綜述桂花在花色、花香等方面的基因工程研究進展,基因工程論文

綜述桂花在花色、花香等方面的基因工程研究進展,基因工程論文內容摘要：桂花是重要的園林經濟樹種,加強其快速繁衍和新品種培育對推進桂花產業(yè)發(fā)展具有重大意義.文章根據近30年的桂花組織培養(yǎng)研究成果,分析了影響桂花胚、莖尖、莖段、葉片及花梗等不同外植體培養(yǎng)的因素,并綜述了桂花在花色、花香等方面的基因工程研究進展,以期為桂花的分子育種工作提供參考.本文關鍵詞語：胚培養(yǎng);莖尖培養(yǎng);莖段培養(yǎng);桂花;AdvancesinTissueCultureandGeneticEngineeringonOsmanthusfragransCHENSiHUANGZhouYANGMengtingPANGJiliangGANJianpingXUJunchiSchoolofLifeandEnvironmentalSciences,HangzhouNormalUniversityKeyLaboratoryofEconomicForestGermplasmImprovementandResourcesComprehensiveUtilization,HubeiCollaborativeInnovationCenterfortheCharacteristicResourcesExploitationofDabieMountains,HuanggangNormalUniversityAbstract：OsmanthusfragransisanimportanteconomicgardentreeinChina.ItisofgreatsignificancethattheresearchofitsrapidpropagationandbreedingarecarriedouttopromotethedevelopmentofO.fragransindustry.AccordingtothetestdataoftissuecultureinO.fragransforrecentthirtyyears,thesuccessfulcultivationfactorsofdifferentexplants,suchasembryo,stemapex,stemsegments,leafandstalkareanalyzed.TheoverviewofrecentadvancesonO.fragransgeneticengineeringinflowercolorandfragranceisprovided,whichisaimedtoprovidereferenceforthemolecularbreedingofO.fragrans.Keyword：embryoculture;stemapexculture;stemsegmentculture;Osmanthusfragrans;桂花(OsmanthusfragransLour.)又名九里香、木犀等,是我們國家傳統(tǒng)十大名花之一,系木犀科常綠灌木或小喬木,分為金桂、銀桂、丹桂、四季桂和彩葉桂5個品種群[1].桂花在我們國家已有2500多年的栽培歷史,為亞熱帶短日照植物,廣泛栽培于長江流域及其以南地區(qū),并且構成了四川、浙江、廣西、湖南、湖北、安徽等重點產區(qū)[2].桂花是香花植物中最具觀賞和實用價值的植物,不僅在園林和庭院的綠化、美化及香化上具有特殊地位,而且能夠用來提取香精,制作桂花酒、桂花糕等,果實能夠榨油,桂木亦可制作家具,能夠講渾身是寶[3].自進入21世紀以來,我們國家桂花研究在資源、品種、栽培、繁衍、育種、發(fā)育、花香、切花、文化等各個領域全面展開,且獲得了明顯成果,再加上2004年我們國家獲得木犀屬栽培植物國際登錄權威,更是極大推進了我們國家桂花產業(yè)的蓬勃發(fā)展[4].本文綜述了桂花組織培養(yǎng)和基因工程的研究現在狀況及其存在的問題,以期為后續(xù)的桂花分子育種等研究工作提供參考.1桂花組織培養(yǎng)研究進展木本植物的組織培養(yǎng)再生途徑能夠分為兩類[5]:一是器官發(fā)生,包括外植體直接分化成器官的直接發(fā)生和外植體先脫分化構成愈傷組織再分化成器官的間接發(fā)生;二是胚狀體發(fā)生,指外植體根據胚胎發(fā)生方式構成再生植株.迄今關于桂花的組織培養(yǎng)已經積累了不少經歷體驗,本文就桂花胚、莖尖和莖段、葉片和花梗的培養(yǎng)進行綜述.為方便查閱,本課題組將已收集到的資料編成名錄(表1),總結了桂花組培外植體的取材部位、品種、初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基及再生方式等.表1桂花組織培養(yǎng)名錄Tab.1DirectoryoftissuecultureonO.fragrans注:1.O1為器官直接發(fā)生途徑,O2為器官間接發(fā)生途徑,E為胚狀體途徑.2.培養(yǎng)基B5+6-BA1.0+GA3.0表示B5+6-BA1.0mg/L+GA3.0mg/L,以此類推.表1桂花組織培養(yǎng)名錄Tab.1DirectoryoftissuecultureonO.fragrans注:1.O1為器官直接發(fā)生途徑,O2為器官間接發(fā)生途徑,E為胚狀體途徑.2.培養(yǎng)基B5+6-BA1.0+GA3.0表示B5+6-BA1.0mg/L+GA3.0mg/L,以此類推.1.1桂花胚培養(yǎng)胚的發(fā)育時期和取材時間是影響其組培成功的關鍵因素之一.桂花胚發(fā)育時期為:當年12月上旬,原胚發(fā)育至球形胚;12月下旬至次年1月上旬,發(fā)育至心形胚;1月下旬至2月上旬,發(fā)育至魚雷狀胚;2月下旬至3月上、中旬,幼胚的發(fā)育基本完成,構成成熟胚[33].袁王俊[34]對5個時期的桂花胚(球形胚、魚雷胚、胚乳尚未硬化、胚乳硬化、果皮發(fā)紫)進行離體培養(yǎng),發(fā)現桂花胚適宜的取材時間是胚乳完全硬化到果實完全成熟之間,即3月中上旬,此時胚生理上雖未成熟,但形態(tài)上已經成熟,呈乳白色,長5mm左右,子葉明顯.胚在接種前經過適當的預處理,如低溫、枯燥、光照等,能夠增加萌發(fā)率和出愈率[35].梁茂廠[12]發(fā)現種子4℃冷藏處理210d能有效打破種胚的自然休眠,促進種子提早萌發(fā).鑒于桂花種子有一層堅硬的內果皮包被,種胚極少受外界細菌的污染,所以多數研究對去掉外果皮的種子采用的滅菌方式為:75%酒精浸泡30~60s后,0.1%升汞溶液消毒3~6min.這樣既能降低污染率、褐化率,又能保證外植體的活力.誘導桂花胚離體培養(yǎng)構成組培苗常采用器官直接再生和間接再生兩種方式,如表1所示.袁王俊[34]比擬MS、B5和DCR3種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果時,發(fā)現胚在B5中的生長狀況更好.韓瑞超[31]則發(fā)現桂花幼胚在MS和B5這兩種培養(yǎng)基上的萌發(fā)率不存在顯著性差異,但胚在MS中的長勢優(yōu)于B5.劉友全等[8]也發(fā)現相較于B5和LMc,MS更有利于促進幼胚苗正常生長.就培養(yǎng)基而言,MS和B5中都含有較高濃度的無機鹽,只是B5中銨鹽的濃度較低,但兩者都能夠知足幼胚萌發(fā)初期對礦質營養(yǎng)的需求.至于培養(yǎng)基中的激素配比研究,即細胞分裂素/生長素的相對濃度設置,均圍繞Skoog和Miller的激素平衡學講展開.桂花組織培養(yǎng)中,常用的細胞分裂素有6-BA(6-benzylaminopurine,6-芐氨基嘌呤)、KT(kinetin,沖動素)、ZT(zeatin,玉米素)和TDZ(thidiazuron,N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲),生長素有NAA(-naphthaleneaceticacid,萘乙酸)、2,4-D(2,4-dichlorophenoxyaceticacid,2,4-二氯苯氧乙酸)和IBA(indole-3-butyricacid,吲哚丁酸).在桂花胚直接分化的初代培養(yǎng)中,細胞分裂素是主要因素,由于胚內可能存在某種抑制物,例如ABA,它會導致種子休眠,而6-BA能夠促進ABA的降解,解除種子的休眠,促使胚提早萌發(fā)[11,36],或者配合使用一定濃度的GA也能到達目的[10];生長素的作用是次要的,鄧黎[9]所做的6-BA和NAA穿插因子試驗顯示,在基本培養(yǎng)基中只施加1.5mg/L6-BA最有利于胚的啟動.其他研究者也以為,1.0~2.0mg/L的6-BA有利于胚的萌發(fā)[8].而在誘導桂花胚脫分化構成愈傷組織時,生長素是必不可少的,不過應控制在0.1~0.5mg/L.李球紅等[14]發(fā)現胚在1/2MS+0.5mg/LTDZ+0.1mg/LNAA培養(yǎng)基上,愈傷化率可達100%,而且構成的愈傷在這里培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)多代后能分化出叢生芽.不同品種的桂花在一樣的培養(yǎng)基上,其生長狀況和芽分化也是不同的,講明外植體基因型的差異也會影響培養(yǎng)效果.至于胚幼苗的伸長生長,多使用MS(B5)+2.0mg/LGA[8,9].在生根方面,研究者的結果比擬一致,培養(yǎng)基為1/2MS(B5)+2~3mg/LNAA+0~0.05mg/L6-BA[6,7,8,9,10,11,12].另外,切掉部分胚根有利于側根發(fā)育,根數增加[10].通過胚狀體途徑誘導桂花胚產生胚性愈傷組織,然后生成植株的研究則比擬少,當前國內外僅見3篇報道[15,16,17].綜合三者的研究發(fā)現,金桂合子胚的子葉端是誘導體細胞胚的良好外植體,MS培養(yǎng)基比WPM、B5更有助于胚性愈傷組織構成,初代培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D或者MS+0.5mg/LKT+1.5mg/L2,4-D時都能使胚性愈傷組織誘導率高達83%以上,在繼代培養(yǎng)中則以不添加任何植物激素的MS培養(yǎng)基更有利于體細胞胚的構成和發(fā)育.1.2桂花莖尖和莖段的組織培養(yǎng)袁王俊等[20]比擬了休眠芽、萌發(fā)芽和當年生幼枝三者的莖尖組培差異,結果發(fā)現:正在萌發(fā)芽和尚未停止生長的幼枝頂芽是較好的莖尖取材材料.休眠芽由于長時間暴露在空氣中,易感染病菌,所需消毒時間較長,且存活率較低,不宜作為莖尖組培材料.莖尖采用的消毒方式和胚類似,萌發(fā)芽以升汞處理5min為好,存活率可達94.1%[20];嫩枝以不經過乙醇處理、升汞直接消毒2.5min最佳,存活率可達95.6%[18].在桂花莖尖的初代培養(yǎng)中,袁王俊[34]發(fā)現適宜的基本培養(yǎng)基是B5,而以MS為培養(yǎng)基時,無論是冬季休眠芽還是萌發(fā)芽都不能萌發(fā),且DCR的培養(yǎng)效果也不佳.該研究還確定了休眠芽、萌發(fā)芽和幼枝頂芽離體啟動培養(yǎng)所需的6-BA濃度,隨著芽在植株上的萌發(fā)和抽枝,所需要的6-BA濃度逐步降低,除此之外三者的萌發(fā)能力表現為萌發(fā)芽幼枝頂芽休眠芽.組織培養(yǎng)中基因型的差異會影響再生能力是一種常見現象,表現為種間、品種間的再生能力有較大差異,因而在選擇激素配比時也要考慮這一因素.蔡新玲[29]以金桂、銀桂、丹桂、四季桂4種桂花品種群的莖尖為試材,分析比擬了基本培養(yǎng)基(B5、LMc)和不同濃度6-BA及NAA對莖尖叢生芽誘導的影響,結果發(fā)現,金桂的最佳培養(yǎng)基為B5+2.0mg/L6-BA+0.12mg/LNAA,銀桂為B5+7.0mg/L6-BA+0.12mg/LNAA,丹桂為B5+7.0mg/L6-BA,四季桂僅分化出少量叢生芽;品種群之間的萌芽率優(yōu)勢差異表現為金桂銀桂丹桂四季桂.莖段培養(yǎng)的取材部位主要是帶腋芽的新梢莖段,宋會訪[7]探究了不同取材時間(2月下旬、3月上旬和3月下旬)對桂花新梢初代培養(yǎng)的影響,發(fā)現最佳的取材時間為2月下旬,而3月下旬不合適桂花莖段培養(yǎng)取材,取材的污染率、褐變率都比擬高.這一結果也反映了桂花在其生長開場的季節(jié)取材較好,在生長期或已進入休眠期取材則因外植體在培養(yǎng)中污染率高、褐化率高和反響遲鈍而不能培養(yǎng)成功.桂花莖段在空氣中由于暴露時間較長且具有皮孔易含內生菌,所需的升汞消毒時間較長,一般10min左右[21,22,23,24,25,26].梁茂廠[12]比擬了MS、B5和WPM對莖段萌發(fā)的影響,結果發(fā)現B5培養(yǎng)效果最好.而呂志鵬[25]的研究結果則表示清楚MS相較于B5和改進的MS而言更有利于莖段不定芽誘導和愈傷誘導.不過歸納來看,莖段初代培養(yǎng)多項選擇擇MS.宋會訪等[24]以金桂為試材,探究發(fā)現KT誘芽效果比TDZ好,新梢莖段在LMc+8.0mg/LKT+0.1mg/LNAA的培養(yǎng)基上萌芽快且腋芽長而粗壯,而TDZ誘導的莖段切口處產生大量的愈傷,抑制了芽的萌發(fā),因而TDZ更合適莖段愈傷組織誘導.1.3桂花葉片和花梗的組織培養(yǎng)桂花葉片和花梗的組織培養(yǎng)不同于胚、莖尖和莖段,只能通過愈傷誘導再分化芽.胡甜甜等[28]以桂花幼嫩花梗和葉片為外植體,發(fā)現花梗最佳消毒方式為5%NaClO消毒3min,葉片最佳消毒方式為0.1%HgCl2消毒5min.在葉片取材方面,以新生幼嫩的葉片為宜.另外,李林[30]]發(fā)如今同一激素配比的培養(yǎng)基中,同一葉片不同位置的出愈情況是一樣的,并沒有由于位置不同而產生不同的分化.葉片的腹面朝上和反面朝上這兩種接種方式對愈傷組織誘導也沒有顯著影響[31]].蔡新玲[29]以丹桂葉片為試材探究發(fā)現,葉片在B5培養(yǎng)基上出愈率最高,而在MS和LMc兩種培養(yǎng)基上未誘導出愈傷.梁茂廠[12]也比擬了MS、B5和WPM對金桂葉片愈傷的誘導,結果表示清楚B5和WPM是較適宜培養(yǎng)基.在激素配置上,詳細用量要考慮到組織內源激素和外源激素效應的總和.蔡新玲[29]發(fā)現合適金桂葉片愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為B5+1.0mg/L6-BA+0.6mg/L2,4-D,出愈率可達92%;梁茂廠[12]卻以為金桂葉片最適誘導配方為B5+1.5mg/L6-BA+0.12mg/L2,4-D,出愈率可達100%.二者6-BA和2,4-D相對用量的差異,是源于研究時所選取的品系材料、激素濃度梯度以及試驗方式方法等多因素的差異,講明任何一種材料組織培養(yǎng)的最適配方并不是絕對的,詳細試驗應用時需考慮相對條件.彭盡暉等[32]以四季桂幼嫩花梗為試材,培養(yǎng)在MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/L2,4-D上,出愈率可達85.17%.該研究還發(fā)現,繼代培養(yǎng)中采用2,4-D,愈傷增殖率雖高,但易使細胞老化,喪失活力.韓瑞超[31]也證明了2,4-D不利于桂花幼葉愈傷的生長與增殖.當前還沒有關于桂花葉片、花梗及莖段愈傷再分化出芽的報道,對愈傷的研究停留在繼代增殖階段.不過,王珍華等[27]以大花金桂的子葉為外植體,在1/2MS+0.5mg/LTDZ+0.1mg/LNAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)多代后成功實現了桂花愈傷組織分化成苗.這反映了不同桂花組織誘導的愈傷存在某些特性,需要擴大實驗因素范圍,使用更多外源激素和其他添加物,探尋求索芽點構成的條件.2桂花基因工程研究進展基因工程操作包括上游的基因克隆和下游的遺傳轉化,通過將某些功能基因導入植物體內使其性狀穩(wěn)定表示出是當代植物育種中的一種重要手段.當前桂花基因工程研究多集中在基因克隆方面,而鮮有桂花遺傳轉化的報道.2.1桂花基因的克隆NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,美國國家生物技術信息中心)收錄的桂花基因序列主要與花色和花香相關.桂花花色主要由類黃酮和類胡蘿卜素兩類物質決定,當前這兩者的生物合成途徑解析得較為透徹,牽涉多個代謝步驟、多種酶催化,以及與之相關的基因調控.桂花類黃酮生物合成代謝途徑中OfPAL、Of4CL、OfC4H、OfCHS、OfCHI、OfDFR、OfANS和OfMYB1等關鍵構造基因[37,38,39,40,41,42,43],以及類胡蘿卜素生物合成代謝途徑中OfCCD1、OfCCD4、OfPSY、OfPDS、OfZDS和OfZ-ISO等關鍵構造基因[44,45,46,47]相繼被克隆和研究.通過分析桂花花色素構造基因的作用特性,就能夠借助反義RNA技術、外源基因插入、核酶抑制及共抑制作用等方式方法[48]順勢改造桂花花色,培育出更多更有觀賞價值的新品種.植物花香物質主要分為3大類:萜類、苯基/苯丙烷類、脂肪酸衍生物.萜類化合物是植物花香物質中最大的類群,也是很多植物香味物質的主要成分[49].在桂花中,一些與萜類化合物合成相關的基因已被成功克隆,如OfTPS、OfDXS、OfGES、OfADH、OfDXPS、OfAACT和OfLIS等[50,51,52,53,54,55].這些關鍵基因的分離,為桂花香氣品質遺傳改進提供了可能.從分子水平對植物花香進行改進主要有兩種方式方法:一是引入花香相關的外源基因;二是調控內源相關基因的表示出.但是此經過需要注意:一是從轉化植株中產生的芳香揮發(fā)物可能被修飾成非揮發(fā)性的物質;二是在轉化植株中缺少適宜的底物產生相應芳香揮發(fā)物;三是即使在轉化植株中產生揮發(fā)性物質,可以能缺乏以被人類的嗅覺所感悟[56].2.2桂花遺傳轉化的研究木本植物轉基因操作中應用比擬成熟的技術主要是農桿菌介導法,該技術已經在楊樹、番木瓜、蘋果等多種木本植物中得到成功的應用[57].除此之外也有用基因槍法、電擊法和PEG(polyethyleneglycol)法進行轉化.固然有研究者對桂花轉基因進行了試驗,但當前未見轉化成功的報道.本課題組在建立桂花遺傳轉化體系方面做過不少嘗試.李球紅[58]構建了FYF(FOREVERYOUNGFLOWER)的過表示出載體,擬將其轉入桂花中以得到花期延長的新品種.試驗采用綠梗籽銀桂、廬州黃籽銀桂和蓮籽丹桂的幼胚,以及大花金桂子葉切塊和天香臺閣花芽的愈傷作為轉化受體材料,利用超聲波輔助的農桿菌介導法進行轉化,固然得到了抗性愈傷,但愈傷褐化率較高且基本不分化.因而,利用轉基因技術對桂花進行品種改進任重道遠,外植體的取材、培養(yǎng)基的激素配比、轉化方式方法的選取以及褐化的控制等條件仍需進一步探尋求索.3瞻望桂花在園林綠化上雖應用廣泛,具有眾多優(yōu)點,但也存在些許缺乏.例如,桂花單朵花期極短,僅7d左右,使其美化、香化功能遭到了限制;其次香氣馥郁的桂花品種主要是金桂和銀桂這兩類秋桂品種群,四季桂除了天香臺閣等品種外鮮有香氣濃郁的,也限制了其香化的功用;桂花的抗寒能力弱,長江以北難以栽培.因而,怎樣培育出花期長、抗寒能力強的桂花新品種,是今后桂花育種中的長期課題.建立成熟的遺傳轉化體系的第一步是建立高效的離體快繁體系.桂花組織培養(yǎng)研究雖獲得了不少進展,但仍存在外植體增殖率低、胚性愈傷誘導分化體系不成熟等問題,因而仍需加強桂花組織培養(yǎng)研究,為桂花分子育種研究奠定基礎.以下為參考文獻[1]向民,段一凡,向其柏.木犀屬品種國際登錄中心年報(1)彩葉桂品種群的建立[J].南京林業(yè)大學學報(自然科學版),2020,38(1):2.[2]朱文江.我們國家桂花的地理分布及其開花之生態(tài)環(huán)境的討論[J].上海農學院學報,1987,5(3):243-250.[3]向其柏,劉玉蓮.中國桂花品種圖志[M].杭州:浙江科學技術出版社,2008.[4]葉小梅,梁如煜,余義勛.桂花幾個方面的研究進展[J].廣東林業(yè)科技,2007,23(2):77-80.[5]許智宏.經濟植物組織培養(yǎng)[M].北京:科學出版社,1988.[6]秦新民.桂花成熟胚的組織培養(yǎng)[J].植物雜志,1987(5):3.[7]宋會訪.桂花組織培養(yǎng)技術體系的研究[D].武漢:華中農業(yè)大學,2004.[8]劉友全,梁茂廠,陳躍華.桂花離體胚的組織培養(yǎng)[J].經濟林研究,2008,26(2):12-16.[9]鄧黎.早花籽金桂離體胚的組培快繁技術研究[D].雅安:四川農業(yè)大學,2018.[10]馬燕,韓瑞超,臧德奎,等.桂花幼胚的離體培養(yǎng)及生根誘導[J].山東農業(yè)科學,2020,45(3):7-10.[11]袁王俊,董美芳,尚富德.桂花胚的離體培養(yǎng)[J].園藝學報,2005,32(6):1136-1139.[12]梁茂廠.桂花組織培養(yǎng)快繁技術的研究[D].長沙:中南林業(yè)科技大學,2008.[13]劉萍,袁王俊.桂花愈傷組織的誘導與增殖[J].安徽農業(yè)科學,2008,36(34):14889-14890.[14]李球紅,宋華東,周文怡,等.桂花幼胚離體培養(yǎng)構成叢生苗[J].杭州師范大學學報(自然科學版),2021,14(5):507-510.[15]鄒晶晶.桂花未成熟合子胚誘導體細胞胚再生[C]//中國園藝學會觀賞園藝專業(yè)委員會.中國觀賞園藝研究進展2021.廈門:中國園藝學會觀賞園藝專業(yè)委員會,2021:238-242.[16]袁斌.金桂體細胞胚發(fā)生的研究[C]//中國園藝學會觀賞園藝專業(yè)委員會.中國觀賞園藝研究進展2021.廈門:中國園藝學會觀賞園藝專業(yè)委員會,2021:579-585.[17]ZOUJJ,GAOW,CAIX,etal.SomaticembryogenesisandplantregenerationinOsmanthusfragransLour.[J].PropagationofOrnamentalPlants,2020,14(1):32-39.[18]李林,韓遠記,袁王俊,等.桂花組織培養(yǎng)快繁體系的建立[J].河南大學學報(自然科學版),2020,43(6):667-671.[19]蔡新玲,胡蕙露,傅松玲.四種桂花莖尖培養(yǎng)試驗初報[J].浙江林業(yè)科技,2006,26(5):24-27.[20]袁王俊,張維瑞,尚富德.桂花莖尖離體培養(yǎng)體系的建立[J].西北植物學報,2008,28(2):244-248.[21]秦新民.桂花的組織培養(yǎng)[J].植物生理學通訊,1988(3):55.[22]王彩云,白吉剛,楊玉萍.桂花的組織培養(yǎng)[J].北京林業(yè)大學學報,2001,23(S2):24-25.[23]何鋼,燕亞飛,劉賢桂,等.金獅桂花叢生芽的誘導[J].中南林業(yè)科技大學學報,2007,27(4):28-32.[24]宋會訪,葛紅,周媛,等.桂花離體培養(yǎng)與快速繁衍技術的初步研究[J].園藝學報,2005,32(4):738-740.[25]呂志鵬.金桂的組織培養(yǎng)與快速繁衍[J].安徽農學通報,2020,18(8):27.[26]張麗霞,王毅彰.桂花的離體快繁技術[J].江蘇農業(yè)科學,2020,41(3):42-43.[27]王珍華,龐基良,陳益紅,等.桂花子葉切塊培養(yǎng)再生苗的研究[J].北方園藝,2020(9):126-128.[28]胡甜甜,王亞莉,楊秀蓮,等.桂花花梗與葉片的愈傷組織誘導研究[J].北方園藝,2021(19):95-101.[29]蔡新玲.不同桂花品種群組織培養(yǎng)的研究[D].合肥:安徽農業(yè)大學,2007.[30]李林.桂花無性繁衍技術研究[D].開封:河南大學,2020.[31]韓瑞超.桂花幼胚培養(yǎng)與愈傷組織誘導及分化[D].泰安:山東農業(yè)大學,2020.[32]彭盡暉,呂長平,周晨.四季桂愈傷組織誘導與繼代培養(yǎng)[J].湖南農業(yè)大學學報(自然科學版),2003,29(2):131-133.[33]楊琴軍,黃燕文,李和平.桂花胚和胚乳發(fā)育經過的研究[J].華中農業(yè)大學學報,2003,22(2):175-178.[34]袁王俊.桂花(OsmanthusfragransLour.)組織培養(yǎng)的研究[D].開封:河南大學,2005.[35]左靜靜,劉少翔,閆貴云,等.小麥幼胚組織培養(yǎng)研究進展[J].中國農學通報,2018,26(19):81-87.[36]趙淑清,郭劍波,常留印.植物生長調節(jié)劑對離體培養(yǎng)早熟杏胚休眠的破除[J].果樹學報,2001,18(2):84-86.[37]張威威,許鋒,張芙蓉,等.桂花苯丙氨酸解氨酶基因的克隆與序列分析[J].華北農學報,2018,25(5):56-60.[38]母洪娜,孫陶澤,徐晨,等.桂花(OsmanthusfragransLour.)4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)基因克隆與表示出分析[J].分子植物育種,2021,14(3):536-541.[39]曾祥玲,鄭日如,羅靖,等.桂花C4H基因的克隆與表示出特性分析[J].園藝學報,2021,43(3):525-537.[40]徐秀榮,馬燕,臧德奎.桂花查耳酮合酶chs基因的克隆及序列分析[J].中國農學通報,2021,32(1):118-124.[41]張水明,涂佳麗,阿不都熱扎克依沙克,等.桂花查爾酮異構酶OfCHI基因的克隆與表示出分析[J].西北植物學報,2021,36(9):1728-1734.[42]徐秀榮.桂花CHS、DFR基因全長克隆、表示出分析及表示出載體構建[D].泰安:山東農業(yè)大學,2021.[43]HANYJ,CHENWC,YANGFB,etal.cDNA-AFLPanalysison2osmanthusfragranscultivarswithdifferentflowercolorandmolecularcharacteristicsofOfMYB1gene[J].Trees,2021,29(3):931-940.[44]BALDERMANNS,KATOM,KUROSAWAM,etal.Functionalcharacterizationofacarotenoidcleavagedioxygenase1anditsrelationtothecarotenoidaccumulationandvolatileemissionduringthefloraldevelopmentofOsmanthusfragransLour.[J].JournalofExperimentalBotany,2018,61(11):2967-2977.[45]HUANGFC,MOLNRP,SCHWABW.Cloningandfunctionalcharacterizationofcarotenoidcleavagedioxygenase4genes[J].JournalofExperimentalBotany,2018,60(11):3011-3022.[46]HANYJ,WANGXH,CHENWC,etal.Di