在20～50個細胞以下，在實際培養(yǎng)中很少有完全由單細胞組成的植物細胞懸浮系。

細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2～3天甚至更短時間便可增加一倍。實例分析：P87二、懸浮培養(yǎng)工藝1、分批培養(yǎng)：培養(yǎng)體系（培養(yǎng)基、培養(yǎng)物）處于封閉狀態(tài)，既不向培養(yǎng)系統(tǒng)中補充培養(yǎng)基也不從系統(tǒng)中排出培養(yǎng)物，（一次性加入培養(yǎng)基，一次性收獲培養(yǎng)物）。懸浮細胞的生長動態(tài)指指2、連續(xù)培養(yǎng)

在培養(yǎng)過程中，不斷排出懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物不斷得到養(yǎng)分補充，保持其恒定體積的培養(yǎng)。

類型：（1）半連續(xù)培養(yǎng)

指每隔一定時間后倒出一定量的懸浮液，并同時補充加入等量新鮮培養(yǎng)液。能重復地取得大量、均一的培養(yǎng)細胞，供生物研究之用。（2）連續(xù)培養(yǎng)

封閉式連續(xù)培養(yǎng)：系統(tǒng)中的細胞數(shù)目不斷增加。

開放式連續(xù)培養(yǎng)：系統(tǒng)中的細胞密度保持恒定。a.恒化培養(yǎng)b.恒濁培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)的特點（1）由于不斷加入新鮮培養(yǎng)基，保證了養(yǎng)分的充分供應，不會出現(xiàn)懸浮培養(yǎng)物發(fā)生營養(yǎng)不足的現(xiàn)象。（2）可在培養(yǎng)期間使細胞保持在對數(shù)生長期中。細胞增殖速度快。（3）適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。第三節(jié)規(guī)模化細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物一、代謝產(chǎn)物(metabolites)初級代謝產(chǎn)物(Primarymetabolites)：生物通過代謝活動所產(chǎn)生的、自身生長和繁殖所必需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。次級代謝產(chǎn)物(Secondarymetabolites)：是通過次級代謝合成的產(chǎn)物，大多是分子結(jié)構(gòu)比較復雜的小分子化合物，例如抗生素、激素、色素、生物堿、毒素等。

二、植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的意義例：紫杉醇（Taxol）是從紅豆杉屬植中分離得到的一種雙萜類化合物。C47H51NO14，分子量：853.90用途：具有良好的抗癌活性，尤其對晚期、轉(zhuǎn)移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有、轉(zhuǎn)移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有十分顯著的療效。制備途徑：1.直接從紅豆杉中提?。?化學全合成化學半合成；3.內(nèi)生真菌培養(yǎng)；4.植物細胞培養(yǎng)。提?。涸诓煌t豆杉屬植物樹種和樹木的不同部位(如樹皮、木材、樹葉、嫩枝和幼苗等)含量有所不同，以樹皮、嫩芽中含量最高，心材最低。一般含量為0.005%左右。生產(chǎn)1kg紫杉醇需要砍伐60年生大樹3000-4000棵。若光從樹皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200萬棵左右的大樹。破壞寶貴資源、不可持續(xù)發(fā)展。化學合成：結(jié)構(gòu)復雜，全合成需要幾十步合成步驟，總得率僅4-5%。成本高

二、植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的意義

利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)植物產(chǎn)品顯然是工業(yè)化生產(chǎn)植物產(chǎn)品的一條有效途徑三、規(guī)?；毎囵B(yǎng)植物細胞規(guī)模化培養(yǎng)過程（一）誘導植物產(chǎn)生旺盛生長的愈傷組織,建立懸浮細胞系（二）篩選高產(chǎn)細胞系（細胞株，種子細胞）（三）大量培養(yǎng)細胞（/團）并適時采收細胞株（CellStrain)細胞系(Cellline)：經(jīng)繼代培養(yǎng)純化，獲得的以一種細胞為主的能在體外長期生存的不均一的細胞群體。細胞株(Cellstrain)：從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法由單胞系增殖形成的、生長速度快、目標產(chǎn)物含量高、適宜于大規(guī)模培養(yǎng)的均一的細胞群體。（一）細胞株的誘導與篩選（1）分散性好，適合大規(guī)模懸浮培養(yǎng)；（2）均一性好，細胞大小、生理狀態(tài)一致；（3）生長速度快，培養(yǎng)周期短，不易染菌；（4）目標產(chǎn)物含量高，容易分離提?。唬?）細胞遺傳穩(wěn)定。

適合大規(guī)模培養(yǎng)的細胞株應具備何條件？1、細胞株的誘導愈傷組織的誘導與培養(yǎng)單細胞的分離

細胞無性系的分離

單細胞培養(yǎng)多次繼代篩選2、細胞株的篩選與增殖培養(yǎng)3、篩選細胞株的增殖培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)（搖瓶培養(yǎng)），逐級放大，獲得大量的活躍生長的種子細胞群體；細胞株鑒定：經(jīng)常鑒定，防止細胞株退化和變異。培養(yǎng)基的選擇1977年Zenk提出：(1)維持培養(yǎng)基(maintenancemedia)

——盡可能快的使細胞量增長(2)生產(chǎn)培養(yǎng)基(productionmedia)——誘發(fā)和保持次生代謝旺盛，積累相應代謝產(chǎn)物兩步培養(yǎng)技術(shù)P91培養(yǎng)基既要滿足植物細胞的生物量增長，還要滿足細胞合成及積累次生產(chǎn)物的需要。(1)誘導劑：

可引起代謝途徑改變或代謝強度改變的物質(zhì)。

無機離子、真菌提取液、葡聚糖等。

作用機理:

可以調(diào)節(jié)代謝進程某些酶的活性,并對某些關(guān)鍵酶在轉(zhuǎn)錄水平上進行調(diào)節(jié)。加入誘導劑或前體物

作用：消除關(guān)鍵酶的阻礙、阻斷內(nèi)源性中間體的分隔和有效貯存，大大提高次生代謝物的產(chǎn)量。(2)前體物煙草：天仙子胺尼古丁產(chǎn)量降低新煙堿含量大大提高

生物反應器的選擇適合植物細胞懸浮培養(yǎng)的生物反應器的特點：合適的氧傳遞；良好的流動性；較低的剪切力。生物反應器的類型及特點1、懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)生物反應器2、固定化培養(yǎng)系系統(tǒng)生物反應器植物懸浮培養(yǎng)的生物反應器特點：具有合適的氧傳遞、良好的流動性和低的剪切力。①懸浮培養(yǎng)生物反應器類型機械攪拌式氣動式（氣升式，鼓泡式）機械攪拌式生物反應器機械攪拌式生物反應器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎上改進設計。優(yōu)點：1）培養(yǎng)環(huán)境保持基本穩(wěn)定（氧氣，二氧化碳，溫度，pH等）2）攪拌充分，細胞供氧和混合效果好缺點：過高的剪切力，易對植物細胞造成傷害。氣升式生物反應器5L氣升式植物細胞（或器官）培養(yǎng)罐氣升循環(huán)式生物反應器內(nèi)環(huán)式外環(huán)式鼓泡式生物反應器氣動式生物反應器利用空氣為動力，帶動培養(yǎng)容器中的液體流動。適宜于植物細胞培養(yǎng)的一類生物反應器優(yōu)點：剪切力小，對細胞損傷小，易長期無菌培養(yǎng)。缺點：操作彈性小，低氣速或培養(yǎng)后期混合效果差；此時如果提高通氣量又會產(chǎn)生大量泡沫。懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)點1）可以保證良好的混合狀態(tài)，增加細胞與培養(yǎng)液的接觸面，促進營養(yǎng)的吸收，獲得良好的氣體傳遞效果。2）細胞生長快，能大量提供比較均勻的細胞。3）可以借鑒發(fā)酵工程的成熟技術(shù)，容易放大實現(xiàn)規(guī)?；＜毎潭ɑ褐笇⒂坞x的細胞包埋在多糖或多聚化合物制備成的網(wǎng)狀支持物中，培養(yǎng)液呈流動狀態(tài)，進行無菌培養(yǎng)的一種技術(shù)。②固定化反應器固定化培養(yǎng)的優(yōu)點p95：易于控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境和收集產(chǎn)物；包埋后細胞受到的剪切力損傷減少；

細胞生長較緩慢，有利于次生代謝物的積累；有利于進行連續(xù)培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化；固定化細胞培養(yǎng)的條件選用固定化細胞培養(yǎng)應具有如下兩個條件：目的產(chǎn)物應自然分泌到培養(yǎng)液中，或者通過改變PH值、離子強度或使用滲透劑使之分泌于培養(yǎng)基中；要求產(chǎn)物的形成在細胞生長之后。產(chǎn)物積累與細胞生長關(guān)系

生長偶聯(lián)型中間型非生長偶聯(lián)型細胞固定化方法常用的包埋固定方法：（1）海藻酸鹽固定化滴入CaCl2使海藻酸鹽形成顆粒（2）卡拉膠固定化滴入NaCl使卡拉膠形成顆粒（3）瓊脂糖固定化（4）瓊脂固定化海藻酸鈣固定植物細胞的技術(shù)路線：大量培養(yǎng)植物細胞混合倒入塑料注射器慢慢滴入含氯化鈣培養(yǎng)基一定濃度的海藻酸鈉溶液海藻酸鈣固定的細胞團

小規(guī)模固定化小規(guī)模的植物細胞固定化可用無菌的塑料注射器進行。配制一定濃度的海藻酸鈉溶液，高溫、高壓滅菌。通過離心或過濾收集植物細胞，將細胞懸浮于海藻酸鈉溶液混合，倒入塑料注射器中，慢慢滴入到含有CaCl2的培養(yǎng)基中，不斷攪拌，使之形成球形顆粒，然后通過過濾收集顆粒，用含有CaCl2的培養(yǎng)基清洗后，轉(zhuǎn)入裝有培養(yǎng)基的搖瓶中進行培養(yǎng)。大規(guī)模植物細胞固定化裝置含CaCl2的培養(yǎng)基蓋子空氣出口海藻酸鈉+細胞懸浮液噴嘴無菌空氣入口

大規(guī)模固定化植物細胞需要采用大規(guī)模細胞固定化裝置進行細胞的固定化。常見的幾種植物固定化生物反應器系統(tǒng)①流化床生物反應器：細胞包裹在膠粒、金屬或泡沫顆粒中。優(yōu)點：細胞包埋顆粒小，傳質(zhì)效率高。缺點：剪切力或碰撞破壞細胞。（b）空氣出口空氣進口流化床生物反應器培養(yǎng)基常見的幾種植物固定化生物反應器系統(tǒng)②填充床生物反應器：細胞固定在膠粒、金屬或泡沫顆?；蜻B續(xù)多個網(wǎng)中，或位于支持物表面。細胞固定不動。（a）出口進口填充床生物反應器優(yōu)點：單位體積固定細胞量大缺點：混合效果低，對必要的氧傳遞、PH、溫度控制和氣體產(chǎn)物的排除造成了困難，影響了細胞的培養(yǎng)，同時大顆粒的低效率傳質(zhì)、填充體成分供應和排除的困難常見的幾種植物固定化生物反應器系統(tǒng)附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)——膜生物反應器常用中空纖維和螺線式卷繞反應器。缺點：傳質(zhì)效率低、易阻塞，產(chǎn)物收獲較困難，投資大。

膜反應器的優(yōu)點是可以重復使用，因此，盡管投資較大，仍較經(jīng)濟。另外，由于植物細胞代謝不像微生物那樣旺盛，因而可以采用更厚的細胞層。細胞細胞營養(yǎng)物入口營養(yǎng)物入口營養(yǎng)物出口營養(yǎng)物出口營養(yǎng)物質(zhì)a-中空纖維反應器b-螺線式卷繞反應器四、產(chǎn)物的分離純化（不作要求）1、細胞破碎2、沉淀分離3、層析分離4、萃取分離5、結(jié)晶6、濃縮與干燥8、抽提

在培養(yǎng)體系中加入脂溶性有機物，或是具有吸附作用的多聚化合物