第四次分生討論課問題四整合課件

基因工程設計方案

有關該題目的具體分析已知目的基因的cDNA序列(GenBank登錄號:

AK135903.1)，擬采用基因工程技術在哺乳動物細胞中表達該序列中的133-1941位核苷酸序列，請設計實驗方案。該問題我們主要分五個個方面來實行實驗方案1.目的基因的獲取2.表達載體的選擇3.外源基因導入宿主細胞4.目的基因的篩選與鑒定1.目的基因的獲取主要分以下幾個方面進行闡述（1）對資料genebank中的基因的分析（2）cDNA的獲?。?）cDNA的擴增（4）cDNA后續(xù)處理（1）對資料genebank中的基因的分析經過在pubmed中的nucleotide中查找AK135903.1號基因，得到如下結果：MusmusculusinvitrofertilizedeggscDNA,RIKENfull-lengthenrichedlibrary,clone:7420435F10product:zonapellucidaglycoprotein2fullinsertsequence小家鼠體外受精卵的cDNA日本理化研究所全長序列文庫卵透明帶糖蛋白2完整的插入序列以下是查找到的全長基因序列該cDNA序列共2234個bp的堿基（2）cDNA的獲取分為以下幾個步驟：Ⅰ.小鼠卵透明帶糖蛋白2的mRNA的提?、?mRNA的逆轉錄為cDNAⅢ.cDNA形成雙鏈進行擴增Ⅰ.小鼠卵透明帶糖蛋白2的mRNA的提取

&Ⅱ.mRNA的逆轉錄為cDNA

利用TRIZOL發(fā)抽提雌性小鼠的卵細胞中的所有RNA得到以下圖示結果：5’m7Gppp---------------------------------AAA3’(抽提的mRNA）5’m7Gppp---------------------------------AAA3’（mRNA）----------------------------------（cDNA）Oilgo（dT）引物特異性設計的引物（只對卵透明帶糖蛋白2mRNA中序列特異性識別）AMV反轉錄酶，緩沖液第一股鏈合成≈45℃，60minⅢ.cDNA形成雙鏈進行擴增

5’m7Gppp---------------------------------AAA3’（mRNA）----------------------------------TTT（cDNA）

----------------------------------AAA3’----------------------------------TTT5’RNaseHDNA-polⅠ緩沖液第二股鏈的合成≈14℃2h雙鏈DNA得到穩(wěn)定的cDNA雙鏈（也就是得到了AK135903.1號cDNA）（3）cDNA的擴增首先我們必須得設計好引物，本次實驗的目的是擴增出133-1941位中的核苷酸鏈。因此在擴增之前必須得先設計primer設計引物的方法：走以下是設計引物的一個過程：設計引物的過程：使用pubmed中查找到AK135903.1的cDNA序列后使用后進入頁面后可以篩選出建議的primer。經過之前講的原則的分析后得到了一對擴增引物（包含了133-1941位點的擴增片段）見下所示Tm:55-65℃GC%：40%-60%cDNA的擴增----------------------------------3’5’-----forwardprimer

Reverseprimer-----3’----------------------------------5’進行PCR擴增進行PCR擴增后，就得到高濃度的cDNA分子了（4）cDNA的后續(xù)處理獲得高濃度的cDNA分子之后，由于末端擴增出的片段與表達載體并不匹配，因此為了更好的進行表達載體的構建，因此我們還需要對獲得懂得cDNA進行后續(xù)的處理。以下為擴增后的cDNA分子處理：----------------------------------AAA3’----------------------------------TTT5’----------------------------------AAA3’----------------------------------TTT5’T4DNA連接酶dNTP人工合成接頭修齊末端37℃10min人工接頭2.表達載體的選擇與構建（1）表達載體的選擇我們從題目中知道擴增出來后的基因序列＜10k一般選用質粒作為表達載體。一下是有關表達載體的對比示意圖。（2）表達載體的構建目的基因與表達載體的構建人工合成的基因接頭常常在表達載體上都有特定的限制酶切割位點，用同樣的限制酶對表達載體進行切割后進行拼接。剪接好的cDNA------------------剪接好的質粒在DNA連接酶的作用下連接表達載體構建成功PCR引物的選取原則①引物應用核酸系列保守區(qū)內設計并具有特異性。②產物不能形成二級結構。③引物長度一般在15~30堿基之間。④G+C含量在40%~60%之間。⑤堿基要隨機分布。⑥引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。⑦引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。⑧引物5′端可以修飾。⑨引物3′端不可修飾。⑩引物3′端要避開密碼子的第3位。返回目的基因導入受體細胞植物的遺傳轉化轉基因動物技術植物遺傳轉化的主要方法農桿菌介導的遺傳轉化基因槍法電擊法注射法化學藥劑誘導轉化花粉管通道法轉基因動物

（受精卵原核）顯微注射法迄今較為普遍最有成效（小鼠、綿羊、豬、大鼠、兔、牛、魚...）導入的外源基因片段可長達50kp，且無需載體。難以控制整合率，檢測必須等到子代出生。逆轉錄病毒感染法

(小鼠、家禽)逆轉錄病毒核酸單鏈RNA反轉錄酶↓反轉錄細胞核基因組←雙鏈DNA整合率高100%逆轉錄病毒載體對于多細胞轉化的優(yōu)越性（培育轉基因禽類研究中有廣泛應用，目前制備轉基因禽類最有效和最成功的方法）只能轉移小片段DNA(≤10kb)潛在的致癌性重組→整合胚胎干細胞（Embryonicstemcells）法外源基因直接導入ES細胞→篩選、富集被轉染的細胞→注入受體囊胚腔→移入假孕個體→獲得轉基因動物能在細胞水平進行篩選和確定性別能隨機整合和同源重組整合基因打靶能加入、剔除或替換某個基因（小到一個或幾個核苷酸）目前ES細胞僅在小鼠、雞和人的早期胚胎中分離出來ES細胞的培養(yǎng)條件苛刻、技術要求高,成本大

目的基因的篩選與鑒定制作人---莫思凡

目的：篩選含有目的基因的陽性克隆并加以擴增。首先：篩選出帶有載體的克隆其次：篩選出帶有重組體的克隆最后：篩選出帶有特異DNA序列的克隆方法：遺傳學方法核酸雜交法酶切鑒定PCR技術免疫學方法

遺傳學方法（一）抗藥性標記插入失活篩選法（插入滅活法）

在基因工程中使用的所有載體分子,都至少含有一個選擇標記。載體常有抗生素抗性基因,如氨芐青霉素抗性基因（Ampr）、四環(huán)素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr）。（二）β-半乳糖苷酶顯色反應篩選法（α-互補）

β-半乳糖苷酶基因的顯色反應,將重組體DNA分子的轉化子同非重組的載體轉化子區(qū)別開來.（一）抗藥性標記插入失活篩選法檢測外源DNA插入作用的一種通用方法是插入失活效應。1.以真核表達載體為例（1）真核表達載體應具有的特性

在真核表達載體上有兩個抗生素基因，Ampr基因內有一個PstⅠ限制性核酸內切酶的唯一識別位點，Tetr基因內有BamHⅠ和SalⅠ兩種限制性核酸內切酶單一識別位點。（一）抗藥性標記插入失活篩選法1.以真核表達載體為例（2）篩選重組體的原理

在Ampr和Tetr這兩個基因內的任一插入作用，都會導致Ampr基因或Tetr基因出現功能性失活，于是，所形成的重組質粒都將具有AmpsTetr或Amprtets的表型。

當外源DNA片段插入真核表達載體DNA的BamHⅠ或SalⅠ位點時，抗四環(huán)素基因失活（Tetr

Tets），重組體轉化子必定具有AmprTets表型。因此，將轉化菌先涂布在含有Amp的瓊脂平板上，并將存活的Ampr菌落原位影印到另一個含有Tet的瓊脂平板上，凡是在Amp平板上生長，而不在Tet平板上生長的菌落，就必定是已經插入了外源DNA片段的重組質粒轉化子克隆.如下圖所示同樣,在真核表達載體的Ampr基因序列中,利用PstⅠ限制性核酸內切酶識別位點,插入外源DNA片段,也能應用插入失活作用檢測重組質粒,當然,所挑選的菌落就應該是具有AmpsTetr的表型（一）抗藥性標記插入失活篩選法載體載體載體AmprTetrAmprTetrAmprTets+菌落原位影印Amp瓊脂平板Tet瓊脂平板圖應用抗生素抗性基因插入失活篩選重組體（二）β-半乳糖苷酶顯色反應篩選法1.乳糖操縱子的結構阻遏蛋白β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷透過酶β-半乳糖苷乙?；D移酶mRNAmRNAlacAlacYlacZlacOPZYAlacIPIRNA聚合酶（二）β-半乳糖苷酶顯色反應篩選法2.β-半乳糖苷酶顯色反應篩選法原理

有許多質粒載體具有β-半乳糖苷酶顯色反應的檢測功能.應用這些載體系列，當外源DNA插入到它的lacZ基因上時，可造成β-半乳糖苷酶的失活效應，就可通過大腸桿菌轉化子菌落在添加X-gal-IPTG培養(yǎng)基中的顏色變化鑒別出重組子和非重組子。（二）β-半乳糖苷酶顯色反應篩選法3.舉例

pUC質粒：帶有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多種限制性核酸酶單一識別位點的多克隆位點，但并沒有破壞lacZ的閱讀框架。大腸桿菌菌株：帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。

在各自獨立的情況下，pUC質粒和大腸桿菌編碼的β-半乳糖苷酶片段都沒有活性。（二）β-半乳糖苷酶顯色反應篩選法3.舉例

當質粒轉化大腸桿菌后,可形成具有酶活性的蛋白質,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到pUC質粒的多克隆位點上后，則會導致讀碼框架改變，表達蛋白失活，因此，在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。因此，根據這種β-半乳糖苷酶的顯色反應，可將重組質粒與自身環(huán)化的載體DNA分開。

將噬菌體感染形成的噬菌斑影印在硝酸纖維膜上變性帶有目的基因的放射性DNA或cDNA作探針進行雜交放射性自顯影雜交信號（黑點）對應的噬菌斑即為陽性克隆。核酸分子雜交檢測法（1）菌落印跡原位雜交

菌落印跡原位雜交的優(yōu)點是：適于高密度菌落的篩選,對于噬菌斑平板,它可以連續(xù)影印幾張同樣的硝酸纖維濾膜,獲得數張同樣的DNA印跡。因此，能夠進行重復篩選，效率高，可靠性強，而且可以連續(xù)使用兩種或數種探針篩選同一套重組體DNA，是一種最常規(guī)的檢測手段。(2)核酸分子雜交：

①.Southern雜交分析：由英國Southern（1975）發(fā)明，將瓊脂糖中DNA轉移到尼龍