誘導(dǎo)多能干細胞

關(guān)于誘導(dǎo)多能干細胞第一頁，共三十三頁，2022年，8月28日IPS細胞的定義

通過一定的途徑將與細胞多能性有關(guān)的基因?qū)氲揭逊只捏w細胞中，或者同時添加一些輔助作用的小分子化合物使體細胞去分化重編程回到胚胎干細胞狀態(tài)，所獲得的細胞即為IPS細胞。

IPS細胞與胚胎干細胞（ES）形態(tài)相似、核型、端粒酶活性、體外分化潛能均相同，同時也能夠表達相同的表面標志分子。第二頁，共三十三頁，2022年，8月28日誘導(dǎo)多功能干細胞技術(shù)的理論及基礎(chǔ)體細胞重編程現(xiàn)象：從Briggs和King通過核移植的方法獲得來自囊胚的克隆蝌蚪到克隆羊“多莉”的誕生為已經(jīng)分化了的細胞能夠去分化和重新編程提供大量證據(jù)。第三頁，共三十三頁，2022年，8月28日誘導(dǎo)多功能干細胞技術(shù)的理論及基礎(chǔ)

多能干細胞的特異調(diào)控網(wǎng)：Oct4,Sox2和Nanog等構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)，通過對下游基因的激活及抑制在維持ES細胞的多能性和自我更新中發(fā)揮作用。第四頁，共三十三頁，2022年，8月28日

小鼠和人誘導(dǎo)多功能干細胞技術(shù)的誕生1.小鼠IPS細胞的誕生:2006年Yamananka研究組用Oct4,Sox2,c-Myc及Klf4四個轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)MEFS重編程至多功能干細胞狀態(tài)。2.人的IPS細胞誕生:Yamanaka實驗組將轉(zhuǎn)錄因子Oct4,Sox2,Klf4及c-Myc以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體誘導(dǎo)人類表皮細胞及結(jié)締組織細胞重編程為IPS細胞。第五頁，共三十三頁，2022年，8月28日iPS細胞誘導(dǎo)機制已分化的細胞導(dǎo)入病毒基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4病毒逆轉(zhuǎn)錄胚胎干細胞培養(yǎng)條件和篩選Ips細胞第六頁，共三十三頁，2022年，8月28日構(gòu)建IPS細胞示意圖第七頁，共三十三頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄因子Oct4:Oct4能夠促使ICM的形成，維持ES細胞未分化狀態(tài)并促使其增值，是細胞全能性的標志基因之一。第八頁，共三十三頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄因子Sox2:Sox2通常與Oct4結(jié)合形成Oct4/Sox2蛋白復(fù)合體調(diào)控FGF4，UTF1等因子來維持ES細胞的全能性。第九頁，共三十三頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄因子C-Myc:c-Myc是一種最容易過渡表現(xiàn)于人類的致癌基因，它對某些成體干細胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES細胞的分化。第十頁，共三十三頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄因子Klf4:Klf4上皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子Klf4(舊稱GKLF)調(diào)節(jié)體外細胞的增生與分化.第十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄因子Nanog:對促分化基因的抑制方面發(fā)揮作用。第十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日其他的轉(zhuǎn)錄因子

Lin28,SV40LargeTantigen,UTFI等等第十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日IPS過程中轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用在維持ES細胞特性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及染色質(zhì)調(diào)控相關(guān)的基因都受到Oct4,Sox2,Nanog和其他多能相關(guān)因子的調(diào)控，并且這些調(diào)控因子即能相互調(diào)控又能調(diào)控自身的表達，這樣就組成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。第十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日IPS技術(shù)的關(guān)鍵因素1.獲得初始的體細胞為重編程靶細胞2.構(gòu)建誘導(dǎo)重編程因子的載體3.攜重編程因子的載體作用于體細胞4.IPS細胞的獲得，鑒定及培養(yǎng)體系的建立第十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日誘導(dǎo)IPS細胞的實驗流程第十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日靶細胞的選擇

1.靶細胞類型影響重編程效率

2.靶細胞類型影響嵌合鼠的成瘤率第十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日載體的選擇病毒慢病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒：共同缺陷1.病毒的隨機插入及病毒表達不可調(diào)控2。病毒如果不能沉默就會導(dǎo)致外源基因的持續(xù)表達3.病毒的重新激活會導(dǎo)致腫瘤相關(guān)基因c-Mycj及Klf4的重新表達?？烧T導(dǎo)病毒表達系統(tǒng)：這個系統(tǒng)無法避免病毒對宿主細胞基因組的隨機組合多順反子及剪切體系：減少病毒的插入位點，保障所有轉(zhuǎn)錄因子在同一受染細胞內(nèi)的同時表達，且表達量可以實現(xiàn)一定的平衡。Cre-LoxP重組剪切系統(tǒng)：實現(xiàn)對外源基因表達的調(diào)控及切除外源的原癌基因腺病毒：避免病毒載體插入宿主細胞基因組可能引起的基因突變等后果。但是編程效率低。第十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日載體的選擇質(zhì)粒普通質(zhì)粒載體：需要反復(fù)多次的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來實現(xiàn)質(zhì)粒攜帶基因的持續(xù)表達，效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。轉(zhuǎn)座子：能夠攜帶較的整合片段，可以通過轉(zhuǎn)座子酶切除轉(zhuǎn)座子攜帶的外源基因。附著體：提高重編程效率，可以獲得不含質(zhì)粒的宿主細胞。第十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日介導(dǎo)IPS的參與因素蛋白質(zhì)：安全性高，穿越細胞膜的能力有限。小分子化合物：有可能帶來細胞毒性和無法檢測得微小變化microRNA:替代了原癌基因，提高了編程效率IPS第二十頁，共三十三頁，2022年，8月28日IPS細胞的篩選方法a.形態(tài)學(xué)篩選不對供體細胞做任何額外遺傳修飾的情況下，僅依靠形態(tài)學(xué)篩選的標準對細胞進行篩選也能夠分離出IPS細胞。

b.藥物篩選利用基因重組技術(shù)建立了具有藥物抗性基因的體細胞，并用特定藥物進行篩選。

c.選用對多能性更為關(guān)鍵的基因（如Fbx25）作為報告基因原理是Fbx25對于多能性的維持和胚胎的發(fā)育來說是不可缺少的基因第二十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日IPS細胞的鑒定表觀遺傳狀態(tài)鑒定:IPS細胞與ES細胞具有相似的DNA甲基化模式和組蛋白修飾情況。IPS細胞中的多能基因，如oct-4，Nanong等的啟動子區(qū)域CpG島從高甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃艵S細胞的低甲基化狀態(tài)。

IPS細胞的多能基因啟動子區(qū)域具有與ES細胞相同的高H3K4Me3及低H3K27Me3水平。第二十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日IPS細胞的鑒定

基因表達模式和發(fā)育潛能鑒定

ES和IPS細胞基因表達譜基本相同。IPS細胞具有發(fā)育為三個胚層的能力，并能參與生殖系的發(fā)育，這與ES細胞相同。第二十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日IPS細胞的鑒定表面標志分子鑒定:

IPS細胞能夠表達多能干細胞特異的表面標志分子，如：ssea-1（階段特異性胚胎抗原1），ssea-3等。這些物質(zhì)在已分化體細胞表面不表達，從而鑒定。第二十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日IPS細胞的鑒定基因表達模式和發(fā)育潛能鑒定ES和IPS細胞基因表達譜基本相同。IPS細胞具有發(fā)育為三個胚層的能力，并能參與生殖系的發(fā)育，這與ES細胞相同。第二十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日信號通路信號通路TGF-P信號通路MEK和GSK3信號通路Wnt信號通路是維持人類ES細胞多能性的主要信號通路。MEK信號通路：促進肝細胞分化。GSK3信號通路：抑制細胞增值。提高無c-Myc參與的OSK介導(dǎo)的IPS的效率。第二十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日IPS技術(shù)的應(yīng)用及其意義1.基于IPS細胞的細胞移植治療2.人類疾病模型，病人特異的疾病及藥物篩選3.重編程機理解析4.新物種的多能肝細胞第二十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日基于IPS細胞的細胞移植治療人類IPS細胞走向臨床應(yīng)用面臨著免疫排斥的困難，而IPS技術(shù)有望解決這一難題。第二十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日人類疾病模型，病人特異的疾病及藥物篩選IPS最大的特點是“患者特異性”及“疾病特異性”，基于這兩點。IPS細胞可以重現(xiàn)患者的疾病發(fā)生，發(fā)展過程，可作為人類疾病發(fā)生發(fā)展的機理，并篩選出患者特異的有效藥物，最終找到疾病治療的切入點。第二十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日IPS細胞在疾病研究中的作用第三十頁，共三十三頁，2022年，8月28日重編程機理解析以IPS技術(shù)為基礎(chǔ)，篩選在體細胞重編程過程中起關(guān)鍵作用的基因，蛋白和小分子化合物，并利用這些物質(zhì)相關(guān)的信號通路及上