第二十章常用分子生物學技術(shù)的原理及其應(yīng)用

生物化學與分子生物學張金玉常用分子生物學技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第二十章常用分子生物學技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理復(fù)性RNADNA（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。目前這種技術(shù)已廣泛用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)的檢測。常用的固相支持物硝酸纖維素膜、尼龍膜、化學活化膜。轉(zhuǎn)膜的方法1、毛細管虹吸法：利用高鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用和虹吸作用。雖轉(zhuǎn)移率不高，但應(yīng)用廣泛。2、電轉(zhuǎn)印法：利用電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到膜上。適用于轉(zhuǎn)移大片段DNA。3、真空轉(zhuǎn)移：原理同毛細管虹吸，需真空泵。用放射性核素、生物素或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術(shù)探針的種類人工合成的寡核苷酸片段、基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段。探針的標記物1、核素標記物：（放射性同位素）靈敏度高，特異性強，常用32P，35S，3H，125I，14C。易造成放射性污染，同位素半衰期短，必須隨用隨標。2、非核素標記物：靈敏度低，特異性差，但無放射性污染，探針標記后可長期保存（2年以上）。常用生物素、地高辛、辣根過氧化物酶（HRP）、熒光素（FITC、羅丹明類）、化學發(fā)光劑。二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡

(Southernblotting)（二）RNA印跡(Northernblotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡

(Westernblotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。（一）DNA印跡

(Southernblotting)1、制備待測DNA，DNA的限制性內(nèi)切酶消化；2、待測DNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳分離；3、凝膠中核酸的原位變性；4、轉(zhuǎn)膜；5、雜交；6、洗膜；7、雜交結(jié)果的檢測-放射自顯影。用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。ＤＮＡ印跡①②③放射自顯影照片SouthernblottingSouthernblotting（二）RNA印跡(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析其技術(shù)原理與Southernblotting相同。RNA分子較小，轉(zhuǎn)移前無需限制酶切割；在變性劑存在下（防止形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)）直接進行瓊脂糖凝膠電泳；電泳結(jié)束后，不需要再進行變性和中和，直接轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移效率也比較高。盡管RNA印跡技術(shù)檢測mRNA表達水平的敏感性較PCR法低，但其特異性強，假陽性率低，仍然被認為是最可靠的mRNA和miRNA定量分析方法之一。（三）蛋白質(zhì)的印跡

(Westernblotting)用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究1、混合蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；2、將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜或其他膜上（電轉(zhuǎn)移）；3、第一抗體首先與轉(zhuǎn)移膜上相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子結(jié)合；4、第二抗體（放射性核素或堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶標記）與之結(jié)合；5、放射自顯影或底物顯色來檢測蛋白質(zhì)區(qū)帶的信號。三種印跡技術(shù)的比較斑點印跡(dotblotting)不經(jīng)電泳分離直接將樣品點在ＮＣ膜上用于雜交分析原位雜交(insituhybridization)

組織切片或細胞涂片直接用于雜交分析DNA芯片技術(shù)(DNAchip)

將多種已知序列的ＤＮＡ排列在一定大小的尼龍膜或其他支持物上用于檢測細胞或組織樣品中的核酸種類。其他：DNA芯片技術(shù)第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnologyPCR（polymerasechainreaction)中文全稱為聚合酶鏈式反應(yīng)，又稱體外DNA擴增技術(shù)。是近年來發(fā)展起來的一種體外擴增特異DNA片段的技術(shù)。PCR技術(shù)是1985年由美國Cetus公司的KaryMullis首創(chuàng)，可以將微量目的DNA片段擴增一百萬倍以上。

PCR具有敏感度高、特異性強、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡便等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于微生物學、考古學、法醫(yī)學及體育等領(lǐng)域，并已普及到許多普通實驗室，大大簡化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，從而比較容易地對目的基因進行分析、鑒定。

KaryMullis本人因此獲1993年諾貝爾化學獎。一、PCR技術(shù)的工作原理

用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA片段，類似于天然DNA的復(fù)制過程。

以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5'末端和3'末端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。PCR的基本反應(yīng)步驟1.變性(Denaturation)：

加熱到94℃使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，同時引物自身以及引物之間存在的局部雙鏈也得以消除。2.退火(復(fù)性)(Annealling):

將溫度下降至適宜溫度（較Tm低5℃-55℃

），模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度，結(jié)構(gòu)簡單的特點，主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。PCR的基本反應(yīng)步驟3.延伸(Extension):將反應(yīng)溫度升至酶的最適溫度72℃

，DNA聚合酶以4種dNTP為底物，以引物的3'端開始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新DNA鏈。

上述3步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25～30個循環(huán)后DNA可擴增106～109倍。

PCR的基本反應(yīng)步驟變性94?C延伸72?C退火55?C5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55目錄PCR技術(shù)的工作原理Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目錄PCR技術(shù)原理示意圖

PCR擴增的特異性是由一對寡核苷酸引物所決定的。反應(yīng)初期，原來的DNA擔負起始模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴增產(chǎn)物是介于兩種引物5'端之間的DNA片段。

模板DNA

PCR技術(shù)對模板質(zhì)和量的要求并不十分嚴格。一般來說宜用ng量的克隆DNA，μg水平的染色體DNA作起始材料。

特異性引物預(yù)擴增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。

耐熱DNA聚合酶（耐熱TaqDNA聚合酶）

dNTPs

Mg2+

緩沖液水

PCR反應(yīng)體系的基本組成成分利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細胞的mRNA為模板獲得目的片段；利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。PCR技術(shù)高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因的體外突變將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。（四）DNA序列測定（五）基因突變分析逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)RT-PCR示意圖原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細胞涂片上的單個細胞內(nèi)進行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細胞中存在。原位PCR方法彌補了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)（三）實時PCR技術(shù)實時PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了mRNA和miRNA水平的快速、準確的定量分析，已經(jīng)在基因診斷方面得到臨床應(yīng)用。實時PCR技術(shù)原理實時PCR的基本原理是引入了熒光標記分子，并使熒光信號強度與PCR產(chǎn)物量成正比，對每一反應(yīng)時刻的熒光信號進行實時分析，即可計算出PCR產(chǎn)物量。也稱為實時熒光定量PCR或熒光定量PCR。實時PCR分類實時PCR非探針類：加入了能與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料，

SYBRGreen-DNA小溝，熒光信號強度與結(jié)合雙鏈DNA量成正比，可實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物量的多少-大量應(yīng)用探針類1.TaqMan探針法2.分子信標探針法3.熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)探針法1、TaqMan探針法5’-熒光報告基團-R3’-熒光淬滅基團-QTaqMan探針：TaqMan探針能與模板DNA特異性結(jié)合。沒有擴增反應(yīng)時，探針保持完整，R和Q同時存在于探針上，無熒光信號釋放；隨著PCR進行，聚合酶在鏈上延伸遇到熒光探針，其5’→3’核酸外切酶活性將探針逐步切斷，R與Q分離，產(chǎn)生熒光信號，被熒光檢測系統(tǒng)接收，用于數(shù)據(jù)分析。TaqMan探針法實時PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標記引物RQ3'3'5'5'TaqMan探針法實時PCR原理示意圖2、分子信標探針法與TaqMan探針法相似，也標記有R和Q基團，但不同的是分子信標探針是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)寡核苷酸探針，即其兩端的核苷酸序列互補配對。探針未與靶序列雜交時形成發(fā)夾狀態(tài)R與Q靠近，熒光幾乎完全淬滅；雜交后，發(fā)夾展開，R與Q分開，熒光得以恢復(fù)，熒光檢測系統(tǒng)即可接收到熒光信號。3、FRET探針法：雙雜交探針或LightCycle探針

有兩條能與模板互補、且相鄰的特異探針組成（1～5bp），上游探針的3’端標記熒光供體基團，下游探針的5’端標記Red640熒光受體基團。復(fù)性時，兩探針同時結(jié)合在模板上，供體基團和受體基團緊密相鄰，激發(fā)供體產(chǎn)生熒光能量被受體基團吸收（發(fā)生FRET），可檢測到Red640發(fā)出的熒光；變性時，兩探針游離，兩熒光基團距離遠，不能檢測到Red640的熒光。

FRET探針法探測的是實時信號，是可逆的，在突變分析、SNP基因分型等方面更具有優(yōu)勢。第三節(jié)基因文庫GeneLibrary基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體?；蚪MDNA文庫的構(gòu)建和篩選分離純化細胞基因組DNA；限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，獲得一定大小的DNA片段（20Kb左右）；選擇載體（噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等）；將基因組DNA片段連接入載體；將重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌可獲得擴增；用探針進行雜交，篩選陽性克隆，獲得目的基因。基因組DNA文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。二、cDNA文庫

cDNA文庫的構(gòu)建和篩選提純組織細胞mRNA；mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；選擇載體（質(zhì)?；蚴删w）；將cDNA連接入載體；將重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌可獲得擴增；用探針進行雜交，篩選陽性克隆，獲得目的基因?；蚪MDNA文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選

cDNA文庫特異地反映某種組織或細胞中，在特定發(fā)育階段表達的蛋白質(zhì)的編碼基因，因此cDNA文庫具有組織或細胞特異性。

cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細胞特異表達的基因。但對

真核細胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從

cDNA文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶有內(nèi)含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA。

cDNA文庫在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態(tài)及表達基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢，從而使它在個體發(fā)育、細胞分化、細胞周期調(diào)控、細胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。第四節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique一、基因芯片基因芯片(genechip)是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)?；蛐酒稍谕粫r間內(nèi)分析大量的基因，實現(xiàn)了基因信息的大規(guī)模檢測?；蛐酒貏e適用于分析不同組織細胞或同一細胞不同狀態(tài)下的基因差異表達情況。一、基因芯片基因芯片(genechip)

基因芯片的原理：雙色熒光探針雜交將兩個不同來源樣品的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時用不同的熒光分子（正常用紅色，腫瘤用綠色）進行標記，標記的cDNA等量混合后與基因芯片進行雜交，在兩組不同的激發(fā)光下檢測，獲得兩個不同樣品在芯片上的全部雜交信號。綠色熒光-該基因只在腫瘤組織表達；紅色熒光-正常組織表達；黃色-兩種組織均表達。雙色熒光標記探針基因芯片工作流程示意圖二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)：抗原-抗體或受體-配體最常用的探針蛋白是抗體。蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。樣品標記法蛋白質(zhì)芯片工作流程示意圖第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

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