枇杷葉內(nèi)生菌菌種內(nèi)細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定(終)

枇杷葉內(nèi)生菌菌種內(nèi)細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定［摘要］目的：對3種不同來源的枇杷葉中內(nèi)生菌進(jìn)行培養(yǎng)與鑒定。方法：將枇杷葉削除表皮，研缽研碎后獲得組織提取液，用稀釋法對葉內(nèi)生菌中的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，最后單染色法對細(xì)菌進(jìn)行染色，用顯微觀察法對細(xì)菌進(jìn)行觀察。結(jié)果：培養(yǎng)皿中菌落形態(tài)各自呈現(xiàn)出不同特征。結(jié)論：枇杷葉內(nèi)生菌中不同細(xì)菌的種群、數(shù)量存在顯著差異。［關(guān)鍵字］枇杷內(nèi)生菌多樣性1引言：枇杷：屬薔薇科枇杷屬植物，其花、果、葉和根均可入藥，具有清肺，降氣化痰的功效。果實風(fēng)味甘酸、性涼，具有清肺、潤肺、寧嗽、止咳、合胃、止渴、下氣、止吐逆、主上焦熱和潤五肺之功效。國內(nèi)已開發(fā)出強(qiáng)力枇杷露等多種枇杷制劑，因枇杷具有多種功效，廣泛應(yīng)用于臨床用藥。因此，我們對枇杷內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了培養(yǎng)、菌株分離等初步研究。2實驗部分：2.1材料新鮮翠綠枇杷葉數(shù)片(采自浙江理工大學(xué)下沙校區(qū)百草園4棵不同枇杷樹上)。原植物經(jīng)鑒定為枇杷牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(用于培養(yǎng))、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基+制霉菌素(用于篩選細(xì)菌)。2.2操作方法：2.2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離：用自來水將新鮮植物表面洗凈，于1000ml95%酒精中浸泡3-5min，后無菌水沖洗3-4次，至于超凈臺備用。用研缽將枇杷葉碾碎，加入適量無菌水，后用1ml移液器吸取原液10ml于空帶蓋試管中，標(biāo)號①。用稀釋法分別將原液稀釋成10人-1?10人-5倍于已裝有9ml無菌水試管中配成10ml溶液，分別標(biāo)號②?⑥，獲得梯度樣液，至于超凈臺中備用。在超凈臺中將上述6管樣液用200ul移液器各移取200ul至已倒好的6個平板中，酒精燈旁分別涂布，對應(yīng)編號，標(biāo)記稀釋倍數(shù)、日期、組別，于26^培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3?5天。2.2.2內(nèi)生細(xì)菌的鑒定：對培養(yǎng)皿中分離所得的細(xì)菌分別挑取5個菌斑，采用單染色法分別對菌斑染色，后對染色后的細(xì)菌進(jìn)行顯微形態(tài)特征的觀察、鑒定。2.3操作過程：2.3.1制樣液在超凈臺上，用研缽將早期置于其中的枇杷葉研碎,用無菌水溶解，紗布過濾，得到樣液備用。用1ml移液器從裝有樣液的燒杯中吸取1mL注入已裝有9mL無菌水的試管中，充分混勻,編號②。后用1ml移液器從②號試管中吸取1mL樣液注入另一裝有9mL無菌水的試管中,編號②。以此類推分別制成10人-3?10人-5倍稀釋度的各種樣液，分別編號③?⑥。2.3.2涂布平板法分離微生物⑴倒平板:將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基冷卻至55-60OC時,向其中加入制霉菌素0.6mL(50ug/mL),倒平板.方法:右手持盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，置火焰旁5cm?10cm內(nèi)，左手用手掌邊緣和小指控制培養(yǎng)皿,錐形瓶口在火焰上滅菌,后左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15mL,加蓋后平置于臺面上,待冷凝后即成平板.(2)涂布:將培養(yǎng)基分別用記號筆寫上1?10人-56種稀釋度，后用200ul移液器分別從10人-1,10人-2,10人-3,10人-4,10人-5的稀釋液中取200uL對號放入已寫好稀釋度的平板中,后再吸取原液0.2ml于編號1倍的培養(yǎng)基中。用無菌玻璃涂布棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻.⑶培養(yǎng):將牛肉膏蛋白胨平板于26OC培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3~5日.2.3.3觀察:幾天后進(jìn)行觀察記錄，并將分離所得的細(xì)菌用單染色法染色后鏡檢.細(xì)菌的單染色法：1、 涂片：取兩塊干凈的載玻片，各滴一小滴生理鹽水于載玻片中央，用無菌操作分別挑取培養(yǎng)所得細(xì)菌于載玻片的生理鹽水中涂抹，使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜(每一種菌制一片)2、 干燥：于室溫中自然干燥。3、 固定：涂片面向上，于火焰上通過2—3次，使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)菌的形態(tài)，并使其不易脫落。4、 染色：水平放置玻片，滴加染色液于涂片薄膜上，番紅染色液染色1—2分鐘。5、 水洗：傾去染液，自來水沖洗。用吸水紙吸取多余水分，自然干燥。2.4 結(jié)果觀察：2.4.13天后：5個培養(yǎng)基中，編號10A-1培養(yǎng)基中長有單菌落，菌落呈現(xiàn)出小，黃色,濕潤,圓形，隆起,不透明，邊緣整齊等特點，而其余培養(yǎng)基均無菌生成；1星期后：5個培養(yǎng)基中，編號10八-1培養(yǎng)基中長有單菌落，呈現(xiàn)出大，黃色，濕潤，圓形，隆起,不透明，邊緣整齊等特點，而其余培養(yǎng)基均無菌生成；2星期后：5個培養(yǎng)基中，編號10人-1,10人-2培養(yǎng)基中長有單菌落。10人-1培養(yǎng)基中長有許多單菌落，其中的單菌落呈現(xiàn)出單個分散，小而均勻，個別微大，顏色有黃色和白色，濕潤，部分菌落有隆起,邊緣整齊且不透明等特點；10人-2培養(yǎng)基中長有許多單菌落，其中的菌落呈現(xiàn)出單個分散，小而均勻，顏色為粉色，濕潤，扁平，半透明，邊緣整齊，有個別邊緣不整齊等特點。而其余3個培養(yǎng)基仍沒有菌生成.對染色后細(xì)菌鏡檢觀察后，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌均呈現(xiàn)出不同特點，細(xì)菌種群、數(shù)量存在顯著差異。結(jié)果觀察與討論:結(jié)果觀察:

3天后5個培養(yǎng)基中，除10、倍稀釋度的培養(yǎng)基中長有菌落外，其余培養(yǎng)基均沒有菌生成。10”-1倍稀釋度培養(yǎng)基:只生成一個菌落很小，黃色，濕潤，圓形，隆起，不透明，邊緣整齊。1星期后5個培養(yǎng)基中，除10”-1倍稀釋度的培養(yǎng)基中長有菌落外,其余培養(yǎng)基均沒有菌生成。10”-1倍稀釋度培養(yǎng)基:只生成一個菌落大，黃色，濕潤，圓形，隆起，不透明，邊緣整齊。2星期后5個培養(yǎng)基中，10”-1,10”-2倍稀釋度的培養(yǎng)基中長有菌落，其余3個培養(yǎng)基仍沒有菌生成。

10=倍稀釋度培養(yǎng)基:長有很多菌落單個分散，小而均勻，個別微大，顏色有黃色和白色，濕潤，部分菌落有隆起，邊緣整齊且不透明。10、倍培養(yǎng)基:長有很多菌落單個分散，小而均勻，顏色為粉色，濕潤，扁平，半透明，邊緣整齊,有個別邊緣不整齊。菌落編號辨別要點菌落描述辨別結(jié)果濕十表面邊緣隆起形狀顏色水溶性色素透明度厚薄大小松密大小正面反面1薄梢大扁平整齊\粉色淡粉半透細(xì)菌2薄梢大扁平整齊\粉色淡粉半透細(xì)菌3薄小扁平整齊\粉色淡粉半透細(xì)菌4薄大扁平整齊\粉色淡粉半透細(xì)菌5薄大扁平整齊\粉色淡粉半透細(xì)菌6薄稍小扁平整齊\粉色淡粉半透細(xì)菌7薄大扁平整齊\白色黃色半透細(xì)菌8厚很大^起整齊圓黃色黃色不透細(xì)菌9薄梢大扁平整齊橢圓白色黃色不透細(xì)菌10薄（半濕潤）大扁平整齊圓白色黃色不透細(xì)菌總結(jié)與展望:蒸汽滅菌后應(yīng)迅速進(jìn)行倒平板操作，目的是為了防止培養(yǎng)基凝固。涂布分離應(yīng)在培養(yǎng)基完全凝固后進(jìn)行，不可過早，否則操作時容易將培養(yǎng)基弄破分裝時培養(yǎng)基液不能超過錐形瓶的1/2，目的是為了防止高溫蒸汽滅菌時溢出本次實驗最終只有稀釋倍數(shù)為10人-1的培養(yǎng)基上生長有菌落，分析其原因可能有以下幾點：實驗操作時，枇杷葉在酒精中浸泡時間太長，大部分菌被殺死在配置